Методическая статья

Идентификация источника секретируемых белков в почках с помощью инъекции Брефельдина А

DOI:

10.3791/63178

⸱

10 ноября 2021 г.

 ,  ,  , 
1Division of Nephrology and Hypertension, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Идентификация типа клеток, ответственных за секрецию цитокинов, необходима для понимания патобиологии заболевания почек. Здесь мы описываем метод количественного окрашивания почечной ткани на цитокины, продуцируемые эпителиальными или интерстициальными клетками почек, с использованием брефельдина А, ингибитора секреции, и маркеров, специфичных для клеточного типа.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хроническая болезнь почек (ХБП) входит в десятку основных причин смерти в США. Острое повреждение почек (ОПП), хотя и часто излечимое, предрасполагает пациентов к ХБП в более позднем возрасте. Эпителиальные клетки почек были определены в качестве ключевых сигнальных узлов как при ОПП, так и при ХБП, благодаря чему клетки могут определять течение заболевания посредством секреции цитокинов и других белков. В частности, при ХБП несколько линий доказательств продемонстрировали, что неадаптивно восстановленные канальцевые клетки стимулируют прогрессирование заболевания за счет секреции трансформирующего фактора роста-бета (TGF-β), фактора роста соединительной ткани (CTGF) и других профибротических цитокинов. Тем не менее, идентификация источника и относительного количества секретируемых белков из различных типов клеток in vivo остается сложной задачей.

В данной статье описана методика использования брефельдина А (БФА) для предотвращения секреции цитокинов, что позволяет окрашивать цитокины в почечной ткани с использованием стандартных иммунофлуоресцентных методов. БЖК ингибирует транспортировку эндоплазматического ретикулума (ЭР) к аппарату Гольджи, который необходим для секреции цитокинов и других белков. Инъекция БФА за 6 ч до жертвоприношения приводит к накоплению TGF-β, PDGF и CTGF внутри клеток проксимальных канальцев (ПТК) в мышиной модели цисплатина ОПП и TGF-β в мышиной модели ХБП на основе аристолоховой кислоты (АА). Анализ показал, что БФА + цисплатин или БФА + АА значительно увеличивают TGF-β положительный сигнал по сравнению с БФА + физиологическим раствором, цисплатином или только АА. Эти данные свидетельствуют о том, что БФА может быть использована для идентификации типа клеток, продуцирующих конкретные цитокины, и количественной оценки относительных количеств и/или различных типов производимых цитокинов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

По оценкам, >10% населения мира имеют ту или иную форму заболевания почек1. Определяемый быстрым началом, ОПП в значительной степени излечим; однако эпизод ОПП может предрасполагать пациентов к развитию ХБП в более позднем возрасте 2,3. В отличие от ОПП, ХБП характеризуется прогрессирующим фиброзом и ухудшением функции почек, что приводит к терминальной стадии почечной недостаточности, требующей заместительной почечной терапии. Большинство повреждений почек нацелены на специализированные эпителиальные клетки, такие как подоциты или клетки проксимальных канальцев, которые составляют нефрон 4,5. После повреждения выжившие эпителиальные клетки помогают координировать реакцию восстановления за счет секреции цитокинов и других белков. Таким образом, выжившие клетки могут модулировать иммунный ответ, направлять ремоделирование внеклеточного матрикса и способствовать восстановлению органов.

Цитокины представляют собой небольшие секретируемые белки, необходимые для модуляции созревания, роста и реакции многоклеточных организмов 6,7. Они функционируют как посланники сигналов между различными типами клеток, включая иммунные и эпителиальные клетки8. Хотя считается, что цитокины секретируются в основном иммунными клетками, долгосрочные исследования показали, что эпителиальные и интерстициальные клетки почек также секретируют цитокины в качестве сигналов для других резидентных клеток почек, таких как клетки канальцев, интерстициальные клетки и иммунныеклетки. ПТК, в частности, играют важную роль в начале и на этапе восстановления после ОПП11. Тем не менее, известно, что неадаптивно репарируемые ПТК секретируют профибротические цитокины, такие как трансформирующий фактор роста-β (TGF-β), тромбоцитарный фактор роста-D (PDGF-D) и фактор роста соединительной ткани (CTGF), способствуя прогрессированию ХБП12. Таким образом, эпителиальные клетки почек используют секретируемые цитокины для модуляции повреждения почек.

