Чтобы получить топорное насекомое, его поверхность яйца стерилизуют, а вылупившуюся личинку впоследствии выращивают с помощью акшеновых листьев. Этот метод обеспечивает эффективный способ приготовления аксенических насекомых без введения антибиотиков или разработки искусственной диеты, которая также может быть применена к другим листоядным насекомым.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Подготовка и выращивание топорических насекомых с тканевыми культивируемыми саженцами для исследований взаимодействия микробиоты кишечника хозяина и жука-листоеда
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Кишечник насекомых колонизирован различными бактериями, которые могут глубоко влиять на физиологические черты хозяина. Введение определенного бактериального штамма в аксеническое насекомое является мощным методом проверки микробной функции кишечника и выяснения механизмов, лежащих в основе взаимодействия кишечного микроба и хозяина. Введение антибиотиков или стерилизация поверхностей яиц являются двумя широко используемыми методами удаления кишечных бактерий от насекомых. Однако, в дополнение к потенциальному неблагоприятному воздействию антибиотиков на насекомых, предыдущие исследования показали, что кормление антибиотиками не может устранить кишечные бактерии. Таким образом, искусственные диеты без микробов, как правило, используются для поддержания топорических насекомых, что является утомительным и трудоемким процессом, который не может полностью напоминать питательные компоненты в натуральной пище. Здесь описан эффективный и простой протокол для подготовки и поддержания аксеновых личинок жука-листоеда (Plagiodera versicolora). В частности, поверхности яиц жуков были стерилизованы, после чего листья тополя без микробов использовались для выращивания личинок топоруса. Аксеновый статус насекомых был дополнительно подтвержден с помощью культурозависимых и зависящих от культуры анализов. В совокупности, сочетая дезинфекцию яиц и выращивание без микробов, был разработан эффективный и удобный метод получения аксениса P. versicolora, обеспечивающий легко переносимый инструмент для других листоядных насекомых.
Введение
Подобно млекопитающим, пищеварительный тракт насекомых является полостью для переваривания и всасывания пищи. Большинство насекомых содержат разнообразные комменсальные бактерии, которые процветают в их кишечнике и живут на питании, поставляемом хозяевами1. Комменсальное сообщество кишечника оказывает глубокое влияние на многочисленные физиологические процессы у насекомых, включая переваривание пищи и детоксикацию 2,3,4, питание и развитие 5,6,7, защиту от патогенов и паразитов
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Выращивание насекомых
- Поддерживают популяцию P. versicolora в камере роста при температуре 27 °C и 70 ± относительной влажности 5% при фотопериоде 16 ч света/8 ч темноты. Поместите их в перфорированные пластиковые коробки с мокрой впитывающей бумагой и кормите их свежими ветками тополя. Распыляйте чистую воду на впитывающую бумагу для поддержания влаги и смены ветвей каждые два дня.
- Изолируют взрослых для яйцекладки после окукливания. Кормите их нежными листьями, чтобы получить больше яиц.
- Соберите вновь отложенные яйца (в течение 24 ч). Поместите яйца на влажную впитывающую бумагу на 60 ч, чтобы подготовить л....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Этапы жизни P. versicolora показаны на рисунке 1. Взрослый самец меньше взрослой самки (рисунок 1А). В поле жук группирует свои яйца на листе; здесь четыре яйца были отделены от листа (рисунок 1B). Сегменты стебля тополя и саженцы, используемые для выращивания топорных насекомых, показаны на рисунке 2. Кишечник3-й звездной личинки показан на рисунке 3, а.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Получение свободных от микробов личинок и получение гнотобиотических личинок путем реинтродукции специфических бактериальных штаммов являются мощными методами выяснения механизмов, лежащих в основе взаимодействия хозяина и микроба. Недавно вылупившиеся личинки получают микробиоту кишечника двумя основными способами: вертикальная передача от матери к потомству или горизонтальное приобретение от братьев и сестер и окружающей среды34. Первое может быть выполнено путем родительской передачи потомству .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Благодарности
Эта работа финансировалась Национальным фондом естественных наук Китая (31971663) и Программой спонсорства молодых элитных ученых CAST (2020QNRC001).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,22 & микро; m шприцевые фильтры | Millipore | SLGP033RB | |
