Method Article

Классификация состояния активации нейральных стволовых клеток in vitro с помощью аутофлуоресценции

DOI:

10.3791/63110

⸱

April 12th, 2024

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, University of Wisconsin-Madison, 2Morgridge Institute for Research, 3Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе описываются стратегии идентификации и обогащения состояния клеток в первичных культурах нейральных стволовых клеток взрослой мыши с помощью автофлуоресцентной визуализации с использованием: i) конфокального микроскопа, ii) сортировщика флуоресцентных активированных клеток для выполнения визуализации интенсивности или iii) многофотонного микроскопа для выполнения флуоресцентной визуализации в течение жизни.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейральные стволовые клетки (НСК) делятся и производят новорожденные нейроны в мозге взрослого человека в процессе, называемом взрослой нейрогенезом. Взрослые НСК в основном находятся в состоянии покоя, это обратимое состояние клетки, при котором они вышли из клеточного цикла (G0), но остаются чувствительными к окружающей среде. На первом этапе взрослого нейрогенеза спокойные НСК (кНСК) получают сигнал и активируются, выходя из покоя и возвращаясь в клеточный цикл. Таким образом, понимание регуляторов покоя и выхода из НСК имеет решающее значение для будущих стратегий, нацеленных на нейрогенез взрослых. Тем не менее, наше понимание покоя NSC ограничено техническими ограничениями в идентификации неактивных NSC (qNSCs) и активированных NSC (aNSCs). В этом протоколе описывается новый подход к идентификации и обогащению кНСК и аНСК, полученных в культурах in vitro , путем визуализации автофлуоресценции НСК. Во-первых, в этом протоколе описывается, как использовать конфокальный микроскоп для идентификации автофлуоресцентных маркеров qNSCs и aNSCs для классификации состояния активации NSC с использованием интенсивности автофлуоресценции. Во-вторых, этот протокол описывает, как использовать сортировщик флуоресцентных активированных клеток (FACS) для классификации состояния активации NSC и обогащения образцов на qNSCs или aNSCs с использованием интенсивности автофлуоресценции. В-третьих, этот протокол описывает, как использовать многофотонный микроскоп для выполнения визуализации времени жизни флуоресценции (FLIM) с разрешением одной клетки, классификации состояния активации NSC и отслеживания динамики выхода в состоянии покоя с использованием как интенсивности автофлуоресценции, так и времени жизни флуоресценции. Таким образом, этот протокол предоставляет набор инструментов для изучения покоя NSC и выхода из него с разрешением живых клеток, без меток, с разрешением одной клетки.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

НСК создают новорожденные нейроны на протяжении всей жизни у многих организмов в процессе, называемом взрослым нейрогенезом 1,2. Чтобы произвести новорожденные нейроны, qNSC сначала должен активироваться, войдя в клеточный цикл для расширения популяции и производства нейронных предшественников 3,4,5,6. Несмотря на то, что о состоянии покоя НБК известно многое, наша способность в полной мере идентифицировать движущие силы и регуляторы режима покоя НБК ограничена техническими ограничениями, которые существуют для выделения и идентификации qNSC и их перехода к активации. Ранее автофлуоресцентная визуализация была успешной в изучении изменений состояния клеток во многих различных типах клеток, таких как микроглия и Т-клетки, за счет метаболического ремоделирования, которое влияет на оптические свойства аутофлуоресцентных метаболических кофакторов, таких как никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NAD(P)H) и флавинадениндинуклеотид (FAD)7,8. НСК существенно перестраивают свои метаболические сети по мере того, как они находятся в состоянии покоя на выходе 9,10,11,12,13,14. Таким образом, чтобы воспользоваться этими различиями, автофлуоресценция НСК недавно была использована для идентификации и обогащения состояния активации НСК путем обнаружения сдвигов в автофлуоресценции, связанных с метаболическим ремоделированием, которое происходит, когда НСК выходят из покоя15. Визуализационная автофлуоресценция имеет ряд технических преимуществ: i) она не требует добавления экзогенных меток, которые могут повлиять на поведение клеток; ii) он может предоставлять данные с высоким разрешением по одной ячейке о состоянии активации NSC; и iii) он не требует разрушения клетки 7,16. В этом протоколе изложены три стратегии использования автофлуоресценции НСК для изучения состояния НСК в состоянии покоя и активированных клеток15.

Недавно было обнаружено, что НСК, выделенные у 6-недельных самцов мышей из субгранулярной зоны гиппокампа, культивированные и обратимо помещенные в состояние покоя in vitro 10,13,17,18,19,20,21, демонстрируют повышенный уровень точечной автофлуоресценции (PAF), которая возбуждает в диапазоне 400-600 нм и излучает в диапазоне 500-700 нм. Этот сигнал был специфичен для кНСК по сравнению с активированными, циклирующимися НСК15. Возможность визуально разделить эти две популяции без использования дополнительных маркеров антител или репортеров полезна для многих экспериментальных вопросов о природе кНСК и выходе из покоя. Таким образом, во-первых, этот протокол описывает стратегии визуализации PAF в qNSC с помощью конфокального микроскопа, который может быть использован для определения состояния активации NSC. Во-вторых, этот протокол описывает стратегии обнаружения PAF с использованием флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS), а также подробно описывает, как сортировать на основе этого сигнала для обогащения qNSCs или aNSCs. Эти стратегии обеспечивают одну из мер, которую можно использовать для кластеризации и разделения НСК на основе состояния клеток.