Хотя известно, что эпителиальные клетки почек секретируют цитокины, точный источник и относительный вклад каждого типа клеток было трудно определить из-за технических сложностей изучениясекретируемых белков. Проточная цитометрия, распространенный подход, используемый для измерения цитокинов, является сложной задачей для лечения поврежденных почек, особенно в сильно фиброзных. С помощью Cre-рекомбиназы, управляемой промотором цитокинов, мышей-репортеров цитокинов часто используют для идентификации типа клеток, экспрессирующих данный цитокин. Тем не менее, использование репортерных мышей ограничено из-за необходимости скрещивания репортерных мышей с различными нокаутными фонами, отсутствия подходящих репортеров и того факта, что одновременно может быть проанализирован только один цитокин. Таким образом, необходимо разработать простую, универсальную и доступную методику обнаружения цитокин-высвобождающих клеток почек.

Мы предположили, что инъекция BFA, ингибитора секреции, который блокирует транспорт эндоплазматического ретикулума-Гольджи in vivo, позволит окрашивать секретируемые белки в почечной ткани (рис. 1A,B), как показано с помощью анализов на основе проточной цитометрии14,15. Наряду с клеточно-специфическими производителями, этот метод может быть использован для определения источника и относительного вклада цитокин-продуцирующих клеток в поврежденных почках. В отличие от образцов для проточной цитометрии, неподвижные ткани могут сохраняться в течение длительного времени с сохранением белков и клеточных структур, что позволяет проводить более тщательное исследование секреторных клеток. Чтобы проверить эту гипотезу, почки мышей повреждали с помощью модели ОПП (цисплатин) и модели ХБП (нефропатии аристолоховых кислот (ААН)), вводили БФА и окрашивали с помощью стандартных иммунофлуоресцентных методов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколом использования животных, утвержденным Институциональным комитетом по уходу за животными и пользователям Медицинского центра Университета Вандербильта.

1. Животные

  1. Используйте 8-12-недельных самцов мышей BALB/c (масса тела: около 25 г) для лечения нефропатии, вызванной цисплатином или аристолоховой кислотой.
  2. Убедитесь, что мыши здоровы и у них нет явных признаков стресса или ран от боя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раны, особенно на хвосте, могут мешать описанному здесь протоколу. Мыши BALB/c были выбраны потому, что у этих мышей легче визуализировать хвостовую вену для инъекции. Описанный здесь протокол работает для других линий мышей; Однако дозировка цисплатина или аристолоховой кислоты может отличаться в зависимости от штамма.

2. Инъекция цисплатина

  1. Растворите цисплатин в стерильном физиологическом растворе до конечной концентрации 1 мг/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цисплатин не растворится полностью при комнатной температуре. Его следует обрабатывать в вытяжном шкафу.
  2. Нагрейте раствор цисплатина на водяной бане при температуре 37 °C и многократно перемешайте до полного растворения цисплатина.
  3. Взвесьте мышей и рассчитайте объем раствора цисплатина, необходимый для введения 20 мг/кг массы тела (м.т.).
  4. Продезинфицируйте кожу живота с помощью повидон-йодных (7,5%) и спиртовых (70%) тампонов, чередуя их по 3 раза.
  5. С помощью инсулинового шприца с иглой 25 G введите раствор цисплатина внутрибрюшинно.
  6. Приступайте к разделу 4 на 3 день после инъекции.

3. Введение аристолоховой кислоты (ААК)

  1. Растворите аристолоховую кислоту-I в фосфатно-солевом буфере (PBS) в конечной концентрации 0,5 мг/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: АА следует обрабатывать в вытяжном шкафу. Следует использовать АА-I, так как это доминирующая форма, вызывающая повреждение почек.
  2. Нагрейте раствор АА на водяной бане при температуре 37 °C и многократно перемешайте до полного растворения.
  3. Взвесьте мышей и рассчитайте объем раствора АК для введения 5 мг/кг массы тела.
  4. Продезинфицируйте кожу живота с помощью повидон-йода (7,5%) и спиртового (70%) тампона 3х.
  5. С помощью инсулинового шприца с иглой 25 Г введите раствор АК внутрибрюшинно.
  6. Вводите АК через день, всего 3 инъекции.
  7. Приступайте к разделу 4 на 42 день после последней инъекции.

4. Приготовление раствора БФА

  1. Растворите БФА в диметилсульфоксиде в концентрации 10 мг/мл до получения исходного раствора.
  2. Храните исходный раствор при температуре -20 °C.
  3. Разбавить стоковый раствор БФА стерильным PBS до конечной рабочей концентрации 1,25 мг/мл
    ПРИМЕЧАНИЕ: Готовьте свежий рабочий раствор каждый раз непосредственно перед инъекцией.

