Раннее развитие зависит от продуктов, унаследованных матерью, и роль многих из этих продуктов в настоящее время неизвестна. Здесь мы описали протокол, который использует CRISPR-Cas9 для идентификации фенотипов материнского эффекта в одном поколении.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Определение роли матерински-экспрессированных генов в раннем развитии с материнскими криспантами
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Раннее развитие зависит от пула материнских факторов, включенных в зрелую яйцеклетку во время оогенеза, которые выполняют все клеточные функции, необходимые для развития, до активации зиготического генома. Как правило, генетическое нацеливание на эти материнские факторы требует дополнительного поколения для выявления фенотипов материнского эффекта, препятствуя способности определять роль матерински-экспрессированных генов во время развития. Открытие возможностей биаллельного редактирования CRISPR-Cas9 позволило провести скрининг эмбриональных фенотипов в соматических тканях введенных эмбрионов или «хрустящих веществ», усилив понимание роли зиготически экспрессированных генов в программах развития. В этой статье описывается протокол, который является расширением метода crispant. В этом методе биаллельное редактирование половых клеток позволяет выделить фенотип материнского эффекта в одном поколении, или «материнские хрустящие вещества». Мультиплексирование направляющих РНК к одной мишени способствует эффективному производству материнских хрустящих веществ, в то время как анализ последовательности материнских хрустящих гаплоидов обеспечивает простой метод подтверждения генетических поражений, которые производят фенотип материнского эффекта. Использование материнских криспантов способствует быстрой идентификации основных генов, экспрессируемых матерью, тем самым облегчая понимание раннего развития.
Введение
Пул материнских продуктов (например, РНК, белков и других биомолекул) необходим для всех ранних клеточных процессов до тех пор, пока не будет активирован зиготный геном эмбриона1. Преждевременное истощение этих продуктов из ооцита, как правило, является эмбриональным летальным. Несмотря на важность этих генов в развитии, роль многих материнских экспрессированных генов в настоящее время неизвестна. Прогресс в технологии редактирования генов у рыбок данио, такой как CRISPR-Cas9, позволяет нацеливаться на гены, экспрессируемые матерью 2,3,4. Однако идентификация фенотипа материнского эффекта требует дополнительного поколения по сравнению с зиготным фенотипом, что требует больше ресурсов. В последнее время возможность биаллельного редактирования CRISPR-Cas9 была использована для скрининга эмбриональных фенотипов в соматических тканях инъекционных (F0) эмбрионов, известных как «хрустящие вещества» 5,6,7,8,9,10. Метод crispant позволяет проводить ресурсосберегающий скрининг генов-кандидатов в соматических клетках, облегчая понимание конкретных аспектов развития. Протокол, описанный в этой статье, позволяет идентифицировать фенотипы материнского эффекта, или «материнские хрустящие жидкости», в одном поколении11. Эта схема достижима путем мультиплексирования направляющих РНК к одному гену и стимулирования событий биаллельного редактирования в зародышевой линии. Эти материнские хрустящие эмбрионы могут быть идентифицированы по грубым морфологическим фенотипам и подвергнуться первичной характеристике, такой как маркировка границ клеток и паттерн ДНК11. Комбинированный анализ наблюдаемого фенотипа и базовой молекулярной характеристики индуцированных INDL позволяет прогнозировать роль целевого гена в раннем развитии.
У рыбок данио в течение первых 24 ч после оплодотворения (HPF) небольшая группа клеток развивается в первичные половые клетки, предшественник зародышевой линии 12,13,14,15. В кладках, заложенных самками F0, доля восстановленных материнских хрустящих эмбрионов зависит от того, сколько половых клеток содержат биаллелевое событие редактирования в целевом гене. В целом, чем раньше происходит событие редактирования у эмбриона, тем выше вероятность мутаций CRISPR-Cas9, наблюдаемых в зародышевой линии. В большинстве случаев фенотипы материнских хрустящих эмбрионов происходят из-за потери функции в двух материнских аллелях, присутствующих в развивающейся яйцеклетке. Когда яйцеклетка завершает мейоз, один из материнских аллелей выдавливается из эмбриона через полярное тело, в то время как другой аллель включается в материнский пронуклеус. Секвенирование нескольких материнских хрустящих гаплоидов будет представлять собой смесь мутаций (вставок и/или делеций (INDL)), присутствующих в зародышевой линии, которые способствуют фенотипу11.
Следующий протокол описывает необходимые шаги для создания мутаций CRISPR-Cas9 в генах материнского эффекта и идентификации соответствующего фенотипа с использованием материнского криспантного подхода (рисунок 1). В первом разделе будет объяснено, как эффективно проектировать и создавать направляющие РНК, в то время как во втором и третьем разделах содержатся критические шаги по созданию материнских хрустящих кислот путем микроинъекции. После инъекции смеси CRISPR-Cas9 введенные эмбрионы проверяются на соматические правки с помощью ПЦР (раздел четвертый). Как только введенные эмбрионы F0 развиваются и достигают половой зрелости, самки F0 скрещиваются с самцами дикого типа, а их потомство проверяется на фенотипы материнского эффекта (раздел пятый). Шестой раздел включает инструкции по созданию материнских хрустящих гаплоидов, которые могут быть объединены с секвенированием Сэнгера для идентификации CRISPR-Cas9-индуцированных INDEL. Кроме того, Обсуждение содержит изменения, которые могут быть внесены в протокол для повышения чувствительности и мощности этого метода.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
В исследованиях, приведших к разработке этого протокола, все жилища и эксперименты рыбок данио были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Университета Висконсина-Мэдисона (IACUC-M005268-R2).