Для разработки метода разделения НСК с более высоким разрешением не только в различных состояниях, но и при переходе от выхода из покоя к полной активации, флуоресцентная визуализация времени жизни (FLIM) была выполнена с использованием многофотонного микроскопа для получения изображения автофлуоресценции NAD(P)H (называемого каналом 1) и зеленой автофлуоресценции (называемого каналом 2; который обнаруживает как автофлуоресценцию FAD, так и PAF в qNSC) вместе с их интенсивностью. Этот подход основан на том факте, что оптические свойства молекул в клетке зависят от их физических свойств16,22. Например, NAD(P) (NAD и NADP оптически неразличимы, и поэтому NAD(P) используется для обозначения обоих веществ) не является автофлуоресцентным в окисленном состоянии, но является автофлуоресцентным в восстановленном состоянии (NAD(P)H)23. Кроме того, дополнительные физические свойства автофлуоресцентных молекул, такие как их связывание с ферментами, могут быть экстраполированы путем выполнения флуоресцентной визуализации в течение жизни 7,22,24. Например, NAD(P)H имеет более короткое время жизни флуоресценции, когда не связывается с ферментом22. Поскольку автофлуоресцентные молекулы, такие как NAD(P)H, участвующие в сотнях метаболических реакций, по-разному используются клетками, проходящими через различные состояния или поведение клеток, эти сдвиги могут быть обнаружены и количественно оценены с помощью многофотонного микроскопа, определяющего время жизни автофлуоресценции23. Вместе с обилием или интенсивностью автофлуоресценции, эти измерения предоставляют многомерную информацию для разделения НСК на одно или другое состояние клетки, а также через динамические переходы между состояниями. В-третьих, этот протокол описывает выполнение, анализ и интерпретацию измерений FLIM и интенсивности сигналов канала 1 (NAD(P)H) и канала 2 (PAF) с помощью многофотонного микроскопа. Таким образом, этот протокол описывает набор инструментов для изучения покоя NSC с живыми клетками, не требующий меток, который предоставляет данные о состоянии NSC с высоким разрешением для отдельных клеток.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры в этом протоколе одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Университете Висконсин-Мэдисон.

1. Использование конфокального микроскопа для визуализации PAF в qNSC и aNSC для определения клеточного состояния NSC

  1. Получение кНСК и аНСК in vitro из первичных культур НСК.
    1. Культура НСК, выделенных из мозга взрослых мышей в пролиферативной среде для экспансии (Таблица 1)18,20,21. Таким образом, по умолчанию культуры НСК in vitro являются аНСК.
    2. Для создания qNSC используйте следующий протокол для нанесения aNSC на стеклянную посуду с покрытием, а затем обрабатывайте их средой qNSC, чтобы вызвать затишье в течение 3 дней.
    3. Приготовьте стеклянную посуду с показателем преломления, подходящим для масляных иммерсионных объективов, для приклеивания NSC, предварительно покрыв ее раствором поли-L-орнитина (PLO; 10 мг/мл в воде для пластика, 50 мг/мл в воде для стекла), достаточным для покрытия дна чашки (для кюветы размером 1 см2 используйте ~150 мкл) в течение 1 ч при 37 °C в ddH2O.
    4. Удалите раствор PLO и 3 раза промойте фосфатно-солевой буфером (PBS).
    5. Смажьте раствором ламинина (5 мг/мл) в количестве, достаточном для того, чтобы покрыть дно чашки (для кюветы размером 1 см2 дюйма используйте ~150 мкл) в PBS и инкубируйте минимум в течение 3 ч при 37 °C или в течение ночи.
    6. Удалите раствор ламинина, затем добавьте питательную среду, достаточную для покрытия дна посуды (для кюветы для визуализации диаметром 1 см2 используйте ~150 мкл).
    7. Подготовьте клетки к трипсинизации путем центрифугирования аНСК (они могут начинаться в виде монослоев или нейросфер) при 120 x g в течение 4 минут при комнатной температуре (RT, ~25 °C).
    8. Трипсинизируйте гранулированные aNSCs с предыдущего этапа в 100 мкл смеси трипсина в течение 5 мин при 37 °C, а затем гасите трипсинизацию 200 мкл смеси ингибиторов трипсина (табл. 1).
    9. Дайте НСК постоять 2 минуты, затем механически растирайте их, пипетируя вверх и вниз 10 раз.
    10. Добавьте 5 мл среды aNSC и вращайте клетки при 120 x g в течение 4 минут.
    11. Ресуспендируйте НСК в 1 мл среды аНСК и нанесите на клетки 10%-20% слияние в среде аНСК. Например, поместите ~5000 клеток в одну лунку кюветной лунки размером 1 см2 с 150 мкл среды.
    12. После того как в течение 24 часов aNSC прилипнут к поверхности чашки, удалите среду aNSC и замените ее средой qNSC, достаточной для покрытия дна чашки (для кюветы размером 1 см2 используйте ~150 μл; Таблица 1 - как описано ранее(10,13,17,18) в скважинах, в которых будет вызвано затишье.
    13. Меняйте среду aNSC и qNSC не реже одного раза в 2 дня. После 3 дней пребывания в среде qNSC НСК находятся в состоянии покоя и могут использоваться для экспериментов по визуализации.
  2. Используйте конфокальный микроскоп для визуализации живых кНСК и аНСК in vitro.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый микроскоп имеет свое собственное программное обеспечение; Таким образом, следуйте этим шагам, выполнив аналогичные действия для настройки конкретного микроскопа. Этот протокол будет содержать инструкции по работе в NIS-Elements.
    1. Настройте конфокальный микроскоп для автофлуоресцентной визуализации.
      1. Нажмите кнопку 405 Laser (405 Laser) и введите текст в окне излучения в меню 405 Laser (405 Laser). Нажмите TD для сбора изображения проходящего света и установите значение HV для визуализации образца.
      2. Установите мощность лазера на 3,5% и усиление на 75. Установите Масштаб (Zoom) на 2. Задайте параметры конфокального сканирования, установите для параметра «Пиксельное нажатие» значение 0,5 и установите для параметра «Разрешение» значение 2048 x 2048 пикселей.
    2. Сфокусируйте ячейки под объективом с масляным погружением ~60x, используя светлое поле для фокусировки.
    3. Переключитесь в режим конфокального сканирования, щелкнув Eye Port, убедившись, что путь света теперь идет к головке сканирования и что в пути света нет куба фильтра.
    4. PAF обогащен qNSC и широко возбудим и эмитируем (см. рис. 1). Выберите оптимальную оптическую конфигурацию исходя из возможностей системы, используя в качестве ориентира рисунок 1 . Для получения самого сильного и чистого сигнала возбуждайте лазером в диапазоне ~400-500 нм, собирайте ~580-620 нм и используйте объектив с масляным погружением ~60x.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Автофлуоресцентная визуализация требует более высокой мощности лазера для возбуждения, чем требуется для обычных экспериментов по визуализации. При визуализации других автофлуоресцентных молекул или других меток вместе с PAF тщательно спроектируйте оптическую конфигурацию, чтобы избежать просачивания в автофлуоресцентные каналы.
    5. Получение изображений аутофлуоресценции в кНСК и аНСК. Нажмите «Сканировать», затем сфокусируйтесь на изображении, а затем нажмите «Захват». Для получения наилучших изображений соберите изображения в одной плоскости с цитоплазмой клеток (на основе диффузной автофлуоресценции, диффузно распределенной по всей клетке) в фокусе, чтобы получить репрезентативное поперечное сечение каждой клетки.
    6. Используйте идентичную оптическую конфигурацию (например, одинаковую мощность лазера) и образцы изображений в один и тот же день, если вы хотите напрямую сравнить разные изображения.
    7. Точные мощности лазера и детектора будут зависеть от каждой конкретной системы. Начните с использования низкой мощности лазера, а затем медленно увеличивайте мощность до тех пор, пока сигнал не станет обнаруживаемым без насыщения.
  3. Анализируйте PAF в реальном времени qNSCs и aNSCs in vitro.
    1. После получения автофлуоресцентных изображений в qNSC или aNSC количественно оцените изображения, открыв файл в ImageJ25.
    2. Используйте опцию Обработка > Фильтры > Размытие по Гауссу (Sigma: 2) на изображении автофлуоресценции qNSC/aNSC для сглаживания неравномерных пикселей.
    3. Используйте Image > Adjust > Threshold , чтобы выбрать пиксели, представляющие PAF (удалить фоновые пиксели), и нажмите Apply. Используйте одни и те же пороговые параметры для всех изображений, которые будут сравниваться напрямую.
    4. Используйте инструмент Процесс > Двоичный > Водораздел, чтобы разделить PAF в непосредственной пространственной близости.
    5. С помощью компьютерной мыши нарисуйте область интереса (ROI) вокруг клетки, которая определяется либо по яркому изображению, либо по диффузной автофлуоресценции, равномерно присутствующей по всей цитоплазме клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, можно исключить тонкие периферические процессы и включить ядро, поскольку автофлуоресценция обычно отсутствует в этих местах и, таким образом, не нарушает анализ.
    6. Используйте Analyze > Analyze Particles (размер: 0,1-infinity μm; Круговость: 0-1) с проверкой суммирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ImageJ затем создаст окно вывода с данными о частицах в интересующей области, что позволяет свести в таблицу количество PAF в каждой ячейке. Другие флуоресцентные молекулы могут быть сопряжены с визуализационным PAF. Однако, поскольку PAF является относительно тусклым сигналом, важно убедиться, что другие флуорофоры не проникают в канал PAF. Как правило, флуорофоры, поглощающие 600+ нм и излучающие 650+ нм, могут быть сопряжены с PAF для визуализации, такими как LipidSpot 610.

