Методическая статья

Биологический препарат и механическая методика определения вязкоупругих свойств зональных волокон

DOI:

10.3791/63171

⸱

16 декабря 2021 г.

 ,  ,  , 
1Department of Basic Sciences, University of Health Sciences and Pharmacy, 2Department of Ophthalmology & Visual Sciences, Washington University School of Medicine, 3Department of Biomedical Engineering, The Ohio State University, 4Department of Cell Biology & Physiology, Washington University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол описывает метод исследования вязкоупругости внеклеточного матрикса и его зависимости от белкового состава или факторов внешней среды. Целевой матричной системой является зонул мыши. Эффективность метода демонстрируется путем сравнения вязкоупругогого поведения зональных волокон дикого типа с теми, в которых отсутствует микрофибрил-ассоциированный гликопротеин-1.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эластичность имеет важное значение для функции тканей, таких как кровеносные сосуды, мышцы и легкие. Это свойство получено в основном из внеклеточного матрикса (ECM), белковой сетки, которая связывает клетки и ткани вместе. Как упругие свойства сети ECM связаны с ее составом, и играют ли релаксационные свойства ECM физиологическую роль, являются вопросами, которые еще предстоит полностью решить. Часть проблемы заключается в сложной архитектуре большинства ECM-систем и сложности изоляции компонентов ECM без ущерба для их структуры. Одним из исключений является зонула, система ECM, обнаруженная в глазу позвоночных. Зонула содержит волокна длиной от сотен до тысяч микрометров, которые охватывают бесклеточное пространство между линзой и глазной стенкой. В этом отчете мы описываем механический метод, который использует преимущества высокоорганизованной структуры зонулы для количественной оценки ее вязкоупругих свойств и определения вклада отдельных белковых компонентов. Метод включает в себя рассечение фиксированного глаза для обнажения хрусталика и зонулы и использует технику подтягивания, которая растягивает зонулярные волокна одинаково, пока контролируется их натяжение. Метод относительно недорогой, но достаточно чувствительный, чтобы обнаружить изменения в вязкоупругих свойствах зонулярных волокон у мышей, у которых отсутствуют специфические зонулярные белки или при старении. Хотя метод, представленный здесь, предназначен в первую очередь для изучения глазного развития и заболеваний, он также может служить экспериментальной моделью для изучения более широких вопросов, касающихся вязкоупругих свойств упругих ECM и роли внешних факторов, таких как концентрация ионов, температура и взаимодействия с сигнальными молекулами.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Глаз позвоночного содержит живую оптическую линзу, которая помогает фокусировать изображения на сетчатке1. Линза подвешена на оптической оси системой тонких, радиально ориентированных волокон, как показано на рисунке 1А. На одном конце волокна прикрепляются к экватору хрусталика, а на другом — к поверхности цилиарного тела. Их длина охватывает расстояния от 150 мкм у мышей до 1 мм у людей. В совокупности эти волокна известны как зонула Zinn2, цилиарная зону или просто зонула. Глазная травма, заболевание и некоторые генетические нарушения могут повлиять на целостность зонулярных волокон3, что приводит к их возможному отказу и сопутствующей потере зрения. У мышей волокна имеют ядро, состоящее в основном из белка фибриллина-2, окруженного мантией, богатой фибриллином-14. Хотя зональные волокна уникальны для глаза, они имеют много общего с волокнами ECM на основе эластина, обнаруженными в других частях тела. Последние покрыты мантией фибриллина-15 и имеют размеры, аналогичные зональным волокнам6. Другие белки, такие как латентно-трансформирующий фактор роста β-связывающие белки (LTBPs) и микрофибрил-ассоциированный гликопротеин-1 (MAGP-1), встречаются в ассоциации с обоими типами волокон7,8,9,10,11. Модуль упругости зональных волокон находится в диапазоне 0,18-1,50 МПа12,13,14,15,16, что сопоставимо с модулем волокон на основе эластина (0,3-1,2 МПа)17. Эти архитектурные и механические сходства заставляют нас полагать, что любое понимание ролей зонул-ассоциированных белков может помочь прояснить их роль в других эластических волокнах ECM.

Основная цель разработки метода, описанного здесь, заключается в том, чтобы получить представление о роли специфических зонулярных белков в прогрессировании наследственного заболевания глаз. Общий подход заключается в сравнении вязкоупругих свойств зональных волокон у мышей дикого типа с свойствами мышей, несущих целевые мутации в генах, кодирующих зонулярные белки. Хотя ранее для измерения эластомеханических свойств зональных волокон использовалось несколько методов, все они были разработаны для глаз гораздо более крупных животных12,13,14,15,16. Поскольку такие модели генетически не поддаются обработке; мы стремились разработать экспериментальный метод, который лучше подходил бы для маленьких и нежных глаз мышей.