1. Синтез направляющих РНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Зиготные хрустящие вещества были созданы с использованием одной направляющей РНК или мультиплексирования нескольких направляющих РНК в одну мишень 5,6,7,8,9,10. Мультиплексирование направляющих РНК увеличивает процент эмбрионов, демонстрирующих зиготный хрустящий фенотип10. Из-за этой повышенной частоты эмбрионов, демонстрирующих фенотип, материнские хрустящие вещества создаются путем мультиплексирования четырех направляющих РНК в один ген. Более подробный протокол по использованию CHOPCHOP для разработки направляющих РНК и метод отжига для синтеза направляющих РНК для рыбок данио можно найти в другом месте 16,17,18,19,20.
- Чтобы идентифицировать материнско-экспрессированный ген для мишени, определите уровни транскрипта мРНК во время развития с помощью базы данных последовательностей РНК, которая предоставляет информацию о транскриптоме от зиготы до 5 дней21. В целом, материнские специфические гены высоко экспрессируются в раннем эмбрионе и деградируют после активации зиготического генома22.
- После того, как ген-мишень с материнской экспрессией был идентифицирован, определите первый прогнозируемый белковый домен, используя раздел «домены и особенности», доступный в браузере генома Ensembl23. Используйте этот домен в качестве целевого региона для четырех направляющих РНК.
- Используйте программу выбора направляющей РНК CHOPCHOP для идентификации четырех целевых сайтов направляющей РНК в первом активном домене. Разработка ген-специфических олигонуклеотидов, как показано ниже для каждого целевого участка. В геноспецифическом олигонуклеотиде секцияN20 соответствует целевой последовательности за вычетом сайта PAM (NGG) из CHOPCHOP. Упорядочивайте эти геноспецифические олигонуклеотиды и постоянный олигонуклеотид с помощью стандартной опреснительной очистки (см. Таблицу материалов).
Геноспецифический олигонуклеотид:
5' ТААТАКГАКТКАКТАТА- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 3' - Чтобы создать шаблон направляющей РНК для каждого геноспецифического олигонуклеотида, отожгите его до постоянного олигонуклеотида и заполните выступы Т4-ДНК-полимеразой, как описано ранее16. После того, как четыре шаблона направляющей РНК собраны, очистите и сконцентрируйте их вместе с помощью комплекта для очистки ДНК и концентратора в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
- Синтезируйте смесь sgRNA из объединенного шаблона направляющей РНК с помощью набора транскрипции in vitro T7 (см. Таблицу материалов). Выполните транскрипцию in vitro в соответствии с инструкциями производителя. Использование полуреакций набора транскрипции T7 может снизить стоимость одной реакции.
- После синтеза РНК очищают полученный пул sgRNAs с использованием протокола этанола/ацетата аммония, как описано ранее 16,20,24. После того, как РНК была выделена, повторно суспендируйте ее в 20 мкл воды без нуклеазы. Если для транскрибирования пула sgRNAs использовались полуреакции набора транскрипции T7, повторно суспендировали очищенную РНК в 10-15 мкл воды без нуклеазы.
- Количественно оцените количество объединенных sgRNAs, которые были созданы с помощью спектрофотометра. Разбавляют пул sgRNAs в безнуклеазной воде до разбавления 1500 нг/мкл ± 500 нг/мкл. Как правило, конечный объем рабочего разбавления колеблется в пределах 30-50 мкл.
- После определения концентрации пула sgRNAs, проверьте целостность sgRNAs на 1% агарозном геле.
- Отлить 1% агарозы/0,5 мкг/мл бромида этидия/Геля TBE. Как только гель затвердеет, поместите его в буфер работы TBE.
- Смешайте 1 мкл смеси сгРНК и 1 мкл нагрузочного буфера РНК-геля (см. Таблицу материалов). Загрузите этот образец в гель и запустите гель при 100 В в течение 5 минут.
- Визуализируйте полосы с помощью ультрафиолетового (УФ) света. Пул sgRNAs должен отображаться как единая полоса. Если наблюдается мазок, вероятно, произошла деградация РНК.
- Храните пул sgRNAs в одноразовых аликвотах объемом 1 мкл в безнуклеазных ленточных трубках ПЦР в морозильной камере -80 °C. Для больших объемов смеси sgRNAs (30 мкл или более) аликвотирует половину объема в безнуклеазные трубки ПЦР-полоски, а другую половину хранит в виде большего объема в микроцентрифужной трубке без нуклеазы. Оттаивайте и аликвотируйте, когда это необходимо.
- Чтобы предотвратить деградацию РНК, убедитесь, что образцы в трубке микроцентрифуги проходят не более двух циклов замораживания-оттаивания.
2. Подготовка реагентов и материалов для микроинъекции
ПРИМЕЧАНИЕ: У рыбок данио инъекция мРНК Cas9 может создать зиготные хрустящие тона. Однако исследования показали, что белок Cas9 более эффективен в создании INDEL у введенных эмбрионов 16,25. Этот протокол использует белок Cas9 для генерации материнских криспантов, потому что этот белок не испытывает такого же отставания в активности, как инъекционная мРНК Cas9. Теоретически, это должно увеличить вероятность биаллельной мутации на ранней стадии развития, что приведет к увеличению вероятности поражения более обширного участка зародышевой линии. Другие протоколы и ресурсы, подробно описывающие, как подготовиться к микроинъекциям, можно найти в другом месте24,26.
- Покупка или генерация белка Cas9 (см. Таблицу материалов). Повторно суспендировать белок Cas9 в воде без нуклеазы, чтобы получить раствор 2 мг/мл и аликвотировать 1 мкл в полипропиленовые микроцентрифужные трубки без РНКазы. Храните их в виде одноразовых трубок при -80 °C.
- Во второй половине дня перед инъекцией используйте съемник микропипетки, чтобы вытянуть стеклянный капилляр и создать инъекционную иглу. Храните неповрежденную иглу в закрытом держателе иглы до утра микроинъекций.