2. Использование FACS для обогащения состояния активации НСК в культивируемых НСК на основе автофлуоресценции

  1. Создайте qNSC и aNSCs, как описано в разделе 1.
  2. Отсортируйте смесь живых кНСК и аНСК на основе автофлуоресценции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве примера в этом протоколе будет обсуждаться, как обогатить aNSCs или qNSCs в образце, полученном путем смешивания qNSCs и aNSCs в соотношении 1:1.
    1. Перед трипсинизацией и сортировкой клеток помечают клетки, проходящие через S-фазу, добавляя 10 μM 5-этинил-2'-дезоксиуридина (EdU; аналог тимидина, который встраивается в клетки, синтезирующие ДНК, например, в S-фазе клеточного цикла) в среду для культивирования клеток в течение 1 ч.
    2. Трипсинизируйте qNSCs и aNSCs, как описано в шагах 1.1.8, ресуспендируйте в 0,5 мл буфера FACS (Таблица 1) и затем поместите на лед.
      ПРИМЕЧАНИЕ: qNSC прочно прилипают к блюду. При относительно более высокой конфлюенции qNSC могут механически диссоциироваться от чашки. Однако, если кНСК находятся на относительно более низком уровне слияния или их трудно удалить из чашки механически с помощью пипетирования, используйте трипсин для их удаления из чашки.
      1. Удалите питательную среду из кНСК и добавьте 0,25% трипсина, достаточного для покрытия дна чашки (для кюветы размером 1см2 используйте ~150 мкл), инкубируя в течение 3 мин при 37 °C.
      2. После инкубации погасите реакцию трипсина, добавив среду, соответствующую каждому типу клеток, равному объему добавленного трипсина. Механически диссоциируйте клетки из чашки перед сбором и центрифугированием.
    3. Используя сопло ~130 мкм, проанализируйте qNSCs и aNSCs с помощью проточного цитометра или FACS с оптическими условиями в зависимости от возможностей прибора и определите PAF, как показано на рисунке 1. Например, используйте лазер с длиной волны 405 нм для возбуждения образца и используйте фильтр с длиной волны 580-620 нм для обнаружения.
    4. Соберите не менее 10 000 синглетных qNSC и aNSC в файле данных, а затем используйте их для проектирования вентилей для сбора обогащения qNSC или aNSCs. Например, установите вентили для сбора верхних 25% или нижних 25% NSC на основе интенсивности автофлуоресценции в смешанной выборке aNSC:qNSC (1:1).
    5. После установки затворов для сортировки синглетов с более яркой или более тусклой автофлуоресценцией, как описано выше, отсортируйте ячейки в лунки с покрытием PLO, ламинином, заполненные средой aNSC (10 000 клеток/см2, см. шаг 1.1.3).
    6. После FACS дайте NSC постоять в инкубаторе в течение 3 часов. Зафиксируйте клетки, обработав их 4% параформальдегидом, достаточным для покрытия дна чашки (для кюветы с визуализацией диаметром 1 см2 используйте ~150 мкл) в течение 15 минут в режиме РТ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы визуализировать EdU в клетках, проще всего приобрести коммерческий набор для обнаружения EdU и следовать протоколу, рекомендованному производителем.
    7. Во-первых, проникните клетки путем обработки 0,25% тритоном в PBS в течение 15 мин в режиме ЛТ.
    8. Затем обработайте клетки раствором для окрашивания EdU в режиме ЛТ в течение 30 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точный состав окрашивающего раствора EdU будет варьироваться в зависимости от источника реагентов, но в основном состоит из реакционного буфера, реакционной буферной добавки, сульфата меди и молекулы, модифицированной алкином или азидом. Рекомендуемый комплект см. в Таблице материалов .
    9. После окрашивания для визуализации EdU промойте образцы 3 раза в течение 10 минут с помощью PBS.

