Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Подготовка и выращивание топорических насекомых с тканевыми культивируемыми саженцами для исследований взаимодействия микробиоты кишечника хозяина и жука-листоеда

3.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63195

⸱

8 октября 2021 г.

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Biocatalysis and Enzyme Engineering, School of Life Sciences, Hubei University, 2Institute of Plant Protection, Wuhan Institute of Landscape Architecture, 3McKetta Department of Chemical Engineering, University of Texas at Austin

В этой статье

Краткое содержание

Чтобы получить топорное насекомое, его поверхность яйца стерилизуют, а вылупившуюся личинку впоследствии выращивают с помощью акшеновых листьев. Этот метод обеспечивает эффективный способ приготовления аксенических насекомых без введения антибиотиков или разработки искусственной диеты, которая также может быть применена к другим листоядным насекомым.

Аннотация

Кишечник насекомых колонизирован различными бактериями, которые могут глубоко влиять на физиологические черты хозяина. Введение определенного бактериального штамма в аксеническое насекомое является мощным методом проверки микробной функции кишечника и выяснения механизмов, лежащих в основе взаимодействия кишечного микроба и хозяина. Введение антибиотиков или стерилизация поверхностей яиц являются двумя широко используемыми методами удаления кишечных бактерий от насекомых. Однако, в дополнение к потенциальному неблагоприятному воздействию антибиотиков на насекомых, предыдущие исследования показали, что кормление антибиотиками не может устранить кишечные бактерии. Таким образом, искусственные диеты без микробов, как правило, используются для поддержания топорических насекомых, что является утомительным и трудоемким процессом, который не может полностью напоминать питательные компоненты в натуральной пище. Здесь описан эффективный и простой протокол для подготовки и поддержания аксеновых личинок жука-листоеда (Plagiodera versicolora). В частности, поверхности яиц жуков были стерилизованы, после чего листья тополя без микробов использовались для выращивания личинок топоруса. Аксеновый статус насекомых был дополнительно подтвержден с помощью культурозависимых и зависящих от культуры анализов. В совокупности, сочетая дезинфекцию яиц и выращивание без микробов, был разработан эффективный и удобный метод получения аксениса P. versicolora, обеспечивающий легко переносимый инструмент для других листоядных насекомых.

Введение

Подобно млекопитающим, пищеварительный тракт насекомых является полостью для переваривания и всасывания пищи. Большинство насекомых содержат разнообразные комменсальные бактерии, которые процветают в их кишечнике и живут на питании, поставляемом хозяевами1. Комменсальное сообщество кишечника оказывает глубокое влияние на многочисленные физиологические процессы у насекомых, включая переваривание пищи и детоксикацию 2,3,4, питание и развитие 5,6,7, защиту от патогенов и паразитов 8,9,10,11, химическую связь 12,13 и поведение14 ,15. Интересно, что некоторая микробиота кишечника может быть факультативно патогенной или манипулироваться путем вторжения патогенов для усугубления инфекции, что указывает на то, что кишечные бактерии могут быть вредными в некоторых случаях 16,17,18. Кишечные бактерии также могут служить микробным ресурсом для биотехнических применений и борьбы с вредителями. Например, переваривающие лигноцеллюлозу бактерии из фитофаговых и ксилофаговых насекомых использовались для переваривания растительных клеток для разработки биотоплива19. Рассеивание инженерных кишечных симбионтов, экспрессирующих биологически активные молекулы, является новой и многообещающей тактикой для борьбы с вредителями сельского и лесного хозяйства и комарами, передающими инфекционные заболевания 19,20,21, которые также могут быть использованы для улучшения приспособленности полезных насекомых 22. Таким образом, иллюстрация того, как кишечная бактерия ведет себя in vivo, считается приоритетом для полного использования ее функции и дальнейшего использования ее для различных применений.