5. Инъекция БФА в хвостовую вену

  1. Перед инъекцией наполовину наденьте, наполовину снимите грелку на 10 минут, чтобы мыши были в тепле, чтобы предотвратить падение температуры тела, которое может вызвать сужение сосудов в хвосте и помешать инъекции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите клетку на грелки так, чтобы половина клетки находилась на подушке, а половина - нет. Таким образом, когда мыши почувствуют тепло, они могут переместиться на другую сторону клетки и наоборот.
  2. Удерживайте мышей с помощью имеющихся в продаже удерживающих устройств соответствующего размера.
  3. Продезинфицируйте хвост с помощью повидон-йода и спиртового тампона три раза, как описано выше.
  4. Держите хвост горизонтально и визуализируйте боковые хвостовые вены (Рисунок 1C). Используйте источник света под хвостом, чтобы визуализировать вены.
  5. Введите иглу 28 G, держа иглу и шприц параллельно вене по направлению головки.
  6. Введите 200 мкл раствора БЖК в дозе 1,25 мг/мл (0,25 мг БФА). Подождите, пока вена станет чистой, когда кровь будет заменена раствором для инъекции, что указывает на то, что инъекция прошла успешно.
  7. Извлеките иглу и аккуратно надавите на хвост до тех пор, пока кровотечение не остановится.
  8. Верните мышей в клетку и следите за ними на предмет дополнительного кровотечения или признаков дистресса.

6. Жертвоприношение и сбор урожая почек

  1. Усыпить мышей с помощью передозировки изофлурана с последующим вывихом шейки матки через 6 ч после введения БФА.
    Примечание: 6-часовая временная точка была выбрана на основании литературы, демонстрирующей, что 6-часовая обработка БЖК в других органах обеспечивает достаточное накопление цитокинов в клетках для их визуализации с помощью иммунофлуоресцентногоокрашивания16.
  2. Сразу после жертвоприношения обнажите брюшную полость и сердце мыши с помощью вентрального разреза по средней линии.
  3. Соберите 100-500 мкл крови для анализа азота мочевины (АМК) крови с помощью пункции сердца. Используйте иглы 25 г с инсулиновыми шприцами объемом 1 мл для сбора крови. Для предотвращения коагуляции добавьте 5 мкл раствора гепарина (100 мг/15 мл dH2O) в каждый образец.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа на мочевину необходимо минимум 20 μл крови; тем не менее, около 500 мкл может быть собрано с помощью пункции сердца после эвтаназии, что может быть полезно для других анализов. Соберите как можно больше крови.
  4. Храните образцы крови на льду до тех пор, пока почки не будут собраны в разделе 7 ниже.
    1. Центрифугируйте образцы крови при концентрации 1300 × г в течение 10 минут.
    2. Аккуратно изолируйте плазму и храните ее при температуре -20 °C до тех пор, пока не будете готовы к проведению анализа АМК в разделе 17 ниже. В качестве альтернативы можно хранить образцы плазмы для анализа креатинина.

7. Перфузия и удаление почек

  1. Перфузируют мышь 10-20 мл PBS через левый желудочек с помощью шприца объемом 20 мл со скоростью потока 2-4 мл/мин до тех пор, пока перфузат не станет прозрачным.
  2. Удалите почки, удерживая почечную артерию и вену щипцами близко к сосочку и разрезав сосуды со стороны от почки.
  3. Аккуратно извлеките капсулу из почки, отклеив ее рукой или с помощью пары тонких стерильных щипцов.
  4. В зависимости от антитела переходят к разделу 8 для получения неподвижной ткани, залитой парафином, или к разделу 10 для получения неподвижной замороженной ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обработка тканей должна быть оптимизирована для каждого антитела, используемого для окрашивания.

8. Залитая парафином ткань для окрашивания TGF-β и PDGF-D

  1. Разрежьте почку пополам, поместив ее на чистое предметное стекло и разрезав горизонтально новым лезвием бритвы. Поместите одну половинку в 10 мл 4% параформальдегида (PFA) в PBS на 24 ч на торцевой ротатор со скоростью 10 оборотов в минуту (об/мин).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для секции не требуется целая почка. Одна половина почки может быть сохранена или использована для других анализов.
  2. Замените PFA на 70% этанол.
  3. На этой стадии почечную половину почки необходимо обработать и заложить парафином, затем разрезать залитые парафином почечные ткани с температурой 4-6 мкм с помощью микротома и установить их на предварительно очищенные, заряженные предметные стекла17,18.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Почки были обработаны и помещены в парафин с помощью общего ресурса трансляционной патологии Медицинского центра Университета Вандербильта и хранились при комнатной температуре.

9. Депарафинизация и регидратация

  1. Поместите предметные стекла в решетку для окрашивания предметных стекол и опустите их в лунку для окрашивания, содержащую D-лимонен, на 5 минут, убедившись, что ткань полностью погружена в воду. Повторите в лунке, содержащей свежий D-лимонен.
  2. Регидратируйте ткани, погружая предметные стекла в последовательные разведения этанола 100% (2x), 95%, 90% и 70% в течение 5 минут каждое.
  3. Промойте предметные стекла в проточной dH2O в течение 5 минут.
  4. Выполните извлечение антигена путем инкубации секций в цитратном буфере (pH 6,0) в скороварке при 121 °C и 15 фунтах на квадратный дюйм в течение 45 минут.
  5. Промойте предметные стекла в проточной dH2O в течение 20 минут.
  6. Перейдите к разделу 12.