Метод, который мы разработали для оценки вязкоупругости зональных волокон мыши, представляет собой метод, который мы называем анализом подтягивания4,18, который обобщен визуально на рисунке 1. Подробное описание метода подтягивания и анализ результатов приводится ниже. Начнем с описания конструкции аппарата, включая трехмерные (3D)-печатные детали, используемые в проекте. Далее мы подробно описываем протокол, используемый для получения и подготовки глаз к эксперименту. Наконец, мы предоставляем пошаговые инструкции о том, как получить данные для определения вязкоупругих свойств зональных волокон. В разделе «Репрезентативные результаты» мы делимся ранее неопубликованными данными, полученными с помощью нашего метода, о вязкоупругих свойствах зональных волокон у мышей, лишенных MAGP-119, а также контрольным набором, полученным от животных дикого типа, соответствующих возрасту. Наконец, мы завершаем общими замечаниями о преимуществах и ограничениях метода, а также предложениями для потенциальных экспериментов, которые могут прояснить, как экологические и биохимические факторы влияют на вязкоупругие свойства волокон ECM.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по изучению животных Вашингтонского университета и соответствовали Заявлению ARVO об использовании животных в офтальмологических и зрительных исследованиях.

1. Изготовление специализированных деталей и конструирование аппаратов

  1. Изготовление специализированных деталей
    1. Изготовление зонда. Держите стеклянный капилляр под углом, как показано на левой панели рисунка 2A. Поместите пламя от прикуривателя примерно в 2 см от одного конца и держите его там до тех пор, пока конец не согнется на 90°, как показано на правой панели рисунка 2А.
    2. Пример изготовления платформы. Используя программное обеспечение для 3D-рисования, спроектируйте платформу размером 30 x 30 x 5 мм и содержащую полусферические отступы диаметром 2,0, 2,5 и 3,0 мм, как показано на рисунке 2B.
    3. Изготовление держателя зонда. Используя программное обеспечение для 3D-рисования, спроектируйте крепление, удерживающее капиллярный зонд, и прикрепите его к микроманипулятору (см. Рисунок 2C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образец 3D-файла для изготовления платформы и держателя зонда в формате STL доступен по запросу от соответствующего автора.
    4. Отрицательная сборка линзы. Поместите отрицательную цилиндрическую линзу (-75 мм по фокусному расстоянию и примерно 50 мм по высоте и длине), как показано на рисунке 1C и рисунке 1D , чтобы исправить искажение, вызванное добавлением жидкости в чашку Петри (добавление жидкости искажает вид рассеченного глаза при изображении сбоку).
    5. Приклейте негативную линзу к одному из 2-щелевых оснований (см. Рисунок 2D для позиционирования объектива на основании).
    6. Соберите оставшиеся детали, как показано на рисунке 2D.
    7. Отрегулируйте высоту стойки так, чтобы объектив едва нависал над шкалой и затяните винт в держателе.
  2. Конструкция аппарата
    1. Установите на компьютер программу регистрации, поставляемую с весами, программное обеспечение камеры микроскопа и приложение контроллера моторизованного микрометра.
    2. Подключите моторизованный микрометр к контроллеру серводвигателя, а последний к компьютеру. Запустите приложение контроллера двигателя и отредактируйте настройки двигателя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Двигательные настройки, которые перечислены ниже, были выбраны после предварительных экспериментов, которые показали, что напряжения расслабляются на временной шкале 10-20 с. Основываясь на этом определении, мы выбрали скорость и ускорение, которые позволили двигателю выполнить смещение на 50 мкм за время, меньшее, чем время релаксации, но не слишком короткое, чтобы избежать встряхивания образца. Здесь мы выбрали время смещения около 5-10 с.
    3. Установите максимальную скорость 0,01 мм/с, а ускорение 0,005 мм/с2.
    4. Установите камеру в инспекционный микроскоп и протестируйте программное обеспечение для визуализации камеры.
    5. Поместите весы на скамейку, отведенную под аппарат.
    6. Приклейте 3D-печатную платформу (из шага 1.1.2) на чашку Петри и добавьте стеклянную бусину 2-3 мм в одну из скважин. Поместите чашку Петри на весы так, чтобы шарик располагался вблизи центра кастрюли.
    7. Замените ручной микрометр с микроманипулятора на моторизованный.
    8. Вкрутите два винта по 4-40 в держатель зонда. Прикрепите держатель зонда к манипулятору, как показано на рисунке 1С.
    9. Подготовьте зонд, как показано на рисунке 2А, поместите его внутрь держателя зонда изогнутой частью вниз и затяните винты.
    10. Расположите микроманипулятор на столе так, чтобы кончик зонда находился над шариком на платформе. Прикрепите микроманипулятор к столу, чтобы предотвратить случайное движение во время эксперимента.
    11. Расположите боковой микроскоп на столе так, чтобы шарик находился в центре поля его зрения и в фокусе.