- Чтобы создать инъекционную пластину, залейте 20 мл 1,5% агарозы/стерильнойH2O, чтобы заполнить половину чашки Петри размером 100 мм X 15 мм и подождите, пока она затвердеет. После того, как раствор агарозы установлен, добавьте 20 мл 1,5% агарозы/стерильнойH2Oв чашку Петри и поместите пластиковую форму (см. Таблицу материалов) в жидкую агарозу и дайте ей затвердеть.
- После того, как агароза затвердеет, снимите пластиковую форму и храните инжекторную пластину вверх ногами в холодильнике до утра инъекций. Одна пластина может быть использована для нескольких закачек, если скважины сохраняют свою целостность.
3. Микроинъекция коктейля CRISPR-Cas9 в одноклеточный эмбрион рыбки данио для получения материнских хрустящих веществ
ПРИМЕЧАНИЕ: Больше ресурсов для микроинъекции эмбрионов рыбок данио можно найти в других местах 24,26,27. Введение смеси CRISPR-Cas9 в развивающийся бластодиск одноклеточных эмбрионов может увеличить вероятность создания материнских хрустящих хлопьев. Смесь также может быть введена в желточный мешок до 2-клеточной стадии. Однако смеси, вводимые в желток, зависят от ооплазматического потока, чтобы достичь бластодиска, поэтому CRISPR-Cas9, введенный в желток, может снизить эффективность резки CRISPR-Cas928.
- Во второй половине дня перед микроинъекциями установите дикие скрещивания в брачных ящиках рыбок данио. Держите самцов и самок рыб в одном аквариуме, но разделяйте их разделителем брачного ящика или поместите самку в вставку для яйцекладки.
- Утром в день эксперимента вынимают одну аликвоту 2 мг/мл белка Cas9 и одну аликвоту пула sgRNAs. В трубке полипропиленовой микроцентрифуги без РНКазы, содержащей белок Cas9, соберите инъекционную смесь объемом 5 мкл, которая включает пул sgRNAs, 1 мкл 0,5% фенольного красного раствора и воду без нуклеазы. Стремитесь к конечной концентрации 400 нг/мкл белка Cas9 и 200 нг/мкл объединенных sgRNAs в воде без РНКазы или соотношения белка Cas9 к sgRNAs в введенном эмбрионе 2:1. Эту инъекционную смесь можно хранить на льду в течение утра инъекции.
- Извлеките инъекционную пластину из холодильника и дайте ей нагреться до комнатной температуры (RT) не менее 20 минут.
- После того, как коктейль для инъекций собран, позвольте самцу и самке спариваться, например, удалив разделитель брачного ящика или поместив самца в ту же яйцекладущую вставку, что и самка, в зависимости от обстоятельств.
- После того, как рыба уложится, но до того, как эмбрионы будут собраны, отрежьте кончик неповрежденной иглы, используя новое лезвие бритвы или тонкие щипцы, чтобы создать иглу, которая имеет отверстие, достаточно маленькое, чтобы избежать повреждения эмбриона, но достаточно широкое, чтобы оно не засорилось инъекционной смесью. После того, как игла была разрезана, загрузите иглу инъекционной смесью, используя наконечник пипетки микрозагрузчика, вставленный в задний конец капилляра (см. Таблицы материалов).
- После того, как игла заполнена, инкубируйте иглу в течение 5 минут на RT для сборки комплексов Cas9-sgRNA.
- Включите микроинжектор и вставьте иглу в микроманипулятор. Поместите каплю минерального масла на микрометровый слайд и откалибруйте иглу, регулируя давление впрыска, пока игла не выдаст болюс 1 нЛ в минеральное масло.
ПРИМЕЧАНИЕ: При впрыскивании в минеральное масло болюс 1 нЛ будет иметь диаметр приблизительно 0,125 мм (или радиус 0,062 мм), измеренный с помощью микрометрового слайда. - Чтобы синхронизировать эмбрионы, соберите их через 10 мин с помощью пластикового ситечка и промойте их в чашку Петри, используя 1 среду E3 (5 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, 0,33 мМ CaCl2, 0,33 мМ MgSO4, и добавьте 20 мкл 0,03 М метиленового синего на 1 л 1x E3). Удалите 10-15 эмбрионов и поместите их в отдельную чашку Петри, которая будет храниться в качестве неинъективного контроля.
- Перенесите остальные развивающиеся эмбрионы в лунки инъекционной пластины.
- Вводят 1 нл раствора (в общей сложности 400 пг белка Cas9 и 200 пг sgRNAs) в развивающийся бластодиск одноклеточного эмбриона. Если кончик иглы забивается, используйте щипцы, чтобы сломать наконечник назад и повторно откалибровать иглу, чтобы извлечь болюс 1 нЛ. Убедитесь, что введены все эмбрионы в течение первых 40 минут развития после оплодотворения.
- После того, как инъекция будет завершена, верните введенные эмбрионы в меченую чашку Петри, которая содержит 1 среду E3 и позвольте им развиваться в течение дня. Удалите все эмбрионы, которые не оплодотворены или не развиваются нормально в соответствии с серией29 стадий рыбок данио.
4. Скрининг на соматические INPEL у эмбрионов, введенных f0
ПРИМЕЧАНИЕ: Другие методы идентификации INPEL, такие как анализ эндонуклеазы T7 I или анализ плавления с высоким разрешением, могут быть использованы при определении того, содержат ли эмбрионы соматические INDELs 30.
- На следующий день после инъекций удалите дефектные и лизированные эмбрионы из чашки Петри и замените 1 среду E3 для поддержания здоровья эмбрионов.
- После очистки посуды соберите шесть здоровых введенных эмбрионов и два контрольных эмбриона из неинъецированной пластины. Поместите каждый эмбрион по отдельности в одну лунку трубки для полоски ПЦР и пометьте верхнюю часть трубок.
- Чтобы извлечь геномную ДНК отдельных эмбрионов, удалите излишки среды E3 из лунок ленточной трубки и добавьте 100 мкл 50 мМ NaOH на лунку.