10. Подготовка замороженной ткани к окрашиванию CTGF

  1. Рассеките почку пополам по горизонтальной оси с помощью свежего лезвия бритвы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для секции не требуется целая почка. Одна половина почки может быть сохранена или использована для других анализов.
  2. Поместите половинку почки в 10 мл 0,5% PFA в пробирку объемом 15 мл на ротатор на 2 ч при 4 °C со скоростью 10 об/мин.
  3. Сцедите PFA в контейнер для правильной утилизации и добавьте 10 мл 0,1 М глицина в PBS на 1 ч при 4 °C со скоростью 10 об/мин.
  4. Сцедите глицин, добавьте 10 мл 15% сахарозы, растворенной в PBS, и поместите пробирку на вращатель на ночь при температуре 4 °C и 10 оборотах в минуту.
  5. Сцедите 15% сахарозу и замените 10 мл 30% сахарозы, растворенной в PBS, на 1 ч при 4 °C и 10 об/мин.
  6. Заполните форму для заделки составом для оптимальной температуры резки (OCT) и заложите половину почки с шага 10.5 поверхностью среза почки вниз.
  7. Осторожно поместите форму, содержащую половинку почки и ОКТ, в лужу с жидким азотом для замерзания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте жидкому азоту напрямую контактировать с OCT, так как это может привести к образованию пузырьков. При использовании жидкого азота необходимо носить надлежащие средства индивидуальной защиты, такие как защитные очки/лицевой щиток, криогенные перчатки и лабораторный халат. Лучше всего использовать длинные, ~25 см, щипцы для помещения форм в жидкий азот.
  8. После замерзания в твердом состоянии храните форму при температуре -80 °C.

11. Замороженная секция

  1. Убедитесь, что криостат находится при температуре -20 °C.
  2. Пресс-формы, содержащие образцы в ОКТ, хранят в криостате при температуре -20 °C в течение 2 ч для выравнивания температуры.
  3. Снимите форму, удерживая язычки и надавливая снизу.
  4. Поместите свежий ОКТ на держатель образца и поместите сверху замороженный блок образца стороной ткани в сторону от держателя образца.
  5. Поместите держатель и образец на полку для заморозки.
  6. Поместите утяжеленный теплоотвод на верхнюю часть блока, чтобы выровнять поверхность. Держите крышку криостата закрытой, когда она не используется, чтобы предотвратить колебания температуры.
  7. После того как свежая ОКТ между блоком образца и держателем образца будет заморожена, проверьте надежность соединения.
  8. Зажмите держатель образца на микротомной головке криостата.
  9. Начинайте делать срезы до тех пор, пока ткань не станет видимой в блоке образца.
  10. Срезы почечной ткани с температурой 4-6 мкм и срезы поднимаются на предметное стекло комнатной температуры19.
  11. После того, как салфетка будет собрана, храните предметное стекло при температуре от -20 °C до -80 °C до тех пор, пока оно не будет готово к окрашиванию. Не позволяйте ему оттаять до тех пор, пока он не будет готов начать окрашивание.
  12. Перед окрашиванием извлеките предметное стекло (стекла) из хранилища и дайте нагреться до комнатной температуры. Не допускайте высыхания секций.
  13. Получив комнатную температуру, немедленно промойте срезы PBS в течение 5 мин дважды при комнатной температуре, чтобы удалить соединение OCT.
  14. Перейдите к разделу 12.

