В данной статье описан хорошо зарекомендовавший себя и воспроизводимый анализ лектиновых пятен для всего препарата сетчатки и протоколы, необходимые для количественного измерения сосудистых параметров, часто изменяющихся при пролиферативных и непролиферативных ретинопатиях.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Количественная оценка сосудистых параметров у целых сетчаток мышей с непролиферативными и пролиферативными ретинопатиями
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Ретинопатии представляют собой гетерогенную группу заболеваний, которые поражают нейросенсорную ткань глаза. Для них характерны нейродегенерация, глиоз и прогрессирующее изменение сосудистой функции и структуры. Хотя начало ретинопатий характеризуется тонкими нарушениями зрительного восприятия, модификации в сосудистом сплетении являются первыми признаками, обнаруженными клиницистами. Отсутствие или наличие неоваскуляризации определяет, классифицируется ли ретинопатия как непролиферативная (NPDR) или пролиферативная (PDR). В этом смысле несколько животных моделей пытались имитировать специфические сосудистые особенности каждой стадии, чтобы определить основные механизмы, участвующие в изменениях эндотелия, гибели нейронов и других событиях, происходящих в сетчатке. В этой статье мы предоставим полное описание процедур, необходимых для измерения сосудистых параметров сетчатки у взрослых и мышей с ранними родами на послеродовой день (P)17. Мы подробно расскажем о протоколах проведения окрашивания сосудов сетчатки изолектином GSA-IB4 в целых креплениях для последующей микроскопической визуализации. Также предусмотрены ключевые этапы обработки изображений с помощью программного обеспечения Image J Fiji, поэтому считыватели смогут измерять плотность сосудов, диаметр и извилистость сосудов, ветвление сосудов, а также аваскулярные и неоваскулярные области. Эти инструменты очень полезны для оценки и количественной оценки сосудистых изменений как при непролиферативных, так и при пролиферативных ретинопатиях.
Введение
Глаза питаются двумя артерио-венозными системами: сосудисто-сосудистой, внешней сосудистой сетью, орошающей пигментированный эпителий сетчатки и фоторецепторы; и сосудисто-нервно-ретинальные сосуды, которые орошают слой ганглиозных клеток и внутренний ядерный слой сетчатки1. Сосудистая система сетчатки представляет собой организованную сеть сосудов, которые доставляют питательные вещества и кислород к клеткам сетчатки и собирают отходы для обеспечения надлежащей визуальной сигнальной трансдукции. Эта сосудистая система имеет некоторые отличительные особенности, в том числе: отсутствие автономной иннервации, регуляция сосудистого тонуса внутренн....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
С мышами C57BL/6J обращались в соответствии с руководящими принципами ArVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. Экспериментальные процедуры были разработаны и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (CICUAL) факультета химических наук Национального университета Кордовы (Res. HCD 1216/18).
1. Приготовление буферных растворов и реагентов
- Приготовление 1x фосфатного буферного физиологического раствора (PBS): Добавьте 8 г хлорида натрия (NaCl), 0,2 г хлорида калия (KCl), 14,4 г дигидрата динатрия-водород-фосфата (Na2HPO4 2H....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Как описано в разделе протокола, из одного флуоресцентного окрашивания можно получить морфологию сосудов и количественно оценить несколько интересующих параметров. Поиск конкретного изменения будет зависеть от типа изучаемой ретинопатии. В этой статье аваскулярные и неоваскулярные области, извилистость и дилатация были оценены в мышиной модели пролиферативной ретинопатии, тогда как ветвление и плотность сосудов были проанализированы в мышиной модели MetS, которая индуцирует непролиферативную ретинопатию.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Животные модели ретинопатий являются мощными инструментами для изучения развития сосудов, ремоделирования или патологического ангиогенеза. Успех этих исследований в этой области зависит от легкого доступа к тканям, что позволяет выполнять широкий спектр методов, предоставляя данные от in vivo и посмертных мышей26,27. Кроме того, была обнаружена большая корреляция между исследованиями in vivo и клиническим анализом, обеспечивающая надежн.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.
Благодарности
Мы благодарим Карлоса Маса, Марию Пилар Креспо и Сесилию Сампедро из CEMINCO (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, Кордова, Аргентина) за помощь в конфокальной микроскопии, Соледад Миро и Викторию Бланко за специализированный уход за животными и Лауру Гатику за гистологическую помощь. Мы также благодарим Виктора Диаса (просекретаря по институциональной коммуникации FCQ) за производство и издание видео и Пола Хобсона за его критическое чтение и языковой пересмотр рукописи.
Эта статья финансировалась за счет грантов Секретариата по вопросам науки и технологии, Национального университета Кордовы (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Алюминиевая фольга | |||
| Бычья сыворотка Альбумин Merck | A4503 | качество | |
| Дигидрат хлорида кальция | Merck | C3306 | |
| Соляная кислота | Biopack | 9632.08 | |
| Конфокальный микроскоп FV1200 | Olympus | FV1200 | с моторизованной пластиной |
| Крышки | Paul Marienfeld GmnH & Со. | 111520 | |
| Микроскоп препарирующий | NIKON | SMZ645 | |
| Дигидрат натрия-водород-фосфата | Merck | 119753 | |
| 200 &γ; Л туба | Merck | Z316121 | |
| Фильтровальная бумага | Merck | WHA5201090 | |
| Шейкер инкубатора GyroMini | LabNet International | S0500 | |
| Изолектин GS-IB4 От Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | I21411 | |
| Поли(виниловый спирт) (Mowiol 4-88) | Merck | 475904 | |
| Параформальдегид | 158127 | ||
| pHметр | SANXIN | PHS-3D-03 | |
| Хлорид калия | Merck | P9541 | |
| Калий-дигидрофосфат | Merck | 1,04,873 | |
| Слайды | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Хлорид натрия | Merck | S3014 | |
| Натрий гидроксид | Merck | S5881 | |
| Tris | Merck | GE17-1321-01 | |
| Triton X-100 | Merck | X100-1GA | |
| Программное обеспечение для анализа сосудов | Фиджи Mai Elfarnawany | https://imagej.net/Vessel_Analysis |
Ссылки
- Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).
- McDougal, D. H., Gamlin, P. D.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