- Инкубируют эмбрионы при 95 °C в течение 20 мин. Затем охладите образцы до 4 °C, добавьте 10 мкл 1 M Tris HCL (рН 7,5) и вращайте их в течение 5-10 с. Эта извлеченная ДНК может храниться при -20 °C в течение не менее 6 месяцев без значительной деградации ДНК.
- Разработайте уникальные экранирующие праймеры для каждого направляющего участка, чтобы усилить фрагмент ДНК 100-110 bp, который включает в себя целевой сайт CRISPR-Cas9. Если возможно, поместите целевой сайт в середину усиленного фрагмента, что позволит идентифицировать более крупные удаления.
- Для каждого из четырех направляющих целевых участков настройте восемь 25 мкл ПЦР-реакций с использованием 5 мкл подготовленной геномной ДНК одного эмбриона, смеси ПЦР и направляющих скрининговых праймеров для выявления соматических мутаций в целевом участке (таблица 1).
- Отлите 2,5% агарозы/0,5 мкг/мл этидия бромида/Геля TBE с использованием гребней, которые создают скважины шириной около 0,625 см. Эта широкая гребень обеспечивает лучшее разрешение при обнаружении изменений размера геномной последовательности. После того, как гель затвердеет, поместите его в камеру электрофореза, которая содержит работающий буфер TBE.
- Добавьте 5 мкл 6-кратного нагрузочного красителя в продукт ПЦР и загрузите 25 мкл этой смеси в гель. Убедитесь, что введенные и контрольные образцы выполняются на одном ряду геля. После того, как все образцы загружены, добавьте 5 мкл бромида этидия на 1 л работающего буфера TBE к положительному концу гелевой коробки.
- Запускайте гель при 120 В до тех пор, пока полосы ДНК не разрешатся или ДНК не приблизится к концу полосы. Если Cas9 создал INDL в целевом участке, мазок обычно наблюдается в введенных образцах, но не в контрольных элементах.
- Если мазки наблюдаются как минимум в трех из четырех направляющих участков у эмбрионов, вводимых четырьмя направляющими РНК, растут эмбрионы, которым вводят эмбрионы.
- Всякий раз, когда введенные образцы не содержат мазков в необходимом количестве направляющих участков, разрабатывайте новые направляющие РНК для замены тех, которые не работали, и создавайте новый пул направляющих РНК, который включает те, которые работали, и вновь разработанные. Введите и протестируйте новый пул на наличие соматических INDL, как описано выше.
5. Идентификация фенотипов материнского эффекта у материнских хрустящих эмбрионов
ПРИМЕЧАНИЕ: Как только введенные самки F0 достигают половой зрелости, их клетки зародышевой линии могут генерировать смесь материнских хрустящих и диких эмбрионов. Несмотря на то, что эта смесь позволяет осуществлять внутренний контроль за оплодотворением и сроками развития, все же полезно установить скрещивание дикого типа в качестве внешнего контроля в случае, если сцепление от самки F0 содержит только материнские хрустящие эмбрионы.
- Во второй половине дня перед экспериментом настройте самок F0 против самцов дикого типа и контролируйте скрещивания дикого типа в стандартных брачных ящиках для рыбок данио. Поместите самца и самку рыб в один аквариум, но разделите их разделителем брачного ящика или поместите самку в вставку для яйцекладки.
- Утром в день эксперимента позвольте самцу и самке начать спаривание, например, удалив разделитель брачного ящика или поместив самца в ту же яйцекладущую вставку, что и самка.
- Собирайте эмбрионы каждые 10 минут, перемещая яйцекладущую вставку в новое дно брачного резервуара, которое содержит пресную системную воду, и маркируйте резервуар меткой, идентифицирующей особую самку F0. Возьмите старый брачный бак и налейте воду через чайное ситечко, чтобы собрать эмбрионы из одной индивидуальной 10-минутной кладки.
- После того, как эмбрионы из одной 10-минутной муфты будут собраны в ситечке, перенесите их в чашку Петри, содержащую 1 среду E3. Пометьте чашку Петри временем сбора и информацией о рыбе.
- Под рассекающим микроскопом с прошедшим источником света наблюдайте за эмбрионами, подвергающимися развитию, каждый час в течение первых 6-8 ч и ежедневно в течение следующих 5 дней.
- Идентифицировать потенциальные материнские хрустящие эмбрионы по грубым морфологическим изменениям в их развитии по сравнению с контрольными группами дикого типа29.
- Переместите потенциальные материнские хрустящие эмбрионы в чашку Петри, которая содержит 1 среду E3 и анализ на морфологический фенотип при 24 л.с.ф. и жизнеспособность (например, инфляция плавательного пузыря) через 5 дней после оплодотворения.
6. Секвенирование аллелей в материнских хрустящих гаплоидах
ПРИМЕЧАНИЕ: Материнские хрустящие гаплоиды содержат один аллель в целевом локусе, что позволяет идентифицировать INDELs в гене-мишени с помощью секвенирования Сэнгера. Эмбрионы материнских хрустящих гаплоидов также могут быть проанализированы с использованием анализов секвенирования следующего поколения. Ожидается, что эмбрионы, которые показывают фенотип материнского хрустящего вещества, будут нести поражение по крайней мере в одном из четырех целевых участков (см. Обсуждение).
- Во второй половине дня перед экспериментом установили спаривание пар самок F0, которые, как известно, производят материнские хрустящие эмбрионы, скрещенные с самцами дикого типа. Держите самцов дикого типа физически отделенными от самок с помощью разделителя брачного ящика или поместите самку в вставку для яйцекладки.
- Утром в день эксперимента удалите физическую перегородку или поместите самцов и самок в яйцекладущую вставку, чтобы начать спаривание. При первых признаках яйцекладки прерывают размножение, разделяя самца и самок F0. Держите каждую отдельную самку F0 в отдельных брачных коробках.