2. Подготовка образцов и сбор данных

  1. Фиксация и рассечение глаз
    1. Поддерживайте мышей дикого типа и животных Magp1-null на идентичном фоне C57/BL6J. Усыпляйте 1-месячных или 1-летних мышей путем вдыхания CO2 .
    2. Удалите глаза тонкими щипцами и зафиксируйте энуклеированные глобусы при 4 °C в течение ночи в 4% параформальдегиде /фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS, pH 7,4). Поддерживать положительное давление 15-20 мм рт.ст. в глазу во время процесса фиксации, как описано6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты проводятся на самцах мышей, чтобы контролировать возможные половые различия в размерах глазного шара. Положительное давление гарантирует, что земной шар остается раздутым, сохраняя зазор между хрусталиком и стенкой глаза, охватываемый зональными волокнами.
    3. Промывайте глаза в течение 10 мин в PBS. Используя офтальмологические хирургические ножницы и работая под стереомикроскопом, сделайте разрез полной толщины в стенке глаза возле головки зрительного нерва.
    4. Вытяните разрез вперед к экватору, а затем вокруг экваториальной окружности глаза. Позаботьтесь о том, чтобы сохранить деликатные цилиарные процессы и связанные с ними зональные волокна.
    5. Снимите заднюю часть земного шара, обнажив заднюю поверхность хрусталика.
    6. Используйте щипцы, чтобы удалить рассеченный глаз из буферного раствора и поместить его на сухую салфетку с роговицей вниз. Осторожно перетащите роговицу по поверхности салфетки, чтобы высушить ее.
    7. Добавьте 3 мкл мгновенного клея в колодцы платформы, которые будут вмещать глаз в чашку Петри.
    8. Поместите блюдо на сценическую пластину стереомикроскопа так, чтобы колодец с клеем был в поле зрения.
    9. Перенесите глаз от салфетки к краю лунки, содержащей клей. Затем осторожно перетащите глаз в колодец и быстро отрегулируйте его ориентацию так, чтобы задняя часть объектива была самой верхней.
    10. Высушите открытую сторону хрусталика, аккуратно промокав ее уголком сухой салфетки.
    11. Нанесите мазок мгновенного клея на дно 50-миллиметровой чашки Петри и зацементируйте к ней платформу.
  2. Измерение зонального вязкоупругого отклика
    1. Включите шкалу, запустите программу регистрации масштаба и программное обеспечение камеры. Убедитесь, что программа ведения журнала может получать данные в течение 30 минут, так как некоторые испытания могут длиться так долго.
    2. Включите контроллер серводвигателя и запустите приложение контроллера на компьютере. Убедитесь, что контроллер настроен на перемещение с шагом 50 мкм, используя параметры движения, аналогичные тем, которые описаны в ПРИМЕЧАНИИ на шаге 1.2.2.
    3. Создайте изгиб на 90° в капиллярном стержне, как описано в шаге 1.1.1.
    4. Вставьте изогнутый капилляр в держатель капиллярного зонда и затяните крепежные винты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму обезвоживание образца, мы рекомендуем выполнить шаги 1-4 до или во время рассечения глаз.
    5. Добавьте небольшой (~1 мм) шарик УФ-отверждающего клея к кончику капилляра.
    6. Используя ручные регулировки на манипуляторе, переместите наконечник капиллярного зонда так, чтобы он находился непосредственно над центром линзы. Проверьте, кажется ли нижняя часть УФ-клея центрированной над верхней частью объектива при взгляде спереди (визуальным осмотром) и сбоку (через камеру микроскопа).
    7. Глядя через камеру, опустите наконечник зонда до тех пор, пока ультрафиолетовый клей не вступит в контакт с объективом и не покроет от одной трети до половины его верхней поверхности.
    8. Используйте низкоинтенсивный (~ 1 мВт), направленный, почти видимый УФ-источник света (380-400 нм) для отверждения клея.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этих спецификаций достаточно, чтобы вылечить клей за несколько секунд, сводя к минимуму возможность индуцирования сшивки белка. Источники ультрафиолетового света, поставляемые с коммерческими УФ-клеевыми ручками, соответствуют этим спецификациям.
    9. Добавьте раствор PBS в блюдо до тех пор, пока глаз не будет покрыт жидкостью на глубину не менее 2 мм.
    10. Поместите цилиндрическую линзу перед смотровым микроскопом и как можно ближе к чашке Петри, не прикасаясь к ней.