Животные могут содержать от 1 до >1000 симбиотических микробных видов в кишечнике1. В результате трудно точно проверить, как отдельные бактериальные таксоны или их сборка работают внутри животного, и управляет ли хозяин или его микробные партнеры определенной функцией. Поэтому для исследования бактериальной функции и взаимодействия с насекомыми23 необходима подготовка аксеневых личинок к получению гнотобиотических насекомых путем моно- или многовидовой колонизации. В настоящее время введение антибиотических коктейлей и стерилизация поверхности яиц насекомых являются распространенными методами удаления кишечных бактерий 14,24,25,26. Однако антибиотические диеты не могут полностью устранить кишечные бактерии и оказывают негативное влияние на физиологию насекомых-хозяев27,28. Следовательно, использование обработанных антибиотиками насекомых может скрыть истинные способности некоторых кишечных бактерий. К счастью, поверхностная стерилизация яиц может свести на нет эту проблему23,29, которая не оказывает никакого или незначительного воздействия на экспериментальных насекомых. Кроме того, искусственные диеты не могут полностью напоминать натуральную пищу от насекомых, а разработка искусственной диеты является дорогостоящим и трудоемким процессом30,31.

Жук-листоед ивы, Plagiodera versicolora (Laicharting) (Coleoptera: Chrysomelidae), является широко распространенным листоядным вредителем, который в основном питается слюнными деревьями, такими как ива (Salix) и тополь (Populus L.) 32,33. Здесь жук-листоед ивы использовался в качестве представителя листоядного насекомого для разработки протокола подготовки и выращивания насекомого без микробов. Мы использовали культуру растительной ткани для получения листьев тополя без микробов для выращивания личинок P. versicolora axenic из стерилизованных яиц. Аксеновый статус личинок P. versicolora был проверен с помощью культурозависимых и зависящих от культуры анализов. Этот протокол может поддерживать акшенических насекомых, которые лучше имитируют дикие условия, чем выращивание насекомых с искусственной диетой. Что еще более важно, этот метод удобен при очень низкой стоимости, что повышает целесообразность получения аксеневых насекомых для будущих исследований взаимодействия микробиоты насекомых и кишечника, особенно для немодальных насекомых без хорошо разработанных искусственных диет.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Выращивание насекомых

  1. Поддерживают популяцию P. versicolora в камере роста при температуре 27 °C и 70 ± относительной влажности 5% при фотопериоде 16 ч света/8 ч темноты. Поместите их в перфорированные пластиковые коробки с мокрой впитывающей бумагой и кормите их свежими ветками тополя. Распыляйте чистую воду на впитывающую бумагу для поддержания влаги и смены ветвей каждые два дня.
  2. Изолируют взрослых для яйцекладки после окукливания. Кормите их нежными листьями, чтобы получить больше яиц.
  3. Соберите вновь отложенные яйца (в течение 24 ч). Поместите яйца на влажную впитывающую бумагу на 60 ч, чтобы подготовить личинки аксении.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Недавно отложенные яйца вылупятся через ~ 72 ч. Лучшее время для стерилизации поверхностей яиц – за день до вылупления; в противном случае количество успешно вылупившихся яиц уменьшится.

2. Культивирование тополя без зародышей

  1. Готовят мурашиге и скуг (МС) среды и 1 мг/мл α-нафталиновой уксусной кислоты (NAA) (см. Таблицу материалов).
  2. В капсуле биобезопасности добавьте 50 мкл 1 мг/мл раствора NAA к 500 мл среды MS, встряхните, чтобы хорошо перемешать, и насыпьте ~ 50 мл на контейнер для культуры ткани и дождитесь затвердевания.
  3. Приготовьте скальпели, спиртовую лампу и щипцы; стерилизуйте скальпели и щипцы в пламя спиртовой лампы в вытяжке биобезопасности.
  4. Срезайте 3-4 см стеблевые сегменты с верхушечными почками или боковыми почками из рассады тополя на ~1 месяц роста (рассада без зародышей, культивируемая тканью) и вставляйте их в культуральную среду, по одному или двум стеблевым сегментам на контейнер.
  5. Инкубируют эти сегменты стебля в камере роста при 25 °C и 50 ± интенсивностью света 10 кд с фотопериодом 16 ч света / 8 ч темной в течение примерно 30 дней. Используйте листья без зародышей, чтобы накормить личинок топоруса.