3. Использование многофотонного микроскопа для обнаружения автофлуоресценции канала 1 и канала 2 и выполнения FLIM на НСК in vitro для идентификации популяций и переходов между клеточными состояниями НСК

ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый микроскоп имеет свое собственное программное обеспечение; Таким образом, следуйте этим шагам, выполнив аналогичные действия для настройки конкретного микроскопа. Этот протокол предоставит инструкции по работе в Prairie View.

  1. Создайте qNSC и aNSCs, как описано в разделе 1.
  2. Настройте многофотонный микроскоп для визуализации в течение всего срока службы флуоресценции.
    1. Используйте объектив с увеличением 40x или больше (~1,15 NA).
    2. Используйте многофотонный микроскоп со следующими или эквивалентными компонентами: перестраиваемым сверхбыстрым лазером, дихроичным дихроем длиной 720 нм, фотоумножителем (ФЭУ) на основе фосфида галлия (GaAsP), коррелированной по времени электроникой для подсчета однофотонных средств и аналоговым измерителем мощности.
    3. Для получения изображения Канала 1 установите настраиваемый лазер на 750 нм и используйте куб эмиссионного фильтра 440/80 нм. Для получения изображения на канале 2 установите лазер на 890 нм и используйте эмиссионный фильтр 550/100 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выключите освещение в комнате перед включением ФЭУ.
  3. Функция отклика прибора
    1. Захватите функцию отклика прибора (IRF) путем визуализации измельченного кристалла мочевины, чтобы учесть временную реакцию прибора при измеренном распаде.
      ПРИМЕЧАНИЕ: IRF свернут с затуханием для точного расчета кривой подгонки затухания. Для регистрации лазер настроен на 890 нм, а эмиссионный фильтр используется куб фильтра 440/80 нм. GaAsP PMT устанавливается на коэффициент усиления 800, а мощность лазера изначально устанавливается на очень низком уровне, обычно 1.
    2. Выберите поле зрения с кристаллической мочевиной и немного увеличьте количество оспин (максимум до 15).
    3. Затем получите изображение с использованием тех же параметров, которые используются для визуализации клеток: дискриминатор с постоянной долей (CFD) 1 x 104 - 1 x 105, разрешение 256 x 256, время задержки 4,8 мкс, оптический зум 1,5x и время интегрирования 60 с.
  4. Выполнение флуоресцентной визуализации в течение всего срока службы и визуализации интенсивности для автофлуоресценции канала 1 и канала 2 на живых кНСК и аНСК in vitro
    1. Поиск поля зрения для изображения: Используйте окуляры, чтобы найти подходящее поле зрения и изменить траекторию света к образцу на микроскопе, чтобы обеспечить визуализацию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сначала будет получено изображение канала 1, а затем изображение канала 2 с тем же полем зрения.
    2. Настройка для сбора изображения канала 1: Нажмите на вкладку Power /Gain и установите усиление на PMT на 800, нажмите на вкладку 2-P Laser и выберите 750 нм для лазера, и убедитесь, что используется правильный куб фильтра (440/80 нм).
    3. Соберите изображение с канала 1.
      1. Запустите режим предварительного просмотра , перейдя на вкладку Power /Gain и установив Pockels на 30, затем перейдя в раздел «Сканирование » на этом экране и нажав Live Scan.
      2. Увеличьте Pockels , чтобы найти хорошее поле зрения при низкой мощности лазера (ниже 3,6 мВт). Как только поле зрения будет найдено, отрегулируйте Pockels так, чтобы измеритель мощности показывал ~3,6 мВт мощности после ячейки Pockel, а дискриминатор постоянной дроби (CFD) на вкладке Count Rates измерял 1 x 104 - 1 x 105.
    4. Перейдите в раздел «Сканирование » и нажмите «Одиночное сканирование », как только эти параметры будут выполнены. При этом будет получено изображение канала 1 в течение 60 секунд.
    5. Чтобы собрать изображение Channel 2, нажмите на вкладку 2-P Laser и выберите 890 нм для лазера, поменяйте местами куб фильтра на куб излучения Channel 2 (550/100 нм).
    6. Запустите режим предварительного просмотра, как описано в 3.4.3, увеличивайте Pockels до тех пор, пока измеритель мощности не покажет ~7 мВт, и количество CFD снова составит 1 x 104 -1 x 105.
    7. Перейдите в раздел «Сканирование » и нажмите « Одиночное сканирование », как только эти параметры будут выполнены. При этом будет получено изображение канала 2 в течение 60 секунд.
    8. Получение дополнительных изображений - После получения изображения канала 1 и канала 2 найдите новое поле зрения и повторите шаги 3.4.2 - 3.4.4. Как правило, сбора 4-6 полей зрения для получения изображения ~50-100 клеток достаточно для одного условия в эксперименте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: mCherry можно использовать в качестве дополнительной флуоресцентной метки без просвечивания в каналы Channel 1 и Channel 2.
  5. Проанализируйте флуоресцентные изображения в течение всего срока службы.
    1. Сгенерируйте матрицы распада для изображений времени жизни флуоресценции в SPCImage, следуя шагам 3.5.2-3.1.14.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения дополнительной информации обратитесь к обновленным справочникам, которые находятся в свободном доступе в Интернете26.
    2. Откройте SPCImage и откройте образ IRF FLIM, собранный в разделе 3.3.
    3. Настройте вертикальные черные полосы на гистограмме так, чтобы они были ограничены кривой затухания IRF. В верхней строке меню нажмите на IRF > Копировать в буфер обмена.
    4. Откройте файл изображения FLIM в пределах набора данных для анализа, полученного в разделе 3.4.
    5. В верхней строке меню нажмите на IRF > Вставить из буфера обмена.
    6. В правом нижнем углу программного обеспечения установите для параметра Компоненты значение 2.
    7. В верхней строке меню программы нажмите « Параметры» > «Модель». Затем выберите MLE для параметров Метод аппроксимации, Пространственное биннинг по квадрату, Порог для пика, а в разделе Настройки выберите Мультиэкспоненциальное затухание.