| 1 мг/мл стокового раствора | а. Приготовьте 0,1 М раствора NaOH (растворите 0,8 г NaOH в 200 мл дистиллированной воды).<бр/> б. Добавьте 0,2 г NAA в стакан объемом 250 мл, добавьте немного 0,1 М раствора NaOH до полного раствора NAA и отрегулируйте конечный объем до 200 мл дистиллированной водой.<бр/> в. Отфильтруйте раствор для удаления бактерий с помощью 0,22 & микро; m шприцевой фильтр и стерильный шприц объемом 50 мл, расфасовать раствор в центрифужные пробирки объемом 1,5 мл и восстановить при -20°С. | ||
| 1,5 мл микроцентрифужных пробирок | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10x PBS стоковый раствор | Biosharp Life | Sciences BL302A | |
| 2 М раствор | Растворите 22,44 г KOH (молекулярная масса: 56,1) в 200 мл дистиллированной воды и автоклавируйте в течение 20 мин при 121°C. | ||
| Стаканы на 250 мл и 2 000 мл | Shubo | sb16455 | |
| 50 мл стерильные шприцы | Jinta | JT0125789 | |
| 500 мл измерительный цилиндр | Shubo | sb1601 | |
| 50x TAE стоковый раствор | a. Растворите 242 г Tris и 18,612 г ЭДТА в 700 мл дистиллированной воды><. Отрегулируйте pH до 7,8 с добавлением около 57,1 мл уксусной кислоты. c. Отрегулируйте итоговый объем до 1 000 мл.<бр/> день. При использовании исходный раствор разбавляли до 1x буфера TAE. | ||
| 75% этанол | Xingheda trade | ||
| α-нафталин уксусная кислота (NAA) | Solarbio Life Sciences | 86-87-3 | |
| Абсорбирующая бумага | 22,3 см x 15,3 см x 9 см | ||
| Уксусная кислота | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Agar | Coolaber | 9002-18-0 | |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Автоклав | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
| Гомогенизатор для бидинга | Jing Xin | XM-GTL64 | |
| Набор для экстракции ДНК | MP Biomedicals | 116560200 | |
| EDTA | Saiguo Biotech | 1340 | |
| Фильтровальная | бумага Jiaojie | диаметр 70 мм | |
| Установка | для гель-электрофорезаBio-rad | 164-5052 | |
| Гель Сигнал Зеленый краситель нуклеиновых кислот | TsingKe | TSJ003 | |
| Рассада | Шань Синь из Университета Лудун в провинции Шаньдун | ||
| Golden Star Super PCR Master Mix (1,1&раз;) | TsingKe | TSE101 | |
| Камера роста | Жуйхуа | HP400GS-C | |
| LB агаровая среда | a. Растворите 5 г триптона, 5 г NaCl, 2,5 г дрожжевого экстракта в 300 мл дистиллированной воды. b. Отрегулируйте окончательный объем до 500 мл, перелейте раствор в коническую колбу объемом 1 000 мл и добавьте 7,5 г агара c. Автоклав среды в течение 20 мин при 121°C. | ||
| Мини-центрифуга | DRAGONLAB | D1008 | |
| MS основная среда | Coolaber | PM1121-50L | M0245 |
| MS твердая среда для культуры | а. Растворите 4,43 г порошка основной среды MS и 30 г сахарозы в 800 мл дистиллированной воды.<бр/> б. Отрегулируйте рН примерно до 5,8 с 2 М КОН с помощью рН-метра.<бр/> в. Отрегулируйте конечный объем до 1 000 мл, разделить на две части, переложить в две конические колбы по 1 000 мл и добавить 2,6 г агара на 500 мл<бр/> день. Автоклав в течение 20 мин при 121°С. | ||
| Спектрофотометр NanoDrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Paintbrush | шириной 1 см, используется для сбора яиц | ||
| Парапленка | Bemis | PM-996 | |
| PCR Термоамплификаторы | Eppendorf | 6331000076 | |
| чашки Петри | Supin | 90 мм диаметр | |
| pH-метр | METTLER TOLEDO | FE20 | |
| Пипетки 0,2-2 & микро; L | Gilson | ECS000699 | |
| пипетки 100-1,000 &; L | Eppendorf | 3120000267 | |
| дозаторы 20-200 &микро; L | Eppendorf | 3120000259 | |
| пипетки 2-20 & микро; L | Eppendorf | 3120000232 | |
| Контейнер для культуры тканей растений | Chembase | ZP21 | 240 мл |
| Пластиковая коробка | 2,35 л | ||
| Гидроксид калия (KOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Праймеры для амплификации гена бактериальной 16S рРНК | Sangon Biotech | 27-F: 5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3', 1492R: 5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3' | |
| Хлорид натрия (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Гидроксид натрия (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Стальные шарики | 0,25 мм | , используемые для измельчения тканей | |
| Стереомикроскоп | OLYMPUS | SZ61 | |
| Сахароза | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Trans2K plus II DNA маркер | Transgene Biotech | BM121-01 | |
| Трис база | Biosharp Life Sciences | 1115 | |
| Триптон | Thermo Fisher Scientific | LP0037 | |
| УФ-трансиллюминатор | Monad Biotech | QuickGel 6100 | |
| Vortexer | Scilogex | MX-S | |
| Ветки | Парк озера Ша, Ухань, Китай | ||
| Ивовый листоед | Хуачжунский сельскохозяйственный университет, Ухань, Китай | ||
| Экстракт дрожжей | Thermo Fisher Scientific | LP0021 |
Ссылки
- Moran, N. A., Ochman, H., Hammer, T. J. Evolutionary and ecological consequences of gut microbial communities. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 50 (1), 451-475 (2019).
- Warnecke, F., et al. M....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
