Биологический препарат и механическая методика определения вязкоупругих свойств зональных волокон

Summary

Протокол описывает метод исследования вязкоупругости внеклеточного матрикса и его зависимости от белкового состава или факторов внешней среды. Целевой матричной системой является зонул мыши. Эффективность метода демонстрируется путем сравнения вязкоупругогого поведения зональных волокон дикого типа с теми, в которых отсутствует микрофибрил-ассоциированный гликопротеин-1.

Abstract

Эластичность имеет важное значение для функции тканей, таких как кровеносные сосуды, мышцы и легкие. Это свойство получено в основном из внеклеточного матрикса (ECM), белковой сетки, которая связывает клетки и ткани вместе. Как упругие свойства сети ECM связаны с ее составом, и играют ли релаксационные свойства ECM физиологическую роль, являются вопросами, которые еще предстоит полностью решить. Часть проблемы заключается в сложной архитектуре большинства ECM-систем и сложности изоляции компонентов ECM без ущерба для их структуры. Одним из исключений является зонула, система ECM, обнаруженная в глазу позвоночных. Зонула содержит волокна длиной от сотен до тысяч микрометров, которые охватывают бесклеточное пространство между линзой и глазной стенкой. В этом отчете мы описываем механический метод, который использует преимущества высокоорганизованной структуры зонулы для количественной оценки ее вязкоупругих свойств и определения вклада отдельных белковых компонентов. Метод включает в себя рассечение фиксированного глаза для обнажения хрусталика и зонулы и использует технику подтягивания, которая растягивает зонулярные волокна одинаково, пока контролируется их натяжение. Метод относительно недорогой, но достаточно чувствительный, чтобы обнаружить изменения в вязкоупругих свойствах зонулярных волокон у мышей, у которых отсутствуют специфические зонулярные белки или при старении. Хотя метод, представленный здесь, предназначен в первую очередь для изучения глазного развития и заболеваний, он также может служить экспериментальной моделью для изучения более широких вопросов, касающихся вязкоупругих свойств упругих ECM и роли внешних факторов, таких как концентрация ионов, температура и взаимодействия с сигнальными молекулами.

Introduction

Глаз позвоночного содержит живую оптическую линзу, которая помогает фокусировать изображения на сетчатке1. Линза подвешена на оптической оси системой тонких, радиально ориентированных волокон, как показано на рисунке 1А. На одном конце волокна прикрепляются к экватору хрусталика, а на другом — к поверхности цилиарного тела. Их длина охватывает расстояния от 150 мкм у мышей до 1 мм у людей. В совокупности эти волокна известны как зонула ^Zinn2, цилиарная зону или просто зонула. Глазная травма, заболевание и некоторые генетические нарушения могут повлиять на целостность зонулярных

Protocol

Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по изучению животных Вашингтонского университета и соответствовали Заявлению ARVO об использовании животных в офтальмологических и зрительных исследованиях.

1. Изготовление специализированных деталей и конструирование аппаратов

1. Изготовление специализированных деталей
   1. Изготовление зонда. Держите стеклянный капилляр под углом, как показано на левой панели рисунка 2A. Поместите пламя от прикуривателя примерно в 2 см от одного конца и держите его там до тех пор, пока конец не согнется на 90°, как показано на правой панели

Results

Описанный здесь метод подтягивания обеспечивает простой подход к определению вязкоупругих свойств зональных волокон у мышей. Короче говоря, глаз мыши сначала сохраняется путем инъекции фиксатора при физиологическом внутриглазном давлении. Этот подход поддерживает естественную инфляцию глаза и поддерживает волокна должным образом предварительно натянутыми (фиксация была признана приемлемой после предварительных экспериментов, которые показали, что она существенно не изменяет эластичность или прочность волокон). Задняя час.......

Discussion

Зонула представляет собой необычную систему ECM, где волокна расположены симметрично и ими можно манипулировать идентично, смещая глазную линзу вдоль оптической оси. Пространство также может быть легко доступно без клеточного разрушения, что позволяет изучать волокна в среде, близкой к их родному состоянию. Метод подтягивания использует эту презентацию ECM для манипулирования тонкими волокнами мышей, генетически поддающейся обработке системой, и точной количественной оценки их механических свойств. Это позволило нам изуч.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4-20 винтов с шестигранной головкой длиной 3/4 дюйма	Thorlabs	SH25S075
1/4-20 гайка	для хозяйственного магазина
3D SLA принтер	Anycubic	Photon
4-40 винтов длиной 3/8 дюйма, 2	для хозяйственного магазина
, наружный диаметр 1,2 мм и 3 дюйма длиной, без нити	WPI	1B120-3
Цианоакрилат (супер) клей	Loctite
Цифровая шкала с точностью до 0,01 г	Верньер	OHAUS Scout 220
Excel	Microsoft		Spreadsheet
Газовый прикуриватель
Микроскоп для осмотра/пресечения	Amscope	Артикул: SM-4NTP	Рабочее расстояние ~ 15 см
Микроманипулятор, Экономичный 4-осевой	WPI	Kite-L
Моторизованный микрометр	Thorlabs	Z812B
Негативная цилиндрическая линза	Thorlabs		LK1431L1-75 мм фокусное расстояние
чашки Петри, 50 мм
Держатель стойки, 3 дюйма	Thorlabs	PH3
Стойка, 4 дюйма	Thorlabs	TR4
Программное обеспечение для регистрации весов	Vernier	LoggePro
Контроллер серводвигателя	Thorlabs	KDC101
Программное обеспечение контроллера серводвигателя	Thorlabs	APT
Щелевое основание, 1	Thorlabs	BA1S
Щелевые основания, 2	Thorlabs	BA2
Подставка для микроманипулятора	WPI	M-10
USB-камера для микроскопа	Amscope	Артикул: MD500
УФ-активированный клей с источником УФ-излучения	Amazon