    8. В левом нижнем углу программы увеличьте Bin до тех пор, пока количество фотонов не станет не менее 100 в репрезентативных цитоплазматических пикселях на пике количества фотонов сразу после возбуждения.
    9. В левом нижнем углу программы установите Порог. Для канала 1 используйте пороговое значение "50". Для канала 2 используйте пороговое значение «0».
    10. В верхней строке меню программного обеспечения (этот протокол описывает, как работать с версией 8.3) нажмите «Рассчитать > матрицу распада».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что значения Chi2 равны ~0.8-1.2 по всему изображению. Это подтверждает, что данные будут надежными благодаря валидации биэкспоненциального моделирования распада.
    11. В верхней строке меню нажмите «Файл» > «Сохранить».
    12. В верхней строке меню программы нажмите «Файл > Экспорт» и экспортируйте следующее:
      Цветовая кодировка, T1, T2, Chi2, интенсивность пикселей, A1[%], A2[%] и цветовая кодировка изображения (с легендой)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь SPCImage настроен на выполнение пакетного процесса, анализируя все изображения данного канала (анализируйте изображения Channel 1 FLIM вместе, а затем повторите, начиная с шага 3.5.2 для изображений Channel 2 FLIM).
    13. Чтобы выполнить пакетный процесс, нажмите « Рассчитать > пакетной обработке » и выберите изображения FLIM для обработки.
    14. В верхней строке меню нажмите « Файл» > «Экспорт» > «Пакетный экспорт » и выберите матрицы распада для экспорта (созданные на предыдущем шаге).
    15. Используйте CellProfiler для создания цитоплазматических масок, следуя шагам 3.5.16-3.5.24.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого ядра будут вручную располагаться вокруг изображений интенсивности канала 1, где ядро имеет черный цвет и хорошо видно. Затем конвейер CellProfiler manual_segmentation.cpproj27 (Дополнительный файл 1) автоматически создаст целую клетку и цитоплазматическую маску в соответствии с указаниями ядерной маски. В качестве альтернативы ядра могут быть помечены с помощью mCherry и визуализированы вместе с автофлуоресценцией канала 1 и канала 2, чтобы обеспечить возможность автоматической идентификации ядер. Однако многие обычные ядерные красители будут спектрально проникать в автофлуоресцентные каналы и, таким образом, несовместимы с этим методом.
    16. В R Studio используйте R_ASCtoTIFF.rmd27 (дополнительный файл 2) для преобразования файлов X_photons.asc , где X — это имя полученного изображения из набора изображений канала 1 в файлы TIF.
    17. Откройте Профилировщик ячеек и откройте manual_segmentation.cpproj.
    18. Загрузите фотонные TIF Channel 1, созданные на шаге 3.5.16, на шаге Images в верхней части конвейера.
    19. На нижних 3 шагах конвейера под названием SaveImages задайте путь сохранения для масок, которые будет генерировать CellProfiler.
    20. Нажмите « Начать тестовый режим » в левом нижнем углу CellProfiler.
    21. Нажмите « Выполнить » в левом нижнем углу CellProfiler. Когда CellProfiler перейдет к шагу IdentifyObjectsManually , появится окно, отображающее текущее обрабатываемое изображение канала 1.
    22. Нажмите клавишу F на клавиатуре, а затем вручную нарисуйте след ядра одной клетки, удерживая левую кнопку мыши. После обводки ядер отпустите левую кнопку мыши на мышке. Повторите этот шаг для всех ячеек на изображении.
    23. Нажмите « Готово » в правом нижнем углу всплывающего окна с изображением интенсивности. Теперь программное обеспечение завершит разработку и экспортирует цитоплазматические, ядерные и тотальные клеточные маски.
    24. В левом нижнем углу нажмите « Следующий набор изображений » и повторите шаги 3.5.21-3.5.23 для всех изображений TIF канала 1.
    25. Используйте скрипт R (Integrate decay matrices and cytoplasmic masks.rmd) для интеграции матриц распада, сгенерированных на шагах 3.5.2-3.5.14, и цитоплазматических масок, сгенерированных на шагах 3.5.15-3.5.24, для получения средних переменных визуализации времени жизни флуоресценции для цитоплазмы каждой клетки, выполнив шаги 3.5.26-3.5.30
    26. Используя электронную таблицу (например, Microsoft Excel), создайте документ .csv под названием test_key27 [Дополнительный файл 3] для примера) с 3 столбцами.
    27. Озаглавьте столбцы так: «Папка», «NADH» и «FAD». Заполните таблицу, чтобы перечислить расположение папки в папке, а затем префикс названия изображения в NADH и FAD соответственно, чтобы связать каждое изображение канала 1 с каждым изображением канала 2 (см. пример данных - Таблица 2).
  6. В R Studio откройте раздел Интеграция матриц распада и цитоплазматических масок.rmd27(Дополнительный файл 4).
    1. Задайте следующие пути к файлам, как указано в скрипте: Установите рабочий каталог, расположение файла канала 1, расположение файла FAD, Маскируйте расположение файла, а также расположение и имя выходного файла.
    2. Запустите весь скрипт. После успешного завершения работы скрипта будет сгенерирован выходной файл, включающий метаданные и средние переменные FLIM.
    3. Выполните анализ с помощью автофлуоресцентного FLIM data.rmd27 (Дополнительный файл 5) или с помощью любого другого программного обеспечения для анализа.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Конфокальная автофлуоресцентная визуализация для разделения состояния клеток НСК (Рисунок 1)
Для использования конфокальной микроскопии для определения состояния активации НСК кНСК и аНСК генерировали in vitro с использованием либо активационной среды, либо спокойной среды, как описано ранее 10,13,17,18. Для обнаружения ПАФ в НСК живые кНСК и аНСК визуализировали с использованием одной и той же экспозиции на конфокальном микроскопе (Пример: 405 нм, Em: 580-620 нм). кНСК демонстрировали большее количество ПАФ по сравнению с аНСК (рис. 1A, B). Это открытие иллюстрирует, как свойства автофлуоресценции могут быть использованы в качестве маркеров для идентификации клеточного состояния кНСК и аНСК.