3. Стерилизация поверхности яйца и выращивание топорных личинок

  1. Автоклавные чашки Петри, кисти, фильтровальная бумага, дистиллированная вода и чашка Петри, содержащая агаровую среду LB (Luria-Bertani).
  2. Поместите листья с прилипшими яйцами в чашку Петри, аккуратно извлеките яйца из листьев с помощью щипцов и перенесите их в другую чашку Петри.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг следует выполнять очень осторожно, потому что яйца прилипают к листьям.
  3. Вымойте эти яйца 75% этанолом в течение 8 мин, и повторите промывку четыре раза стерильной водой.
  4. Переложите яйца на агаровую среду LB, чтобы сохранить влагу для вылупления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование агаровой среды LB может помочь проверить, не содержит ли продезинфицированное яйцо микробов.
  5. Поместите чашку Петри в камеру роста и подождите, пока яйца вылупятся в течение 24 часов.
  6. В вытяжке биобезопасности выложите три куска влажной фильтровальной бумаги в чашку Петри, поместите на бумагу листья тополя без микробов, соберите личинки и поместите их на листья, запечатайте чашку Петри парапленкой и высиживают их в камере роста при 27 ° C и 70 ± 5% относительной влажности с фотопериодом 16 ч света / 8 ч темноты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выращенные в тканях листья нежные и могут быстро терять воду. Таким образом, использование влажной фильтровальной бумаги необходимо при переносе листьев на чашку Петри.
  7. Меняйте листья каждые два дня.
  8. Для традиционно выращенных групп перенесите яйца из листьев в чашку Петри, содержащую влажную фильтровальную бумагу, и кормите этих личинок листьями тополя без микробов.

4. Верификация личинок аксеновых с помощью культурозависимых анализов

  1. Случайным образом выберите трех1-х,2-х и3-х звездных личинок из свободных от микробов и традиционно выращенных групп.
  2. Рассекните личинок3-й звезды стерильными ножницами и щипцами под стереомикроскопом и соберите их кишки в микроцентрифужные трубки. Собирайте неповрежденных личинок1-й и2-й звезды в трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соберите целые личинки1-й и2-й звезды, так как они слишком малы, чтобы рассекать, и сохраните их кишки нетронутыми.
  3. Добавьте 100 мкл фосфатно-буферного физиологического раствора и три стальных шарика в пробирки по 1,5 мл и измельчите ткани в гомогенаты с помощью гомогенизатора, взбивающего шарики.
  4. Добавьте 100 мкл гомогената в агаровую среду LB и пластину с помощью стерильного стеклянного разбрасывающего стержня.
  5. Поместите пластины при 37 °C в течение 24 ч и наблюдайте за бактериальными колониями.

5. Верификация аксенических индивидов с помощью культурозависимых анализов

  1. Извлеките общую ДНК тканей (полученную в разделе 4) с помощью набора для экстракции ДНК.
  2. Измерьте концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра при 260 нм.
  3. Амплифицируйте бактериальный ген 16S рРНК с помощью универсальных праймеров 16S рРНК с ПЦР. Настройте реакционную систему с 18 мкл 1,1x ПЦР-мастер-микса (см. Таблицу материалов), 0,5 мкл праймера 27F (5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3'), 0,5 мкл праймера 1495R (5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3') и 100 нг шаблонной ДНК. Установите условия ПЦР при 95 °C в течение 3 мин; 28 циклов при 95 °C в течение 30 с, 55 °C в течение 1 мин и 72 °C в течение 1 мин; затем 72 °C в течение 10 мин. Хранить продукты ПЦР при температуре 4 °C до дальнейшего анализа.
  4. Смешайте продукты ПЦР с красителем нуклеиновых кислот и проанализируйте их с помощью электрофореза на 1% агарозном геле в 1x буфере TAE. Используйте 10 мкл ДНК-маркера в качестве эталона.
  5. Понаблюдайте за гелем с помощью УФ-трансиллюминатора и найдите целевой фрагмент около 1 500 bp.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этапы жизни P. versicolora показаны на рисунке 1. Взрослый самец меньше взрослой самки (рисунок 1А). В поле жук группирует свои яйца на листе; здесь четыре яйца были отделены от листа (рисунок 1B). Сегменты стебля тополя и саженцы, используемые для выращивания топорных насекомых, показаны на рисунке 2. Кишечник3-й звездной личинки показан на рисунке 3, а...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Получение свободных от микробов личинок и получение гнотобиотических личинок путем реинтродукции специфических бактериальных штаммов являются мощными методами выяснения механизмов, лежащих в основе взаимодействия хозяина и микроба. Недавно вылупившиеся личинки получают микробиоту кишечника двумя основными способами: вертикальная передача от матери к потомству или горизонтальное приобретение от братьев и сестер и окружающей среды34. Первое может быть выполнено путем родительской передачи потомству ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

