Измерение динамики протрузии клеточного края во время распространения с помощью микроскопии живых клеток

Миграция клеток является критическим процессом, который контролирует развитие и функционирование всех живых организмов. Миграция клеток происходит как в физиологических состояниях, таких как эмбриогенез, заживление ран и иммунный ответ, так и в патологических состояниях, таких как метастазирование рака и аутоиммунные заболевания. Несмотря на различия в типах клеток, которые принимают участие в различных миграционных событиях, все события подвижности клеток имеют сходные молекулярные механизмы, которые были сохранены в эволюции от простейших до млекопитающих и включают общие механизмы контроля цитоскелета, которые могут ощущать окружающую среду, реагировать на сигналы и модулировать поведение клеток в ^ответ1.

Начальной стадией миграции клеток может быть образование высокодинамичных выступов на переднем крае клетки. За ламелиподиумом можно найти пластинку, которая соединяет актин с миозином II-опосредованной сократимостью и опосредует адгезию к нижележащему субстрату. Ламеллиподии индуцируются внеклеточными стимулами, такими как факторы роста, цитокины и рецепторы клеточной адгезии, и управляются полимеризацией актина, которая обеспечивает физическую силу, которая толкает плазматическую мембрану ^{вперед2,3}. Многие сигнальные и структурные белки были вовлечены в это; среди них Rho GTPases, которые действуют согласованно с другими сигналами для активации актин-регулирующих белков, таких как комплекс Arp 2/3, белки семейства WASP и члены семейств Formin и Spire в lamellipodia2,4,5.

В дополнение к полимеризации актина, активность миозина II необходима для генерации сократительных сил в ламелиподиуме и передней пластинке. Эти сокращения, также определяемые как втягивания края клетки, также могут быть результатом деполимеризации дендритного актина на периферии клетки и имеют решающее значение для развития ламелиподиального переднего края и позволяют выступу ощущать гибкость внеклеточного матрикса и других клеток и определять направление миграции6,7,8 . Протрузии края клеток, которые не могут прикрепиться к субстрату, образуют периферические мембранные оборки, листообразные структуры, которые появляются на вентральной поверхности ламеллиподий и ламелей и движутся назад относительно направления миграции. Поскольку ламеллиподиум не прикрепляется к субстрату, под ним образуется задний ламеллиподиум, который механически толкает первый ламеллиподий к верхней вентральной поверхности. Актиновые нити в оборке, которые раньше были параллельны субстрату, теперь становятся перпендикулярными ей, и оборка теперь расположена над наступающим ламелиподием. Оборка, которая движется назад, падает обратно в цитозоль и представляет собой клеточный механизм рециркуляции ламеллиподиального ^{актина9,10}.

Здесь мы опишем анализ для измерения динамики протрузии края клетки. Протрузионный анализ использует покадровую видеомикроскопию для измерения динамики протрузии с одним краем клетки в течение 10 минут во время фазы распространения клетки. Динамика протрузии анализируется путем генерации кимографов из этих фильмов. В принципе, кимограф передает подробные количественные данные движущихся частиц на пространственно-временном участке, чтобы дать качественное понимание динамики кромок клеток. Интенсивность движущейся частицы отображается для всех стеков изображений на графике времени и пространства, где ось X и ось Y представляют время и расстояние ^{соответственно11}. Этот метод использует ручной анализ кимографа с ImageJ для получения подробных количественных данных, что позволяет извлекать информацию из фильмов и изображений в случае низкого отношения сигнал-шум и / или высокой плотности признаков, а также анализ изображений, полученных в фазово-контрастной световой микроскопии или плохого качества изображения.

Описанный в настоящем описании анализ динамики протрузии клеточного края является быстрым, простым и экономически эффективным методом. Таким образом, и поскольку было показано, что он напрямую коррелирует с миграцией ^{клеток11,12}, он может быть использован в качестве предварительного метода для тестирования динамики цитоскелета, участвующего в подвижности клеток, прежде чем принять решение о выполнении более ресурсоемких методов. Кроме того, он также позволяет количественно измерить, как генетические манипуляции (нокаут, нокдаун или спасательные конструкции) цитоскелетных белков влияют на динамику цитоскелета с использованием простой платформы. Анализ является поучительной моделью для изучения динамики цитоскелета в контексте миграции клеток и может быть использован для выяснения механизмов и молекул, лежащих в основе подвижности клеток.

Все методы, описанные в этом протоколе, были одобрены институциональным Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Бар-Илан.