12. Иммунофлуоресцентное окрашивание

  1. Наметьте срезы тканей гидрофобным барьерным маркером. Расстояние от ткани до контура гидрофобного барьера должно быть не менее 5 мм.
  2. Добавьте 50 μL блокирующего буфера, содержащего 3% сыворотки осла и 0,1% Triton в 1% бычьего сывороточного альбумина/трис-буферизованного физиологического раствора (TBS) поверх среза и инкубируйте в течение 1 часа при комнатной температуре во увлажненной камере.
  3. Разведите первичные антитела с PBS в соответствующей концентрации. Для обнаружения цитокинов используют 50 мкл растворов первичных антител, направленных против TGF-β1 (1:200), PDGF-D (1:400) и CTGF (1:200). Для мечения миофибробластов используют 50 мкл раствора первичного антитела, направленного против альфа-гладкомышечного актина (α-СМА), конъюгированного с Cy3 в соотношении 1:200.
  4. Удалите блокирующий раствор и добавьте первичные антитела в срез, следя за тем, чтобы он не вытекал из круглого гидрофобного контура, и инкубируйте в течение ночи при 4 °C во увлажненной камере. Повторно нанесите гидрофобный барьер, если происходит утечка.
  5. Промыть 3 раза с PBS в течение 5 минут.
  6. Разведите соответствующие вторичные антитела в соотношении 1:200 с PBS.
  7. Образцы инкубируют с 50 мкл растворов вторичных антител в течение 1 ч при комнатной температуре во увлажненной камере.
  8. Промыть с PBS в течение 5 минут.
  9. Разбавленный лектин lotus tetragonolobus (LTL), конъюгированный с флуоресцеином в PBS сCa2+ и Mg2+ в концентрации 10 мкг/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ca2+ и Mg2+ необходимы для связывания LTL.
  10. Инкубировать ткани с 50 μл раствора LTL в течение 30 минут при комнатной температуре в увлажненной камере.
  11. Умываться PBS с Ca2+ и Mg2+ в течение 5 минут.
  12. Инкубировать с 50 мкл 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI, 5 мкг/мл в воде) для окрашивания ДНК/ядер в течение 5 мин при комнатной температуре.
  13. Установите покровные стекла, добавив 20 μл реагента для защиты от выцветания на ткань и медленно установив покровное стекло. Подождите 24 часа, пока реагент против выцветания затвердеет перед визуализацией.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Связывание лектина может со временем ухудшаться, что приводит к потере сигнала. Лучше всего визуализировать окрашенные лектином образцы вскоре после установки монтажного реагента. Если наблюдается потеря сигнала, в монтажный реагент можно добавить Ca2+ и Mg2+ для сохранения окрашивания.

13. Получение изображения

  1. Включите инвертированный микроскоп (см. Таблицу материалов) с автоматизированным двухкоординатным столиком.
  2. Выберите цель 20x.
  3. Откройте программное обеспечение для получения изображений (см. Таблицу материалов).
  4. Нажмите на кнопку Live , чтобы открыть окно просмотра в реальном времени.
  5. Найдите участок ткани и убедитесь, что он находится в фокусе.
  6. Нажмите на меню «Получить » и выберите «Сканировать большое изображение».
  7. В окне «Сканировать большое изображение » настройте область для сканирования, переместив рабочую область с помощью джойстика в крайнюю левую часть участка ткани и щелкнув стрелку влево. Повторите то же самое для верхнего, самого правого и нижнего сегментов тканей.
  8. Нажмите на меню приобретения .
  9. Убедитесь, что установлен флажок для большого изображения.
    1. При съемке многоканальных изображений перейдите на вкладку «Лямбда ».
    2. Нажмите на каждый канал и установите время экспозиции на уровне, при котором окрашивание будет заметным без насыщения какой-либо части изображения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти настройки должны быть согласованы в пределах одной экспериментальной группы. Изменение настроек сбора данных между образцами приведет к неточным результатам.
    3. Повторите шаг 9.2 для каждого канала, который нужно собрать.
  10. Нажмите « Сканировать».

14. Анализ изображений

  1. Откройте программу для получения изображений.
  2. Нажмите «Файл» | Откройте и выберите изображение.
  3. Щелкните правой кнопкой мыши по окну изображения и выберите полигональную область интереса (ROI).
  4. Наметьте окупаемость инвестиций с помощью инструмента «От руки ». Наметьте LTL-положительные клетки канальцев или α-SMA-положительные интерстициальные клетки.
  5. Перейдите на вкладку «Измерение» | Порог.
  6. Установите верхнюю и нижнюю границы порога, отрегулировав ползунки по обе стороны от области положительного сигнала.
  7. Перейдите на вкладку ROI .
  8. Нажмите на значок «Экспорт », чтобы сохранить значения. Используйте программное обеспечение для работы с электронными таблицами для вычисления процента площади положительного сигнала/области ROI.

15. Альтернатива: Анализ изображений с помощью бесплатного программного обеспечения (ImageJ)

  1. Откройте ImageJ.
  2. Нажмите «Файл» | Откройте для просмотра изображения.
  3. Нажмите на выбранные от руки варианты от руки.
  4. Выберите ROI , обведя контур с помощью инструмента от руки . Наметьте LTL-положительные клетки канальцев или α-SMA-положительные интерстициальные клетки.
  5. Щелкните меню «Правка» и выберите «Очистить снаружи».
  6. Нажмите кнопку Анализ и выберите Измерить, чтобы определить область ROI.
  7. Перейти к изображению | Цвет | Разделение каналов.
  8. Отрегулируйте верхнюю и нижнюю границы порога для обнаружения области положительного сигнала.
  9. Нажмите кнопку Анализ и выберите Измерить.
  10. Сохраните данные.
  11. Откройте данные с помощью программного обеспечения для работы с электронными таблицами и рассчитайте отношение площади положительного сигнала к площади ROI.