    11. Одновременно запустите программу ведения журнала и программу таймера. Сделайте снимок глаза/зонда с помощью камеры.
    12. Через 60 с инициируют еще одно смещение на 50 мкм, а затем каждые 60 с до завершения эксперимента, т. е. до тех пор, пока все волокна не будут разорваны. Обратите внимание, что сигнал не вернется к исходным уровням из-за буферного испарения во время эксперимента. Исправьте последующий дрейф показаний во время анализа данных, как показано на этапе 2.2.14.
    13. По завершении выполнения сохраните данные журналирования масштаба и экспортируйте их в формат, совместимый с электронной таблицей, например, формат .csv. Сохраните снимки объектива, которые были собраны во время пробега.
    14. Импорт данных в электронную таблицу. Используйте первое и последнее показание шкалы для интерполяции дрейфа в фоновом чтении с течением времени из-за испарения (см. Рисунок 3). Вычтите интерполированное чтение из показаний в каждой точке времени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании электронной таблицы интерполяцию можно выполнить автоматически, введя формулу = B2 - $B$2 + ($B$2 - @INDIRECT("B"&COUNTA(B:B)))/(COUNTA(B:B)-2) * A2 в ячейку справа от первого чтения шкалы, затем переместив курсор в правый-нижний угол ячейки и перетащив его вниз к последнему значению данных. Формула предполагает, что данные организованы в столбец с первой точкой данных, появляющейся в ячейке B2. При желании данные, обработанные на этапе 2.2.14, могут быть проанализированы с помощью квазиупругой вязкоупругой модели, разработанной одним из соавторов, доктором Мэтью Райли4.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанный здесь метод подтягивания обеспечивает простой подход к определению вязкоупругих свойств зональных волокон у мышей. Короче говоря, глаз мыши сначала сохраняется путем инъекции фиксатора при физиологическом внутриглазном давлении. Этот подход поддерживает естественную инфляцию глаза и поддерживает волокна должным образом предварительно натянутыми (фиксация была признана приемлемой после предварительных экспериментов, которые показали, что она существенно не изменяет эластичность или прочность волокон). Задняя час...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Зонула представляет собой необычную систему ECM, где волокна расположены симметрично и ими можно манипулировать идентично, смещая глазную линзу вдоль оптической оси. Пространство также может быть легко доступно без клеточного разрушения, что позволяет изучать волокна в среде, близкой к их родному состоянию. Метод подтягивания использует эту презентацию ECM для манипулирования тонкими волокнами мышей, генетически поддающейся обработке системой, и точной количественной оценки их механических свойств. Это позволило нам изуч...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана NIH R01 EY029130 (S.B.) и P30 EY002687 (S.B.), R01 HL53325 и Инес Мандл Research Foundation (R.P.M.), Фондом Марфана, а также неограниченным грантом Департаменту офтальмологии и визуальных наук Вашингтонского университета от Исследований по предотвращению слепоты. J.R. также получил грант от Университета медицинских наук и фармации в поддержку этого проекта.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1/4-20 винтов с шестигранной головкой длиной 3/4 дюймаThorlabsSH25S075
1/4-20 гайкадля хозяйственного магазина
3D SLA принтерAnycubicPhoton
4-40 винтов длиной 3/8 дюйма, 2для хозяйственного магазина
, наружный диаметр 1,2 мм и 3 дюйма длиной, без нитиWPI1B120-3
Цианоакрилат (супер) клейLoctite
Цифровая шкала с точностью до 0,01 гВерньерOHAUS Scout 220
ExcelMicrosoftSpreadsheet
Газовый прикуриватель
Микроскоп для осмотра/пресеченияAmscopeАртикул: SM-4NTPРабочее расстояние ~ 15 см
Микроманипулятор, Экономичный 4-осевойWPIKite-L
Моторизованный микрометрThorlabsZ812B
Негативная цилиндрическая линзаThorlabsLK1431L1-75 мм фокусное расстояние
чашки Петри, 50 мм
Держатель стойки, 3 дюймаThorlabsPH3
Стойка, 4 дюймаThorlabsTR4
Программное обеспечение для регистрации весовVernierLoggePro
Контроллер серводвигателяThorlabsKDC101
Программное обеспечение контроллера серводвигателяThorlabsAPT
Щелевое основание, 1ThorlabsBA1S
Щелевые основания, 2ThorlabsBA2
Подставка для микроманипулятораWPIM-10
USB-камера для микроскопаAmscopeАртикул: MD500
УФ-активированный клей с источником УФ-излученияAmazon
капилляра