FACS-обогащение клеточного состояния НСК с помощью автофлуоресценции (рис. 2)
Для обогащения состояния клеточного цикла с использованием FACS qNSCs и aNSCs генерировали in vitro 10,13,17,18,19, как описано в этом протоколе, и предварительно мечили EdU в течение 1 ч перед трипсинизацией и анализом в проточном цитометре для мечения клеток, прогрессирующих через S-фазу. qNSCs и aNSCs затем анализировали с помощью проточной цитометрии либо отдельно, либо смешивали в соотношении 1 qNSC:1 aNSC (рис. 2


figure-results-1

figure-results-2

figure-results-3

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает метод с использованием живых клеток, не имеющих меток, неразрушающих, с одноклеточным разрешением, который позволяет классифицировать состояние клеток НСК in vitro с помощью визуализации автофлуоресцентных сигналов в НСК. Этот подход обнаруживает метаболические сдвиги, происходящие во время выхода из покоя НСК, которые влияют на оптические свойства метаболических кофакторов, таких как NAD(P)H, и предлагает множество преимуществ по сравнению с существующими технологиями для изучения покоя НСК. Например, многие традиционные методы изучения qNSCs и aNSCs, такие как мечение маркерами клеточного цикла, такими как EdU, требуют фиксации образцов. Существующие в настоящее время методы, способные изучать живые НСК, еще больше ограничены тем, что требуют введения экзогенных меток, как правило, путем генерации трансгенов, кодирующих флуоресцентные белки. Эти инструменты ограничены как в ресурсах, необходимых для их создания, так и во многих технических оговорках. Например, промежуточные филаментные белки нестин и глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) обычно используются в качестве маркеров кНСК и аНСК 12,13,18,28,29. Тем не менее, известно, что нестин и GFAP дифференциально экспрессируются между кНСК и аНСК 12,13,18,28,29. Кроме того, автофлуоресцентная визуализация позволяет получить данные об отдельных клетках с высоким разрешением, которые могут выявить гетерогенность отдельных клеток, которая теряется или затрудняется для интерпретации в экспериментах, завершающихся объемным анализом популяции клеток.

Тем не менее, автофлуоресцентная визуализация также имеет несколько ограничений. Многие аутофлуоресцентные сигналы теряются при фиксации клеток. Таким образом, автофлуоресцентная визуализация в значительной степени ограничена изучением живых клеток. Автофлуоресцентная визуализация также основана на недостатке экзогенно введенных флуорофоров, которые могут проникать в автофлуоресцентные каналы. Несмотря на то, что многие флуорофоры могут быть совместимы с автофлуоресцентной визуализацией в определенных ситуациях, сочетание автофлуоресцентной визуализации со многими существующими инструментами не всегда возможно. Визуализация живых клеток также может вызывать фототоксичность. Одна итерация визуализации с использованием этого протокола не вызывает достаточной фототоксичности для снижения жизнеспособности NSC. Тем не менее, повторная визуализация клеток в течение определенного времени с более частыми интервалами много раз в день может привести к значительной фототоксичности и, таким образом, не является жизнеспособной стратегией для изучения покоя НСК. Наконец, хотя автофлуоресцентная визуализация может быть использована для изучения НСК у 6-недельных самцов мышей из гиппокампа или боковых желудочков, неясно, насколько широко этот метод может быть использован для изучения НСК из других источников, возрастов или других типов стволовых клеток.