16. Опционально: визуализация с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения изображений с более высоким разрешением для публикации сканирующая конфокальная микроскопия обеспечивает более четкие изображения и уменьшение фона в почечной ткани.

  1. Включите лазерный сканирующий конфокальный микроскоп (см. Таблицу материалов).
  2. Выберите цель 40x (см. Таблицу материалов).
  3. Нажмите вкладку «Найти» и найдите ткани, настроив фокус.
  4. Перейдите на вкладку Acquisition (Acquisition Acquisition ), нажмите Channels (Каналы) и выберите 1 AU в параметре pinhole.
  5. Отрегулируйте интенсивность усиления лазера в каждом канале таким образом, чтобы положительный сигнал был виден, но не насыщен. Убедитесь, что настройки в наборе экспериментальных образцов остаются постоянными.
  6. Нажмите «Привязать» и сохраните изображение в нужном формате.

17. Уровень амбициозности в плазме

  1. Снимите образцы с температуры -20 °C и разморозьте их на льду.
  2. Разбавьте плазму dH2O в соотношении 1:10.
  3. Для каждого образца настройте три отдельные реакции в двух экземплярах в 96-луночном планшете.
    1. Для образца плюс стандарт добавьте 5 мкл 200 мг/дл мочевины и 20 мкл разбавленной плазмы.
    2. Только для образца добавьте 5 μLdH2O и 20 μL разбавленной плазмы.
    3. В качестве бланка образца добавьте 5 мкл dH2O и 20 мкл разбавленной плазмы.
  4. Смешайте 85 мкл реагента + 1 мкл уреазы на образец для приготовления рабочего раствора.
  5. Добавьте 80 мкл рабочего раствора в лунки «образец плюс стандарт» и «только образец».
  6. Добавьте 80 μL реагента (без уреазы) в лунку для «образца» из шага 17.3 выше.
  7. Осторожно постучите по тарелке, чтобы перемешать и выдержать в течение 5 минут при комнатной температуре.
  8. Чтение OD560 с помощью считывателя пластин.
  9. Рассчитайте концентрацию мочевины Eq (1) и преобразуйте ее в мочевину с помощью Eq (2).
    Мочевина (мг/дл) = (Только проба - Пустой образец)/(Стандартная - только проба) x (Стандартная/4) x (Коэффициент разбавления) (1)
    МОЧЕВИНА (мг/дл) = концентрация мочевины/2,14 (2)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ измеряет содержание мочевины (молекулярная масса: 60) в сыворотке; однако BUN относится только к содержанию азота в мочевине (молекулярная масса: 28). Таким образом, необходима коррекция 2,14 (60/28) для перевода концентрации мочевины в АМК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для изучения роли канальцевых эпителиальных клеток в продукции цитокинов после цисплатин-индуцированного ОПП цисплатин вводили цисплатин в концентрации 20 мг/кг с последующей внутривенной инъекцией 0,25 мг БЖК на 3-й день после инъекции цисплатина. Почки были собраны через 6 часов. Почки, залитые парафином, были разрезаны и окрашены TGF-β, PDGF-D и CTGF, репрезентативными цитокинами, ответственными за восстановление тканей при ОПП. Как показано на рисунке 2A, везикулы TGF-β+ наблю...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Известно, что почечные ПТК регулируют ОПП и ХБП посредством секреции TGF-β, TNF-α, CTGF, PDGF, фактора роста эндотелия сосудов, а также многих других белков 20,21,22,23. Аналогичным образом, клубочки, дистальные канальцы и другие эпителиальные клетки почек, а также интерстициальные клетки секретируют эти и/или другие белки во время повреждения 24,25,26.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Американская кардиологическая ассоциация (AHA): Кенсей Тагути, 20POST35200221; HHS | НИЗ | Национальный институт диабета, болезней пищеварительной системы и почек (NIDDK): Крейг Брукс, DK114809-01 DK121101-01.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 мл инсулиновых шприцевBD329654