- Готовят обработанный УФ-излучением раствор спермы с использованием яичек одного самца дикого типа на каждые 100 мкл раствора Хэнка (таблица 2), достаточные для оплодотворения экструдированных яйцеклеток одной самки, как описано ранее31.
- Вручную экструдируйте зрелые яйцеклетки из предварительно отобранных самок F0 и выполняйте экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) с использованием очищенных УФ-излучением сперматозоидов31.
- После экстракорпорального оплодотворения позвольте гаплоидным эмбрионам развиваться до тех пор, пока не будет наблюдаться фенотип материнского хрустящего вещества, и поместите эти эмбрионы в другую чашку Петри.
- После того, как материнские гаплоидные эмбрионы были идентифицированы, позвольте им развиваться в течение не менее 6 часов после оплодотворения.
- Чтобы извлечь геномную ДНК по меньшей мере из десяти материнских гаплоидных эмбрионов, поместите один гаплоидный эмбрион в отдельный колодец трубки для полосы ПЦР, удалите излишки среды E3 из скважины и добавьте 50 мкл 50 мМ NaOH.
- Инкубируют эмбрионы при 95 °C в течение 20 мин. Затем охладите образцы до 4 °C, добавьте 5 мкл 1 M Tris HCL (рН 7,5) и вихрь в течение 5-10 с. Извлеченная ДНК может храниться при -20 °C до 6 месяцев.
- Чтобы определить, какие направляющие сайты содержат INDL, разработайте праймеры секвенирования для амплификации фрагмента ДНК, который включает в себя все четыре целевых сайта CRISPR-Cas9. Эти буквари по виртуализации позволяют идентифицировать INDL, которые охватывают несколько направляющих сайтов.
- Настройте две реакции ПЦР по 25 мкл на эмбрион, используя 5 мкл подготовленной геномной ДНК и праймеры для секвенирования.
- После завершения ПЦР очистите и сконцентрируйте два образца с помощью комплекта для очистки ДНК и концентратора (см. Таблицу материалов). Затем отправьте фрагмент ДНК на секвенирование Сэнгера, используя как прямые, так и обратные праймеры секвенирования.
- После того, как гаплоидный фрагмент материнского хрустящего вещества был секвенирован, выровняйте его по последовательности дикого типа и идентифицируйте INDL в целевых участках с помощью программы выравнивания последовательностей.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Экспериментальный подход, описанный в этом протоколе, позволяет быстро и эффективно идентифицировать фенотипы материнского эффекта (рисунок 1).
Производство материнских хрустящих кислот:
При разработке четырех направляющих РНК для нацеливания на один ген материнского эффекта-кандидата особое внимание следует уделить тому, где направляющие РНК будут связываться с ДНК. В общем, все они должны быть сгруппированы вместе с минимальными или отсутству...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Протокол, представленный в этой рукописи, позволяет идентифицировать и первично-молекулярную характеристику фенотипа материнского эффекта в одном поколении вместо нескольких поколений, необходимых как для прямых, так и для обратных генетических методов. В настоящее время роль многих матерински экспрессированных генов неизвестна. Этот недостаток знаний частично связан с дополнительным поколением, необходимым для визуализации фенотипа при идентификации генов материнского эффекта. В прошлом быстрая идентификация генов матер...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Мы благодарим бывших и нынешних сотрудников лабораторного животноводства Пелегри за заботу о водном объекте. Мы также благодарны за комментарии и понимание рукописи Райана Тревены и Дианы Хэнсон. Финансирование было предоставлено грантом NIH F.P. (GM065303)
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1 М Tris-HCl (pH 8,4) | Invirogen | 15568025 | Для смеси ПЦР |
| 1,5 мл Пробирки Eppendorf Any | Maker | ||
| 10 mM dNTPs | Thermo Fischer Scientific | 18427013 | Синтез гРНК |
| 100 BP лестница Any | Maker | Для гель-электрофореза | |
| 100% РНКаза свободный этанол | Any Maker | ||
| 100% РНКаза бесплатный этанол | Any Maker | ||
| 100 мл стакан | Any Maker | For IVF | |
| 5 m Аммоний Accetate | Thermo Fischer Scientific | найден в наборе для транскрипции MEGAshortscript T7 | Синтез гРНК |
| 70% этанол | Синтез гРНК (70 мл этанола + 30 мл нуклеазной воды) | ||
| Borosil 1,0 мм OD x 0,5 мм ID | FHC INC | 27-30-1 | для микроинъекций |
| Bulk Pharma Sodium Bicarbonate 35 фунтов | Bulk Reef Supply | 255 | Fish Supplies |
| CaCl2 | MiliporeSigma | C7902 | |
| Cas9 Белок с NLS | PNABio | CP01 | |
| ChopChop | https://chopchop.cbu.uib.no/ | ||
| Интегрированная ДНК с константными олигонуклеотидами | Технологии (IDT) | AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC TAGCTCTAAAAC | |
| Стеклянная пластина с депрессией | Thermo Fischer Scientific | 13-748B | Для ЭКО |
| Препарирующие щипцы | Dumont | SS | Для ЭКО |
| Препарирующие ножницы | Fine Science Tools | 14091-09 | Для ЭКО |
| Препарирующий стероскоп (с проходящим источником света) | Any Maker | For | |
| ЭКО DNA Clean & Концентратор -5 | Zymo Research | D4014 | Синтез гРНК |
| ДНК Гель Загружающий краситель (6x) | Any Maker | Для гель-электрофореза | |
| EconoTaq DNA Polymerase | Lucigen | 30032-1 | Для ПЦР-микса |
| Электроферез Источник питания | Any Maker | Для гель-электрофореза | |
| Ensemble | https://useast.ensembl.org/index.html | ||
| Eppendorf Наконечники для микрозагрузчика FemtoJet Микроинъектор | Thermo Fischer Scientific | E5242956003 | для микроинъекций |
| этанола (200 proof, без нуклеазы) | Any Maker | ||
| FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000021 | для микровпрыска |