Описанный здесь протокол также предполагает точное получение кНСК и аНСК in vitro с использованием ранее установленных протоколов 10,13,17,18,19. Если воспроизведение результатов этого протокола является сложной задачей, убедитесь, что кНСК и аНСК правильно генерируются путем зондирования на наличие или отсутствие различных маркеров кНСК и аНСК, как описано ранее 10,13,17,18,19. В совокупности автофлуоресцентная визуализация обеспечивает новый технический подход к идентификации кНСК и аНСК и изучению выходов из покоя НСК.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим ядро проточной цитометрии UW-Madison (P30 CA014520 и 1S10RR025483-01), а также членов лаборатории Мура и сообщества UW-Madison за их вклад. Мы благодарим наши источники финансирования: NIH T32 T32GM008688 (для C.S.M.), Diana Jacobs Kalman Fellowship от AFAR (для C.S.M.), Wisconsin Graduate Fellowship (для C.S.M.), DP2 NIH New Innovator Award (1DP2OD025783, для D.L.M.), Vallee Scholar Award (для D.L.M.), NIH 1R56NS130450 (для D.L.M и M.C.S.), R01 CA185747 (M.C.S.), R01 CA205101 (M.C.S.), R01 CA211082 (M.C.S.) и грант Национального научного фонда No. CBET-1642287 (в M.C.S.).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
40-кратный водный объективNikonMRD77410Объектив используется в многофотонном микроскопе в части 3
8-луночная кюветаIbidi80826-90Для визуализации aNSCs/qNSCs
Аналоговый измеритель мощностиThorlabsPM100AИспользуется в многофотонном микроскопе в части 3
Антибиотик-антимикотик (100X) (PSF)Thermo Fisher15240062Антибиотик для сред NSC
B-27Invitrogen17504044Питательная добавка для NSC среды
BMP4Fisher Scientific5020BP010Фактор для индукции покоя
бычьего сывороточного альбуминаSigmaA4919-25GДля создания BMP4
Chameleon сверхбыстрый лазерКогерентныйN/Aлазер, используемый в многофотонном микроскопе в части 3
Конфокальный микроскопМикроскоп NikonC2использован для Части 1
DMEM/F-12 (без GlutaMAX)Invitrogen11320033Базовая среда для НСК
ДНКазаSigmaD5025-15KUДобавлен в ингибитор трипсина
Набор для анализа EdUInvitrogenC10337Анализ пролиферации для клеточной культуры
EGFPeproTechAF-100-15-500UGФактор роста для сред НСК
FGFPeproTech100-18BФактор роста для сред NSC
Сортировщик флуоресцентных активированных клетокBDFACSAriaФлуоресцентный активированный сортировщик клеток, используемый для части 2
Добавка гепаринSigmaH3149-50KUдля сред NSC
L-15Invitrogen21083027Для приготовления раствора ингибитора трипсина
LamininSigmaL2020-1MGДля покрытия стеклянной посуды
Nikon TiE инвертированный микроскопNikonN/AРамка для микроскопа Используется для Части 3
PLOSigmaP3655-100MGДля покрытия стеклянной посуды
SPC-150 Однофотонная счетная электроникаBecker and HicklN/AИспользуется в многофотонном микроскопе в Части 3
Трипсин (для трипсинизации гранул аНСК, которые росли в виде сфер или монослоев)Gibco15090046Для трипсинизации нейросфер или адгезивных аНСК
Трипсин (для трипсинизирующих кНСК)Gibco25200072Для трипсинизации адгезивных кНСК
Ингибитор трипсинаSigmaT6522-100MGДля ингибирования трипсинизации аНСК Кристаллы
мочевиныSigmaU5128-5GИспользуется для сбора IRF
VerseneThermo Fisher15040066Для приготовления трипсина