10 мл ШприцBD302995
2 мл тубаFisher марки05-408-138
20 мл ШприцBD302830
25 г иглыBD305125
28 г иглыBD329424
96-луночнаяпластина Corning9017
Аристолоховая кислота-ISigma-AldrichA9461
α-SMA антитело, конъюгированное с Cy3Sigma-AldrichC6198RRID:AB_476856
Лезвие для криостатаC.L. Sturkey. IncDT315R50
Бычий сывороточный альбумин (BSA)  Sigma-AldrichA7906
Brefeldin ASigma-AldrichB6542
ЦисплатинSigma-AldrichP4394
Лимонная кислотаSigma-Aldrich791725
Конфокальный микроскопZEISS  LSM710
Объективы для конфокальной микроскопииZEISS40x / 1.10 LD C-Apochromat WATER
Конфокальное программное обеспечениеZEISSZEN
Coplin jarFisher Scientific19-4
Крышка стеклаFisher brand12545F
CryostatLeicaCM1850
CTGF антителаGenetexGTX124232 RRID:AB_11169640
Cy3-AffiniPure Donkey Anti-rabbit IgG (H+L)Jackson immunoresearch711-165-152RRID: AB_2307443
Cy5-AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)Jackson immunoresearch705-175-147RRID: AB_2340415
DAPISigma-AldrichD9542
Диметилсульфоксид (DMSO)Sigma-AldrichD8418
Одноразовые базовые формыFisher марки22-363-553
сыворотка ослаJackson immunoresearch017-000-121
ЭтанолDecon Labs, Inc.2701
ЩипцыVETUSESD-13
GlycineFisher марки12007-0050
ГрелкиKent scientificDCT-20
Гепарин натриевая сольACROS organics41121-0010100мг/15мл dH2O
Увлажненная камераInvitrogen44040410Пластиковая коробка, покрытая фольгой, может быть использована в качестве альтернативная увлажненная камера.
Инсулиновые шприцыBD329461
инвертированный микроскопNIKONEclipse Ti-E2иммунофлуоресценция
KIM-1 антителаR & DAF1817RRID: AB_2116446
Лемозол (Гисто-клир)Национальная диагностикаHS-200
lotus tetragonolobus лектинВекторFL-13212
Предметное стекло микроскопаFisher scientific12-550-343
МикротомReichertJung 820 II
монохромная CMOS камераNIKON  DS-Qi-2
Мышь Хирургический наборKent scientificINSMOUSEKIT
NIS ElementsNIKON
ОбъективыNIKONPlan Apo 20x/0.75программное обеспечение для получения изображений, связанное с Eclipse Ti-E2 (инвертированный микроскоп)
OCT соединениеScigen4586
Пап-ручкаVectorH-4000
PBS с кальцием и магниемCorning21-030-CV
PBS без кальция и магния  Corning21-031-CV
PDGF-D антителоThermo-Fisher scientific40-2100
PFAЭлектронная микроскопия Science15710RRID:
AB_2533455 Планшетный ридерPromegaGloMax® Discover Microplate Reader4% PFA разбавлен из 16% PBS.
повидон-йод (бетадин)Avrio Health L.P.НДЦ 67618-151-17
Скороварка  Tristar 8Qt. Power Cooker Plus
ProLong Gold Antifade ReagentInvitrogenP36930
Quantichrom Urea (BUN) Набор для анализа IIBioAssay SystemsDUR2-100
Лезвие бритвы с одним лезвием для рассечения почки (.009", 0,23 мм)IDL инструменты521013
Подогреватель слайдовLab Scientific Inc.,XH-2001
Программное обеспечениеNIKONNIS элементы
SucroseRPIS24060
TGF-b1 anitbodySigma-AldrichSAB4502954
Tris EDTA bufferCorning46-009-CMRRID: AB_10747473
Дигидрат цитрата натрияSigma-AldrichSLBR6660V
дигидрат цитрата натрияSigma-Aldrich
TritonSigma-Aldrich9002-93-1
Tween 20Sigma-AldrichP1379
Стекло Заряженное предметное стекло для микроскопа, размер 25 x 75 мм, шлифованные края, синий матовыйглобус Scientific1358D
SLBR6660V