| Рыбная сеть | Any Maker | Поставки рыбы | |
| Замороженный рассол Креветки | Рассол Креветки Direct | Поставки рыбы | |
| Общий Универсальный Агароза | Любой Производитель | Для гель-электрофореза | |
| Ген-специфические олигонуклеотидные | Интегрированные технологии ДНК (IDT) | TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTTTAGCTAGAAATAGCAAG | |
| Перчатки | Любой производитель | ||
| Ведро для льда | Любой производитель | ||
| Растворимая океанская соль | Любой производитель | Рыбные поставки | |
| Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide, 10 мг/мл Thermo | Fischer Scientific | 15-585-011 | |
| KCl | MiliporeSigma | P5405 | |
| KH2PO4 | MiliporeSigma | 7778-77-0 | |
| Kimwipes | Thermo Fischer Scientific | 06-666 | |
| Male & Самка данио-рерио | |||
| MEGAshortscript T7 Набор для транскрипции | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | Синтез гРНК |
| метиленового синего | Thermo Fischer Scientific | AC414240250 | для E3 |
| MgCl2 | MiliporeSigma | 7791-18-6 | Для смеси ПЦР |
| MgSO2· 7H2O | MiliporeSigma | M2773 | |
| Пластиковая пресс-форма для микровпрыска | World Precision Instruments | Z-формы | для микроинъекции |
| Микроманипулятор | Any Maker | для микровпрыска | |
| Пуллер для микропипеток | Sutter | P-87 | для микроинъекции |
| Наконечники для микропипеток с фильтрами (все размеры)Наконечники для микропипеттеров | Any Maker | ||
| без фильтров (все размеры) | Наконечники | ||
| Минеральное масло | MiliporeSigma | m5904-5 мл | для микроинъекций |
| MS-222 ( Tricaine-D) | Одобрено FDA | ||
| Na2 HPO4 | MiliporeSigma | S3264 | |
| NaCl | MiliporeSigma | S5886 | |
| NaHC03 | MiliporeSigma | S5761 | |
| Nanodrop | Any Maker | ||
| NaOH | MiliporeSigma | 567530 | |
| Антипригарные, не содержащие РНКазы микрофуговые пробирки, 1,5 мл | Ambion | AM12450 | Синтез гРНК |
| нуклеазной воды Any | Maker | ||
| Бумажное полотенце | Any Maker | ||
| Пастро пипетки | Any Maker | ||
| ПЦР стрип пробирки | Any Maker | ||
| диаметром 100 мм | Any Maker | ||
| Фенол Красный раствор | MiliporeSigma | P0290 | для микроинъекций |
| пластиковых песталсов | VWR | 47747-358 | для ЭКО |
| пластиковая ложка | любой производитель | для ЭКО | |
| рассол премиум класса креветки яйца | рассол креветки прямая | тонкая сетка | |
| РНК гелевая загрузка краситель | найден в MEGAshortscript T7 Transcription Kit | для гель электрофорез | |
| РНКаза AWAY | Thermo Fischer Scientific | 21-402-178 | |
| Масштабирование | любого производителя | ||
| Sharpie | Any Maker | ||
| Шпатель | Any Maker | ||
| Стерильный H2O | Any Maker | Для ПЦР-микса | |
| T4 ДНК-полимераза | NEB | M0203 | Синтез гРНК-ленты |
| Any Maker | |||
| TBE (Tris-Borate-EDTA) 10x | Any Maker | Для гель-электрофореза | |
| Окрашиватель чая | Amazon | IMU-71133W | Поставки |
| для рыбыThermo Scientific Сова 12-зубчатая расческа, толщина 1,0/1,5 мм, двусторонняя для B2 | Thermo Fischer Scientific | B2-12 | Для гель-электрофореза |
| Thermo Scientific Owl EasyCast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems | Thermo Fischer Scientific | 09-528-110B | Для гелевого электрофореза |
| Термоамплификатор | Any Maker | ||
| Трансиллюминатор | Any Maker | ||
| УФ-лампа | UVP | модель XX-15 (Cat NO. UVP18006201) | Для |
| УФ-очков безопасности | Любой производитель | для | |
| Scientific | S39015 | Рыбные принадлежности | |
| Брачные коробки для рыбок | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | Рыбные принадлежности |
| 1,5 мл Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-402-11 | |
| 10 моляров dNTPs | Thermo Fischer Scientific | 18427013 | |
| 100 BP лестница | Thermo Fischer Scientific | 15628019 | |
| 100% РНКаза без этанола | любого производителя | ||
| 5 м Аммоний Accetate | Thermo Fischer Scientific | ||
| 70% этанол | 70 мл этанола | ||
| Аксессуары для горизонтальной гелевой коробки | Fisher Scientific | 0,625 мм | |
| Агароза | любого производителя | ||
| CaCl2 | Sigma | 10043-52-4 | |
| CaCl2, дигидрат | Sigma | 10035-04-8 | E3 Средняя |
| капиллярная трубка | Cole-Parmer | UX-03010-68 | для инъекционных игл |
| Cas9 Protein | Thermo Fischer Scientific | A36496 | |
| ChopChop | https://chopchop.cbu.uib.no/ | ||
| компьютер | любой производитель | ||
| Препарирующие рецепты | любой производитель | ||
| Препарирующий микроскоп | любой производитель | ||
| Препарирующие ножницы | любой производитель | ||
| ДНК Чистый и Концентратор -5 | Zymo Research | D4014 | |
| ДНК-гель для загрузки красителя (6X) | Thermo Fischer Scientific | R0611 | |
| EconoTaq ДНК-полимераза | Lucigen | 30032-1 | |
| ансамбль | https://useast.ensembl.org/index.html | ||
| микрозагрузчиком Eppendorf Microloader PipetteTips | Fischer Scientific | 10289651 | 20 микролитров |
| Этанол (200 проба, без нуклеаз) | любой производитель | ||
| Бромид этидия | Thermo Fischer Scientific | 15585011 | |
| Сеть для рыбы | любого производителя | мелкоячеистая | |
| Замороженный рассол Креветки | LiveAquaria | CD-12018 | корм для рыб |
| Гелевая расческа (0,625 мм) | любой производитель | ||
| Система электрофереза | любого производителя | ||
| Ген-специфические олигонуклеотидные | технологии интегрированной ДНК (IDT) | ||
| Стеклянная капиллярная игла | Grainger | 21TZ99 | https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88 VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL w_wcB:G:s& s_kwcid=AL!2966!3! 264955916096!!! g!438976 780705!& gucid=N:N:PS:Paid :GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501 231& gclid=Cj0KCQjw8IaGBh CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI 964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw _wcB& gclsrc=aw.ds |