ПРИМЕЧАНИЕ: Пошаговое графическое изображение процедуры, описанной в этом разделе, показано на рисунке 1.

1. Клеточная культура

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки, используемые в протоколе, представляют собой эмбриональные фибробласты мышей (MEF), которые были получены из эмбрионов E11.5-13.5 мышей дикого типа C57BL/6. Первичные MEF были сгенерированы в соответствии с лабораторным протоколом ^Jacks13. Клетки из пяти разных эмбрионов были объединены вместе и увековечены инфекцией ретровирусным вектором, экспрессирующим большой Т-антиген SV40 с последующим отбором с 4 мМ Гистидинола в течение 3 недель.

1. Культивируйте клетки в тканевых культуральных пластинах, содержащих модифицированную орлиную среду Dulbecco (DMEM), содержащую 1 г / л глюкозы, 1% глутамина, 1% пенициллина-стрептомицина и 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (см. Таблицу материалов), в увлажненном инкубаторе с 5% _CO2 при 37 °C.
2. Культивируют клетки до 90%-95% стечения и расщепляют в соотношении 1:5 каждые 2-3 дня.

2. Покрытие посуды со стеклянным дном

ПРИМЕЧАНИЕ: Покрытие посуды со стеклянным дном должно выполняться в тканевом культуральном вытяжке в стерильных условиях.

1. Добавьте 2 мл раствора 1N HCl в центр тарелки со стеклянным дном (Таблица материалов) и инкубируйте в течение 20 мин при комнатной температуре (RT).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап предназначен для удаления остатков из стекла, которые могут прервать визуализацию позже.
2. Трижды вымойте посуду со стеклянным дном по 2 мл по 1 пБС (таблица материалов).
3. Разбавляют фибронектин (см. Таблицу материалов) до 10 мкг/мл в 1x PBS. Добавьте 200 мкл разбавленного раствора фибронектина в стеклянный центр блюда. Инкубировать при 37 °C (инкубатор тканевых культур) в течение 1 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, блюдо со стеклянным дном может быть инкубировано в течение ночи при 4 °C на плоской поверхности.
4. Во время инкубации фибронектинового покрытия готовят 1% раствор BSA (Таблица материалов) в 1x PBS, фильтруют через 0,2 мкм и денатурируют путем инкубации при 70 °C в течение 30 мин в предварительно нагретой водяной бане.
5. Трижды вымойте посуду со стеклянным дном, покрытую 2 мл по 1 PBS каждая.
6. Добавьте 2 мл денатурированного раствора BSA в стеклянный центр и инкубируйте в течение 1 ч при 37 °C (инкубатор культуры тканей).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, блюдо со стеклянным дном может быть инкубировано в течение ночи при 4 °C на плоской поверхности.
7. Вымойте посуду со стеклянным дном 3 раза по 2 мл по 1 pBS каждый.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация посуды со стеклянным дном с фибронектином должна быть выполнена в течение не менее 1 ч при 37 °C для правильного покрытия поверхности. Более короткое время инкубации может не привести к надлежащему покрытию, и в результате фенотип клетки может быть не связан с активацией интегрина. Слой BSA инертен и не влияет на динамику протрузии и предназначен для блокирования свободных потенциальных участков для интегрин-независимой клеточной адгезии. BSA должен быть денатурирован перед нанесением покрытия, чтобы предотвратить его индуцирование клеточного апоптоза, который может влиять на динамику края клетки.

3. Подготовка клеток к визуализации

1. За шестнадцать-восемнадцать часов до эксперимента накладывают клетки, чтобы достичь 70-80% слияния на следующий день. Для MEF пластина 0,7 х ¹⁰⁶ клеток на 10 см диаметром тканевой культуральной пластины за день до выполнения эксперимента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для успешного эксперимента по протрузии важно, чтобы клетки использовались во время фазы их логарифмического роста. Для этого клетки должны достичь 70%-80% слияния в день эксперимента. Более высокая плотность клеток приведет к более длительному времени распространения и / или препятствию для прикрепления во время эксперимента.
2. В день эксперимента добавляют 2 мл раствора трипсина (Таблица материалов) на пластину тканевой культуры диаметром 10 см и инкубируют в течение 2-3 мин в инкубаторе культуры тканей до отслоения клеток. Инактивировать трипсин, добавляя 5 мл полной среды.
3. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и пластины 20 000 клеток в 2 мл полной среды на стеклянной тарелке, покрытой как указано выше (раздел 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ячеек для покрытия зависит от размера и типа ячеек. Для более крупных или более распространенных клеток пластинчато только 10 000 клеток, чтобы иметь достаточно клеток для визуализации. Важно выбирать отдельные клетки, которые не соприкасаются, поскольку межклеточный контакт может изменить поведение распространения внутри клетки.
4. Инкубировать посуду со стеклянным дном с покрытыми клетками в инкубаторе культуры тканей в течение 15 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе клетки прилипают к фибронектиновому субстрату и распространяются по нему. При измерении протрузий во время распространения клеток клеткам следует дать распространиться в течение 15 мин после покрытия и перед визуализацией. Визуализация может быть выполнена в течение временного окна от 15 мин до ~ 1 ч после нанесения покрытия, и в любом случае, до того, как клетки начнут мигрировать.