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. GBD Chronic Kidney Disease Collaboration. Global, regional, and national burden of kidney disease, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 395 (10225), 709-733 (2020).
  2. Canaud, G., Bonventre, J. V. Cell cycle arrest and the evolution of chronic kidney disease from acute kidney injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 30 (4), 575-583 (2015).
  3. Chawla, L. S., Eggers, P. W., Star, R. A., Kimmel, P. L. Acute kidney injury and chronic kidney disease as interconnected syndromes. New England Journal of Medicine. 371 (1), 58-66 (2014).
  4. Berger, K., Moeller, M. J. Mechanisms of epithelial repair and regeneration after acute kidney injury. Seminars in Nephrology. 34 (4), 394-403 (2014).
  5. Bonventre, J. V., Yang, L. Cellular pathophysiology of ischemic acute kidney injury. The Journal of clinical investigation. 121 (11), 4210-4221 (2011).
  6. Kurts, C., Panzer, U., Anders, H. J., Rees, A. J. The immune system and kidney disease: basic concepts and clinical implications. Nature Reviews. Immunology. 13 (10), 738-753 (2013).
  7. Panzer, U., Steinmetz, O. M., Stahl, R. A., Wolf, G. Kidney diseases and chemokines. Current Drug Targets. 7 (1), 65-80 (2006).
  8. Commins, S. P., Borish, L., Steinke, J. W. Immunologic messenger molecules: cytokines, interferons, and chemokines. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), Suppl 2 53-72 (2010).
  9. Jaber, B. L., et al. Cytokine gene promoter polymorphisms and mortality in acute renal failure. Cytokine. 25 (5), 212-219 (2004).
  10. Black, L. M., Lever, J. M., Agarwal, A. Renal inflammation and fibrosis: A double-edged sword. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 67 (9), 663-681 (2019).
  11. van Kooten, C., Woltman, A. M., Daha, M. R. Immunological function of tubular epithelial cells: the functional implications of CD40 expression. Experimental Nephrology. 8 (4-5), 203-207 (2000).
  12. Canaud, G., et al. Cyclin G1 and TASCC regulate kidney epithelial cell G2-M arrest and fibrotic maladaptive repair. Science Translational Medicine. 11 (476), (2019).
  13. Burton, C. J., Combe, C., Walls, J., Harris, K. P. Secretion of chemokines and cytokines by human tubular epithelial cells in response to proteins. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 14 (11), 2628-2633 (1999).
  14. Ripley, C. R., Fant, J., Bienkowski, R. S. Brefeldin A inhibits degradation as well as production and secretion of collagen in human lung fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 268 (5), 3677-3682 (1993).
  15. Kovacs, S. B., Oh, C., Aachoui, Y., Miao, E. A. Evaluating cytokine production by flow cytometry using brefeldin A in mice. STAR Protocols. 2 (1), 100244(2021).
  16. Fujiwara, T., Oda, K., Yokota, S., Takatsuki, A., Ikehara, Y. Brefeldin A causes disassembly of the Golgi complex and accumulation of secretory proteins in the endoplasmic reticulum. Journal of Biological Chemistry. 263 (34), 18545-18552 (1988).
  17. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Methods in Molecular Biology. 1897, 253-268 (2019).
  18. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58288(2018).
  19. Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect immunofluorescence on frozen sections of mouse mammary gland. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53179(2015).
  20. Chung, S., et al. TGF-β promotes fibrosis after severe acute kidney injury by enhancing renal macrophage infiltration. JCI Insight. 3 (21), 123563(2018).
  21. Meng, X. M., Nikolic-Paterson, D. J., Lan, H. Y. TGF-β: the master regulator of fibrosis. Nature Reviews. Nephrology. 12 (6), 325-338 (2016).
  22. Kok, H. M., Falke, L. L., Goldschmeding, R., Nguyen, T. Q. Targeting CTGF, EGF and PDGF pathways to prevent progression of kidney disease. Nature Reviews. Nephrology. 10 (12), 700-711 (2014).
  23. Engel, J. E., Williams, E., Williams, M. L., Bidwell, G. L., Chade, A. R. Targeted VEGF (vascular endothelial growth factor) therapy induces long-term renal recovery in chronic kidney disease via macrophage polarization. Hypertension. 74 (5), 1113-1123 (2019).
  24. Liu, B. C., Tang, T. T., Lv, L. L., Lan, H. Y. Renal tubule injury: a driving force toward chronic kidney disease. Kidney International. 93 (3), 568-579 (2018).
  25. de Haij, S., Woltman, A. M., Bakker, A. C., Daha, M. R., van Kooten, C. Production of inflammatory mediators by renal epithelial cells is insensitive to glucocorticoids. British Journal of Pharmacology. 137 (2), 197-204 (2002).
  26. Hong, S., Healy, H., Kassianos, A. J. The emerging role of renal tubular epithelial cells in the immunological pathophysiology of lupus nephritis. Frontiers in Immunology. 11, 578952(2020).
  27. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).
  28. See, P., Lum, J., Chen, J., Ginhoux, F. A single-cell sequencing guide for immunologists. Frontiers in Immunology. 9, 2425(2018).
  29. Gewin, L., et al. Deleting the TGF-β receptor attenuates acute proximal tubule injury. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (12), 2001-2011 (2012).
  30. Nlandu-Khodo, S., et al. Blocking TGF-β and β-catenin epithelial crosstalk exacerbates CKD. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3490-3503 (2017).
  31. Brooks, C. R., et al. KIM-1-/TIM-1-mediated phagocytosis links ATG5-/ULK1-dependent clearance of apoptotic cells to antigen presentation. EMBO Journal. 34 (19), 2441-2464 (2015).
  32. Kishi, S., et al. Proximal tubule ATR regulates DNA repair to prevent maladaptive renal injury responses. The Journal of Clinical Investigation. 129 (11), 4797-4816 (2019).
  33. Yu, S. M., Bonventre, J. V. Acute kidney injury and maladaptive tubular repair leading to renal fibrosis. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 29 (3), 310-318 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

TGF

Похожие статьи