| Стеклянная посуда | любого производителя | ||
| Перчатки | любого производителя | ||
| Окончательный рабочий раствор | Смешайте 9,9 мл премикса Хэнка с 0,1 мл HS Stock #6 | ||
| Премикс | объедините следующее в следующем порядке: (1) 10,0 мл HS #1, (2) 1,0 мл HS#2, (3) 1,0 мл HS#4, (4) 86 мл ddH2O, (5) 1,0 мл HS#5. Храните все лосьоны HS в 4C | ||
| Hanks Solution | |||
| Hank's Solution | https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization | ||
| Hank's Stock Solution #1 | 8,0 г NaCl, 0,4 г KCl в 100 мл ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #2 | 0,358 г Na2HPO4 безводный; 0,60 г K2H2PO4 в 100 мл ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #4 | 0,72 г CaCl2 в 50 мл ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #5 | 1,23 г MgSO47H2O в 50 мл ddH20 | ||
| Hank's Stock Solution #6 | 0,35 г NaHCO3 в 10,0 мл ddH20; сделать свежий день использования | ||
| HCl | Sigma | 7647-01-0 | |
| Ведро для льда | любого производителя | ||
| Растворимая океаническая соль | любой генератор | для рыбьей воды | |
| Набор для транскрипции в пробирке Mega Short Script | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | |
| Invitrogen™ UltraPure™ Дистиллированная вода без ДНКазы/РНКазы | Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | E3 Medium |
| KH2PO4 | Sigma | 7778-77-0 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Самец и самка данио-рерио | |||
| Mega Short Script T7 Трансципционный набор | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | |
| метиленовый синий | Fisher Scientific | AC414240250 | E3 Medium |
| MgSO2-7H2O | Sigma | M2773 | |
| Микромикроманипулятор | |||
| пластиковая пресс-форма | World Precision Instruments | Z-Molds | |
| Микроинъектор | |||
| Микроигольчатое слайд | |||
| Микропипеттер (1-10) с наконечниками | любого производителя | нужен фильтрованный наконечник p10 | |
| Микропипеттер (20-200) с наконечниками | любого производителя | ||
| Микропипеттер (100-1000) с наконечниками | любой производитель | ||
| Горка | |||
| микроволновая печь | любой производитель | ||
| MiliQ вода | любой maker | ||
| минеральное масло | sigma-aldrich | m5904-5ml | |
| Na2HPO4 | Sigma | ||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaHC02 | Sigma | 223441 | |
| Nanodrop | |||
| NaOH | Sigma | 567530 | |
| Узкий шпатель | любой производитель | ||
| Игла Puller | Sutter | P-97 | |
| Бумажное полотенце | любого производителя | ||
| Pastro Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| ПЦР праймер фланкинг направляющего сайта | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| ПЦР праймеры фланкинг праймера фланкинг сайта разреза РНК | Integrated DNA Technologies (IDT) | Стандартный обессоленный | |
| Полосковые пробирки для ПЦР | Thermo Fischer Scientific | AB0771W | |
| чашки Петри | Fisher Scientific | FB0875714 | диаметром 10 см 100 мм x 15 мм |
| Фенол Red | Fisher Science | S25464 | https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464 |
| наконечники для пипеток | любого производителя | наконечники 10 мкл, 200 мкл и 1000 мкл | |
| Пластиковая ложка Pestals | Fisher Scientific | 12-141-364 | |
| Пластиковая ложка | любого производителя | ||
| Руководство по праймеру Сайт | Интегрированные технологии ДНК (IDT) | ||
| Бритвенное лезвие | Uline | H-595B | |
| РНК гель Загрузка Краситель | в мегакоротком наборе для скриптов (набор для трансципации in vitro) | ||
| РНКасеть Фишер | 21-402-178 | ||
| РНКаза свободная полипропиленовая микроцентрифужная пробирка | Thermo Fischer Scientific | AM12400 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400 |
| РНКаза свободной воды | Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| Scale | any maker | ||
| Sharpie | any maker | ||
| Бикарбонат натрия (клетка проверено на культуре) | Sigma | S5761 | рыбья вода |
| бромид натрия Solotion | Sigma | E1510 | |
| Программное обеспечение для секвенирования по Сэнгеру Анализ | |||
| Спектрофотометр | |||
| Sterlie H2O | любой марки | ||
| T4 ДНК Полимераза | NEB | M0203S | https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information |
| Лента | любой марки | ||
| TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X | Thermo Fischer Scientific | B52 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52 |
| Морилка | для чая амазонка | IMU-71133W | доступна в большинстве кухонных магазинов |
| Термоамплификатор | |||
| Трансферный пипетка | Uline | S-24320 | |
| Transilluminator | |||
| Tricaine | fisher scientific | NC0872873 | |
| Tris HCl 7.5 | Thermo Fischer Scientific | 15567027 | |
| Universal Primer | Integrated DNA Technologies (IDT) | AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA GCTCTAAAAC | |
| УФ-лампа | UVP | ||
| УФ-защитные очки | любого производителя | ||
| Бутылка для мытья | рыбака научный | S39015 | |
| Коробки для спаривания рыбок данио-рерио | любого производителя | ||
| Рецепт | буфера PCRДобавьте 171,12 мл стерильного H20; 0,393 мл 1М MgCl2; 2,616 мл 1М MgCl2; 2,618 мл 1М Tris-HCl (pH 8,4) 13,092 мл 1М KCl; 0,262 мл 1% желатина. Автоклав в течение 20 минут, затем охладите соло на льду. Затем добавьте 3,468 мл 100 мг/мл BSA; 0,262 мл dATP (100 мМ), 0,262 мл dCTP (100 мМ); 0,262 мл dGTP (100 мМ); 0,262 мл dTTP (100 мл). Аллицитир в стерильные пробирки |
Ссылки
- Pelegri, F. Maternal factors in zebrafish development. Developmental Dynamics. 228 (3), 535-554 (2003).