4. Настройка и визуализация микроскопа

ПРИМЕЧАНИЕ: Доступны различные системы микроскопии живых клеток. Система, используемая здесь, представляет собой инвертированный микроскоп Leica AF6000, оснащенный _CO2 и нагревательными блоками и прикрепленный к цифровой CMOS-камере ORCA-Flash 4.0 V2.

1. Включите нагревательный блок не менее чем за 1 ч до получения изображения и установите его на 37 °C.
2. Включите блок _CO2 не менее чем за 10 минут до получения изображения и установите его на 5% _CO2.
3. Включите микроскоп, камеру и компьютер.
4. Откройте программное обеспечение для сбора микроскопов (см. Таблицу материалов). Выберите папку для сохранения захваченных изображений и введите имя файла. Сохраните каждый фильм как новый файл.
5. Установите увеличение на 40-кратный сухой объектив, фазоконтрастный. Установите временной интервал на 5 с, общая продолжительность фильма 10 мин.
6. После 15 мин инкубации покрытых клеток поместите стеклянную тарелку с приклеенными клетками в адаптер и зафиксируйте ее. Вставьте адаптер с тарелкой в его прорезь в стадии микроскопа.
7. Снимите крышку тарелки и поместите крышку _CO2 . Откройте клапан _CO2 .
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что крышка _CO2 чистая, прежде чем положить ее поверх стеклянной нижней посуды. Грязная обложка снизит качество фильмов. Протрите нижнюю сторону крышки _CO2 безворсовой салфеткой, пропитанной 70% этанолом, чтобы удалить пыль и грязь. Протрите второй раз сухой безворсовой салфеткой.
8. Просмотрите клетки и найдите подходящую ячейку для визуализации. Убедитесь, что ячейка находится в фокусе, и начните сбор фильма.

5. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ изображений выполняется с помощью ImageJ (Таблица материалов) следующим образом:

1. Откройте полученный фильм в ImageJ.
2. Используя инструмент «Прямой » на главной панели инструментов, сделайте восемь линий по 20 произвольных единиц каждая перпендикулярно выступам, включая ламель и край ячейки, в радиальном расположении каждые 45°, как показано на рисунке 2A.
3. На главной панели инструментов перейдите в раздел Стеки > изображений > Reslice. Это даст изображение кимографа, которое описывает движение отдельных точек внутри клеточной мембраны (рисунок 2B). Это действие должно быть выполнено для каждой строки из восьми строк отдельно.
4. Извлеките и вручную подсчитайте из соответствующих изображений кимографа количество выступов, втягиваний и оборок в каждой из восьми областей ячейки, отмеченных линиями сетки. Эти числа представляют частоту выпячиваний, втягиваний и оборок за 10 мин (рисунок 2C, D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оборки можно отличить от других структур по их темному виду в фазоконтрастной микроскопии и их центростремительному движению, которое начинается у края клетки и заканчивается на границе тела клетки, что можно наблюдать в приобретенных фильмах. Следует отметить, что при количественной оценке частоты протрузии, втягивания и рюшей фильмы следует рассматривать в качестве контроля для количественной оценки и особенно для определения оборок.
5. Определение стойкости, расстояния и скорости протрузии с помощью кимографического анализа. Для каждого из сгенерированных кимографов ось X представляет расстояние, а ось Y представляет время.
6. Чтобы измерить расстояние протрузии, выполните шаги 5.6.1-5.6.2.
   1. Проведите перпендикулярную линию от основания выступа до самой высокой вершины протрузии. Нажмите клавишу M в ImageJ, чтобы измерить длину линии в пикселях.
   2. Чтобы преобразовать длину из пикселей в мкм, убедитесь, что отношение пикселей к мкм известно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отношение мкм к пикселю - это физическая длина пикселя на ПЗС-камере / общее увеличение. Размер пикселя характерен для каждого типа камеры. Например, для камеры, используемой в этом исследовании, размер пикселя составляет 6,5 мкм х 6,5 мкм, физическая длина составляет 6,5 мкм, а увеличение, которое мы использовали, составляет 40x. Таким образом, отношение мкм к пикселю нашей камеры составляет 0,1625 мкм/пиксель. В анализе для линии длиной 30 пикселей расстояние выпячивания составит 30 пикселей x 0,1625 мкм/пиксель = 4,875 мкм (рисунок 3).
7. Чтобы измерить время выпячивания (стойкость; количество времени, которое выступает выступ протрузии перед втягиванием), выполните шаги 5.7.1-5.7.2.
   1. Проведите горизонтальную линию от начала выступа (слева направо) до области самой высокой вершины. Нажмите клавишу M в ImageJ, чтобы измерить длину линии в пикселях.
   2. Чтобы преобразовать длину из пикселей в минуты, вычислите отношение пикселя к мин. Это значение зависит от интервала между изображениями.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом примере интервал между изображениями составляет 5 с, соотношение мин/пиксель составляет 0,0833, а длина горизонтальной линии составляет 8 пикселей. Таким образом, время протрузии составляет 8 пикселей x 0,0833 мин/пиксель = 0,6664 мин.
8. Измерьте и рассчитайте время втягивания аналогично времени протрузии для линии, проведенной горизонтально у основания выступа, откуда пик выступа находится к его основанию справа (линия X2 на рисунке 3).
9. Рассчитайте скорость протрузии, разделив расстояние протрузии на время протрузии. Рассчитайте скорость втягивания, разделив расстояние выпячивания на время втягивания. В этом примере скорость протрузии вычисляется как 4,875 мкм/0,6664 мин = 7,315 мкм/мин., а скорость втягивания идентична, поскольку линия, представляющая время, имеет одинаковую длину.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При сравнении различных типов клеток, т.е. клеток, экспрессирующих дикий тип, и мутантных конструкций одного и того же белка, необходимо провести слепой анализ, чтобы не вводить предвзятость.

В эксперименте, описанном на рисунке 2, увековеченные MEF наносили на посуду со стеклянным дном, предварительно покрытую фибронектином, для активации опосредованной интегрином сигнализации, блокируемой денатурированным BSA, чтобы блокировать свободные потенциальные участки для клеточной адгезии, которая не зависит от активации интегрина. Для достижения логарифмической фазы роста при 70%-80% слиянии клеток в день эксперимента 0,7 х 106 MEF были покрыты тканевой культуральной пластиной диаметром 10 см за 16 ч до эксперимента. В день эксперимента клетки были трипсинизированы и подсчитаны, а 20 000 клеток были покрыты фибронектином / BSA стеклянной посудой. Блюдо инкубировали в течение 15 мин при 37 °C, чтобы обеспечить прикрепление и распространение клеток перед визуализацией. После инкубации пластину помещали в камеру инкубатора микроскопа (37 °C, 5% CO2), и одиночные клетки визуализировали с помощью 40-кратной сухой линзы в фазовом свете. Визуализация проводилась от 15 мин до 1 ч после нанесения покрытия, прежде чем клетки начали мигрировать. Изображения были получены каждые 5 с в течение 10 минут, что дало 121 изображение на ячейку (Дополнительный фильм 1).

Анализ изображений проводился с помощью ImageJ. С помощью инструмента «Прямая» на главной панели инструментов на радиальной сетке в одних и тех же местах через каждые 45 градусов во всех ячейках было сделано 20 произвольных прямых линий длиной до единицы (рисунок 2A). Для создания кимографа мы использовали команды Image > Stack > Reslice, которые дали изображение кимографа, описывающее движение отдельных точек внутри клеточной мембраны (рисунок 2B-D). Количество выступов, втягиваний и оборок, образовавшихся в течение 10 минут фильма в каждой из восьми областей в ячейках, которые отмечены линиями сетки, было извлечено, вручную подсчитано из соответствующих изображений кимографа и нанесено на график в виде частот выпячивания/втягивания/оборки за 10 мин. Средние полученные частоты составляли 5,1/10 мин для выступов и втягиваний и 2,1/10 мин для оборок (рисунок 2E).