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. Biological glass: structural determinants of eye lens transparency. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1568), 1250-1264 (2011).
  2. Bassnett, S. Zinn's zonule. Progress in Retinal and Eye Research. 82, 100902(2021).
  3. Dureau, P. Pathophysiology of zonular diseases. Current Opinion in Ophthalmology. 19 (1), 27-30 (2008).
  4. Shi, Y., et al. Latent-transforming growth factor beta-binding protein-2 (LTBP-2) is required for longevity but not for development of zonular fibers. Matrix Biology. 95, 15-31 (2021).
  5. Ushiki, T. Collagen fibers, reticular fibers and elastic fibers. A comprehensive understanding from a morphological viewpoint. Archives of Histology and Cytology. 65 (2), 109-126 (2002).
  6. Bassnett, S. A method for preserving and visualizing the three-dimensional structure of the mouse zonule. Experimental Eye Research. 185, 107685(2019).
  7. Todorovic, V., Rifkin, D. B. LTBPs, more than just an escort service. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (2), 410-418 (2012).
  8. Mecham, R. P., Gibson, M. A. The microfibril-associated glycoproteins (MAGPs) and the microfibrillar niche. Matrix Biology. 47, 13-33 (2015).
  9. Hubmacher, D., Reinhardt, D. P., Plesec, T., Schenke-Layland, K., Apte, S. S. Human eye development is characterized by coordinated expression of fibrillin isoforms. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (12), 7934-7944 (2014).
  10. Inoue, T., et al. Latent TGF-β binding protein-2 is essential for the development of ciliary zonule microfibrils. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5672-5682 (2014).
  11. De Maria, A., Wilmarth, P. A., David, L. L., Bassnett, S. Proteomic analysis of the bovine and human ciliary zonule. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (1), 573-585 (2017).
  12. Wright, D. M., Duance, V. C., Wess, T. J., Kielty, C. M., Purslow, P. P. The supramolecular organization of fibrillin-rich microfibrils determines the mechanical properties of bovine zonular filaments. Journal of Experimental Biology. 202 (21), 3011-3020 (1999).
  13. Bocskai, Z. I., Sandor, G. L., Kiss, Z., Bojtar, I., Nagy, Z. Z. Evaluation of the mechanical behaviour and estimation of the elastic properties of porcine zonular fibres. Journal of Biomechanics. 47 (13), 3264-3271 (2014).
  14. Fisher, R. F. The ciliary body in accommodation. Transactions of the Ophthalmological Societies of the United Kingdom. 105, Pt 2 208-219 (1986).
  15. Michael, R., et al. Elastic properties of human lens zonules as a function of age in presbyopes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (10), 6109-6114 (2012).
  16. van Alphen, G. W., Graebel, W. P. Elasticity of tissues involved in accommodation. Vision Research. 31 (7-8), 1417-1438 (1991).
  17. Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. The structure and micromechanics of elastic tissue. Interface Focus. 4 (2), 20130058(2014).
  18. Jones, W., Rodriguez, J., Bassnett, S. Targeted deletion of fibrillin-1 in the mouse eye results in ectopia lentis and other ocular phenotypes associated with Marfan syndrome. Disease Models & Mechanisms. 12 (1), 037283(2019).
  19. Weinbaum, J. S., et al. Deficiency in microfibril-associated glycoprotein-1 leads to complex phenotypes in multiple organ systems. Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25533-25543 (2008).
  20. Comeglio, P., Evans, A. L., Brice, G., Cooling, R. J., Child, A. H. Identification of FBN1 gene mutations in patients with ectopia lentis and marfanoid habitus. British Journal of Ophthalmology. 86 (12), 1359-1362 (2002).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

pull up

Похожие статьи