- Campbell, P. D., Heim, A. E., Smith, M. Z., Marlow, F. L. Kinesin-1 interacts with Bucky ball to form germ cells and is required to pattern the zebrafish body axis. Development. 142 (17), Cambridge, England. 2996-3008 (2015).
- Eno, C., Solanki, B., Pelegri, F. aura (mid1ip1l) regulates the cytoskeleton at the zebrafish egg-to-embryo transition. Development. 143 (9), Cambridge, England. 1585-1599 (2016).
- He, W. -X., et al. Oocyte-specific maternal Slbp2 is required for replication-dependent histone storage and early nuclear cleavage in zebrafish oogenesis and embryogenesis. RNA. 24 (12), RNA. New York, N.Y. 1738-1748 (2018).
- Burger, A., et al. Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Development. 143 (11), Cambridge, England. 2025-2037 (2016).
- Jao, L. -E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
- Shankaran, S. S., Dahlem, T. J., Bisgrove, B. W., Yost, H. J., Tristani-Firouzi, M. CRISPR/Cas9-directed gene editing for the generation of loss-of-function mutants in high-throughput zebrafish F0 screens. Current Protocols in Molecular Biology. 119 (1), 1-22 (2017).
- Trubiroha, A., et al. A Rapid CRISPR/Cas-based mutagenesis assay in zebrafish for identification of genes involved in thyroid morphogenesis and function. Scientific Reports. 8 (1), 5647(2018).
- Wu, R. S., Lam, I. I., Clay, H., Duong, D. N., Deo, R. C., Coughlin, S. R. A Rapid method for directed gene knockout for screening in G0 zebrafish. Developmental Cell. 46 (1), 112-125 (2018).
- Moravec, C. E., Voit, G. C., Otterlee, J., Pelegri, F. Identification of maternal-effect genes in zebrafish using maternal crispants. Development. 148 (19), Cambridge, England. 199536(2021).
- Braat, A. K., Zandbergen, T., van de Water, S., Goos, H. J., Zivkovic, D. Characterization of zebrafish primordial germ cells: morphology and early distribution of vasa RNA. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 216 (2), 153-167 (1999).
- Eno, C., Hansen, C. L., Pelegri, F. Aggregation, segregation, and dispersal of homotypic germ plasm RNPs in the early zebrafish embryo. Developmental Dynamics. 248 (4), 306-318 (2019).
- Knaut, H., Steinbeisser, H., Schwarz, H., Nüsslein-Volhard, C. An evolutionary conserved region in the vasa 3'UTR targets RNA translation to the germ cells in the zebrafish. Current biology: CB. 12 (6), 454-466 (2002).
- Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124 (16), Cambridge, England. 3157-3165 (1997).
- Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS ONE. 9 (5), 98186(2014).
- Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44, 272-276 (2016).
- Labun, K., Montague, T. G., Krause, M., Torres Cleuren, Y. N., Tjeldnes, H., Valen, E. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
- Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42, 401-407 (2014).
- Moravec, C. E., Pelegri, F. J. An accessible protocol for the generation of CRISPR-Cas9 knockouts using INDELs in zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1920, Clifton, N.J. 377-392 (2019).
- White, R. J., et al. A high-resolution mRNA expression time course of embryonic development in zebrafish. eLife. 6, 30860(2017).
- Aanes, H., et al. Zebrafish mRNA sequencing deciphers novelties in transcriptome dynamics during maternal to zygotic transition. Genome Research. 21 (8), 1328-1338 (2011).
- Aken, B. L., et al. The Ensembl gene annotation system. Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e56969(2018).
- Kotani, H., Taimatsu, K., Ohga, R., Ota, S., Kawahara, A. efficient multiple genome modifications induced by the crRNAs, tracrRNA and Cas9 protein complex in zebrafish. PloS One. 10 (5), 0128319(2015).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1115(2009).
- Xu, Q. Microinjection into zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, Clifton, N.J. 125-132 (1999).
- Biology Mouse,, Zebrafish,, Chick, JoVE. Biology: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Microinjection Techniques. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 203 (3), 253-310 (1995).
- D'Agostino, Y., et al. A rapid and cheap methodology for CRISPR/Cas9 zebrafish mutant screening. Molecular Biotechnology. 58 (1), 73-78 (2016).
- Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with Heat Shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54492(2016).
- Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 242 (1), 44-52 (2013).
- Kushawah, G., et al. CRISPR-Cas13d induces efficient mRNA knockdown in animal embryos. Developmental Cell. 54 (6), 805-817 (2020).
- Kroeger, P. T., Poureetezadi, S. J., McKee, R., Jou, J., Miceli, R., Wingert, R. A. Production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51708(2014).
- Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection. Development. 132 (13), Cambridge, England. 2955-2967 (2005).
- Riemer, S., Bontems, F., Krishnakumar, P., Gömann, J., Dosch, R. A functional Bucky ball-GFP transgene visualizes germ plasm in living zebrafish. Gene Expression Patterns: GEP. 18 (1-2), 44-52 (2015).
- Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