Расстояние протрузии, время протрузии, время втягивания, скорости протрузии и втягивания рассчитывались на основе сгенерированных кимографов. В репрезентативном кимографе на рисунке 3 расстояние выпячивания составляло 30 пикселей x 0,1625 мкм/пиксель = 4,875 мкм, время протрузии составляло 8 пикселей x 0,0833 мин/пиксель = 0,6664 мин, время втягивания составляло 8 пикселей x 0,0833 мин/пиксель = 0,6664 мин. Скорости протрузии и втягивания были рассчитаны как 4,875 мкм/0,6664 мин = 7,315 мкм/мин.

При измерении протрузии края клетки важно выбрать клетки, которые находятся в фазе распространения. Пример правильной ячейки для анализа приведен на рисунке 2A и в дополнительном ролике 1. После кимографического анализа в этом эксперименте можно легко различить выступы, втягивания и оборки. Пример фибробласта дикого типа, который не подходит для анализа, показан на рисунке 4. После кимографического анализа в линиях (срезах) 1, 3, 5, 7, например, нельзя различить четкие выступы. В этом случае клетка закончила распространение, но еще не начала двигаться, и поэтому можно наблюдать не так много движений мембраны.

Рисунок 1: Экспериментальные этапы протрузионного анализа. (A) Раствор 1N HCl добавляют в стеклянную посуду со стеклянным дном в течение 20 мин. (B) После промывки в PBS 10 мкг/мл раствора фибронектина добавляют в стеклянную часть чашки и инкубируют в течение 1 ч при 37 °C. (C) Стеклянное дно тарелки блокируют инкубацией в 1% денатурированном BSA в течение 1 ч при 37 °C. (D) Тканевую культуральную пластину из 70%-80% сливочных фибробластов трипсинизируют и подсчитывают (E) 20 000 клеток покрывают в стеклянной чашке и (F) инкубируют в течение 15 минут при 37 °C, чтобы позволить клеткам распространяться. (G) Пластину помещают во влажную камеру микроскопа с температурой 37 °C в 5% CO2, и живая визуализация выполняется с помощью фазово-контрастной световой микроскопии. (H) Клеточные фильмы и изображения подвергаются кимографическому анализу Image J. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Анализ изображений протрузионного анализа. (A) Репрезентативное изображение MEF в ImageJ с указанием восьми поперечных сечений мембраны для количественной оценки в течение 10 мин. Шкала стержня, 20 мкм. (B) Генерация кимографа в изображении J. (C) Репрезентативный кимограф из поперечного сечения, на котором можно различить выступы, втягивания и оборки. (D) Результирующие кимографы после анализа изображения в течение 10 мин на изображении J с помощью команды Reslice . (E) Количественная оценка частот протрузий, втягиваний и оборок за 10 мин из анализируемого фильма и кимографа. Средняя частота протрузии за 10 мин = 5,1, средняя частота втягивания за 10 мин = 5,125, средняя частота оборок за 10 мин = 2,1. Восемь кимографов были проанализированы из одного фильма. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Анализ и количественная оценка стойкости протрузии, расстояния и скорости. В репрезентативном кимографе ось X представляет время в мин (слева направо), а ось Y показывает расстояние в мкм. X1 представляет время протрузии (персистентность), X2 представляет время втягивания, а Y представляет расстояние протрузии. Скорость протрузии рассчитывается путем деления расстояния протрузии (Y) на время протрузии (X1). Скорость втягивания рассчитывается путем деления расстояния протрузии (Y) на время втягивания (X2). В этом примере расстояние протрузии составляло 30 пикселей x 0,1625 мкм/пиксель = 4,875 мкм, время протрузии составляло 8 пикселей x 0,0833 мин/пиксель = 0,6664 мин., время втягивания составляло 8 пикселей x 0,0833 мин/пиксель = 0,6664 мин. Скорость протрузии/втягивания была рассчитана как 4,875 мкм/0,6664 мин. = 7,315 мкм/мин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Пример ячейки, которую следует исключить из анализа. (A) Пример ячейки, которая не подходит для анализа. Шкала бара, 20 мкм. (B) Кимографический анализ этой клетки показывает, особенно при повторном срезе 1,3,5,7, отсутствие четких выступов. В этом случае клетка закончила распространение, но еще не начала двигаться, и поэтому может наблюдаться не так много мембранных выступов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный фильм 1. MEF был нанесен на стеклянную тарелку с фибронектиновым покрытием и визуализировали с помощью покадровой фазоконтрастной видеомикроскопии в течение 10 минут с использованием сухого объектива 40x/1.4 NA. Время указывается в секундах. Шкала, 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.