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Adult neurogenesis in the hippocampus: From stem cells to behavior. Cell. 167 (4), 897-914 (2016).">Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. Adult neurogenesis in the hippocampus: From stem cells to behavior. Cell. 167 (4), 897-914 (2016).
  2. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. J Neurosci. 16 (6), 2027-2033 (1996).">Kuhn, H. G., Dickinson-Anson, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. J Neurosci. 16 (6), 2027-2033 (1996).
  3. Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).">Silva-Vargas, V., Maldonado-Soto, A. R., Mizrak, D., Codega, P., Doetsch, F. Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).
  4. Quiescence of adult mammalian neural stem cells: A highly regulated rest. Neuron. 104 (5), 834-848 (2019).">Urban, N., Blomfield, I. M., Guillemot, F. Quiescence of adult mammalian neural stem cells: A highly regulated rest. Neuron. 104 (5), 834-848 (2019).
  5. Return to quiescence of mouse neural stem cells by degradation of a proactivation protein. Science. 353 (6296), 292-295 (2016).">Urban, N., et al. Return to quiescence of mouse neural stem cells by degradation of a proactivation protein. Science. 353 (6296), 292-295 (2016).
  6. Quiescence modulates stem cell maintenance and regenerative capacity in the aging brain. Cell. 176 (6), 1407-1419 (2019).">Kalamakis, G., et al. Quiescence modulates stem cell maintenance and regenerative capacity in the aging brain. Cell. 176 (6), 1407-1419 (2019).
  7. Classification of T-cell activation via autofluorescence lifetime imaging. Nat Biomed Eng. 5 (1), 77-88 (2021).">Walsh, A. J., et al. Classification of T-cell activation via autofluorescence lifetime imaging. Nat Biomed Eng. 5 (1), 77-88 (2021).
  8. Microglia activation visualization via fluorescence lifetime imaging microscopy of intrinsically fluorescent metabolic cofactors. Neurophotonics. 7 (3), 035003(2020).">Sagar, M. A. K., et al. Microglia activation visualization via fluorescence lifetime imaging microscopy of intrinsically fluorescent metabolic cofactors. Neurophotonics. 7 (3), 035003(2020).
  9. Metabolic control of adult neural stem cell activity by Fasn-dependent lipogenesis. Nature. 493 (7431), 226-230 (2013).">Knobloch, M., et al. Metabolic control of adult neural stem cell activity by Fasn-dependent lipogenesis. Nature. 493 (7431), 226-230 (2013).
  10. A fatty acid oxidation-dependent metabolic shift regulates adult neural stem cell activity. Cell Rep. 20 (9), 2144-2155 (2017).">Knobloch, M., et al. A fatty acid oxidation-dependent metabolic shift regulates adult neural stem cell activity. Cell Rep. 20 (9), 2144-2155 (2017).
  11. SPOT14-positive neural stem/progenitor cells in the hippocampus respond dynamically to neurogenic regulators. Stem Cell Reports. 3 (5), 735-742 (2014).">Knobloch, M., et al. SPOT14-positive neural stem/progenitor cells in the hippocampus respond dynamically to neurogenic regulators. Stem Cell Reports. 3 (5), 735-742 (2014).
  12. Single-cell RNA-Seq with waterfall reveals molecular cascades underlying adult neurogenesis. Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).">Shin, J., et al. Single-cell RNA-Seq with waterfall reveals molecular cascades underlying adult neurogenesis. Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).
  13. Lysosome activation clears aggregates and enhances quiescent neural stem cell activation during aging. Science. 359 (6381), 1277-1283 (2018).">Leeman, D. S., et al. Lysosome activation clears aggregates and enhances quiescent neural stem cell activation during aging. Science. 359 (6381), 1277-1283 (2018).
  14. Mitochondrial metabolism-mediated regulation of adult neurogenesis. Brain Plast. 3 (1), 73-87 (2017).">Beckervordersandforth, R. Mitochondrial metabolism-mediated regulation of adult neurogenesis. Brain Plast. 3 (1), 73-87 (2017).
  15. Autofluorescence is a biomarker of neural stem cell activation state. Cell Stem Cell. , (2024).">Morrow, C. S., et al. Autofluorescence is a biomarker of neural stem cell activation state. Cell Stem Cell. , (2024).
  16. Evaluating cell metabolism through autofluorescence imaging of NAD(P)H and FAD. Antioxid Redox Signal. 30 (6), 875-889 (2019).">Kolenc, O. I., Quinn, K. P. Evaluating cell metabolism through autofluorescence imaging of NAD(P)H and FAD. Antioxid Redox Signal. 30 (6), 875-889 (2019).
  17. Signaling through BMPR-IA regulates quiescence and long-term activity of neural stem cells in the adult hippocampus. Cell Stem Cell. 7 (1), 78-89 (2010).">Mira, H., et al. Signaling through BMPR-IA regulates quiescence and long-term activity of neural stem cells in the adult hippocampus. Cell Stem Cell. 7 (1), 78-89 (2010).
  18. Vimentin coordinates protein turnover at the aggresome during neural stem cell quiescence exit. Cell Stem Cell. 26 (4), 558-568 (2020).">Morrow, C. S., et al. Vimentin coordinates protein turnover at the aggresome during neural stem cell quiescence exit. Cell Stem Cell. 26 (4), 558-568 (2020).
  19. Epigenomic enhancer annotation reveals a key role for NFIX in neural stem cell quiescence. Genes Dev. 27 (16), 1769-1786 (2013).">Martynoga, B., et al. Epigenomic enhancer annotation reveals a key role for NFIX in neural stem cell quiescence. Genes Dev. 27 (16), 1769-1786 (2013).
  20. Isolation of adult mouse hippocampal neural stem cells for fluorescence loss in photobleaching assays. STAR Protoc. 2 (3), 100695(2021).">Bin Imtiaz, M. K., Jessberger, S. Isolation of adult mouse hippocampal neural stem cells for fluorescence loss in photobleaching assays. STAR Protoc. 2 (3), 100695(2021).
  21. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nat Protoc. 7 (11), 2005-2012 (2012).">Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nat Protoc. 7 (11), 2005-2012 (2012).
  22. Fluorescence lifetime imaging of free and protein-bound NADH. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (4), 1271-1275 (1992).">Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Johnson, M. L. Fluorescence lifetime imaging of free and protein-bound NADH. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (4), 1271-1275 (1992).
  23. Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence. Free Radic Biol Med. 100, 53-65 (2016).">Blacker, T. S., Duchen, M. R. Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence. Free Radic Biol Med. 100, 53-65 (2016).
  24. Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications. J Biomed Opt. 25 (7), 1-43 (2020).">Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications. J Biomed Opt. 25 (7), 1-43 (2020).
  25. https://imagej.nih.gov/ij/ (2021).">ImageJ. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2021).
  26. https://imagej.nih.gov/ij/ (2024).">Becker & Hichl Handbooks. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2024).
  27. https://github.com/chrismorrow5/Neural-Stem-Cell-Autofluorescence-Analysis/ (2024).">GitHub Materials. , Available from: https://github.com/chrismorrow5/Neural-Stem-Cell-Autofluorescence-Analysis/ (2024).
  28. Prospective identification and purification of quiescent adult neural stem cells from their in vivo niche. Neuron. 82 (3), 545-559 (2014).">Codega, P., et al. Prospective identification and purification of quiescent adult neural stem cells from their in vivo niche. Neuron. 82 (3), 545-559 (2014).
  29. Single-cell transcriptomics reveals a population of dormant neural stem cells that become activated upon brain injury. Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).">Llorens-Bobadilla, E., et al. Single-cell transcriptomics reveals a population of dormant neural stem cells that become activated upon brain injury. Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Neural Stem CellsNSC ActivationAdult NeurogenesisNSC QuiescenceAutofluorescence ImagingConfocal MicroscopyFlow CytometryFluorescence Lifetime ImagingCell State ClassificationLive Cell Analysis

Related Articles