Эта работа финансировалась Национальным фондом естественных наук Китая (31971663) и Программой спонсорства молодых элитных ученых CAST (2020QNRC001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,22 & микро; m шприцевые фильтрыMilliporeSLGP033RB
1 мг/мл стокового раствораа. Приготовьте 0,1 М раствора NaOH (растворите 0,8 г NaOH в 200 мл дистиллированной воды).<бр/> б. Добавьте 0,2 г NAA в стакан объемом 250 мл, добавьте немного 0,1 М раствора NaOH до полного раствора NAA и отрегулируйте конечный объем до 200 мл дистиллированной водой.<бр/> в. Отфильтруйте раствор для удаления бактерий с помощью 0,22 & микро; m шприцевой фильтр и стерильный шприц объемом 50 мл, расфасовать раствор в центрифужные пробирки объемом 1,5 мл и восстановить при -20°С.
1,5 мл микроцентрифужных пробирокSangon BiotechF600620
10x PBS стоковый растворBiosharp LifeSciences BL302A
2 М растворРастворите 22,44 г KOH (молекулярная масса: 56,1) в 200 мл дистиллированной воды и автоклавируйте в течение 20 мин при 121°C.
Стаканы на 250 мл и 2 000 млShubosb16455
50 мл стерильные шприцыJintaJT0125789
500 мл измерительный цилиндрShubosb1601
50x TAE стоковый растворa.  Растворите 242 г Tris и 18,612 г ЭДТА в 700 мл дистиллированной воды><. Отрегулируйте pH до 7,8 с добавлением около 57,1 мл уксусной кислоты.
c. Отрегулируйте итоговый объем до 1 000 мл.<бр/> день. При использовании исходный раствор разбавляли до 1x буфера TAE.
75% этанолXingheda trade
α-нафталин уксусная кислота (NAA)Solarbio Life Sciences86-87-3
Абсорбирующая бумага22,3 см x 15,3 см x 9 см
Уксусная кислотаSinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
AgarCoolaber9002-18-0
AgaroseBiowest111860
АвтоклавPanasonicMLS-3781L-PC
Гомогенизатор для бидингаJing XinXM-GTL64
Набор для экстракции ДНКMP Biomedicals116560200
EDTASaiguo Biotech1340
Фильтровальнаябумага Jiaojieдиаметр 70 мм
Установкадля гель-электрофорезаBio-rad164-5052
Гель Сигнал Зеленый краситель нуклеиновых кислотTsingKeTSJ003
РассадаШань Синь из Университета Лудун в провинции Шаньдун
Golden Star Super PCR Master Mix (1,1&раз;)TsingKeTSE101
Камера ростаЖуйхуаHP400GS-C
LB агаровая средаa. Растворите 5 г триптона, 5 г NaCl, 2,5 г дрожжевого экстракта в 300 мл дистиллированной воды.
b. Отрегулируйте окончательный объем до 500 мл, перелейте раствор в коническую колбу объемом 1 000 мл и добавьте 7,5 г агара
c. Автоклав среды в течение 20 мин при 121°C.
Мини-центрифугаDRAGONLABD1008
MS основная средаCoolaberPM1121-50LM0245
MS твердая среда для культурыа. Растворите 4,43 г порошка основной среды MS и 30 г сахарозы в 800 мл дистиллированной воды.<бр/> б. Отрегулируйте рН примерно до 5,8 с 2 М КОН с помощью рН-метра.<бр/> в. Отрегулируйте конечный объем до 1 000 мл, разделить на две части, переложить в две конические колбы по 1 000 мл и добавить 2,6 г агара на 500 мл<бр/> день. Автоклав в течение 20 мин при 121°С.
Спектрофотометр NanoDrop 1000Thermo Fisher Scientific
Paintbrushшириной 1 см, используется для сбора яиц
ПарапленкаBemisPM-996
PCR ТермоамплификаторыEppendorf6331000076
чашки ПетриSupin90 мм диаметр
pH-метрMETTLER TOLEDOFE20
Пипетки 0,2-2 & микро; LGilsonECS000699
пипетки 100-1,000 &; LEppendorf3120000267
дозаторы 20-200 &микро; LEppendorf3120000259
пипетки 2-20 & микро; LEppendorf3120000232
Контейнер для культуры тканей растенийChembaseZP21240 мл
Пластиковая коробка2,35 л
Гидроксид калия (KOH)Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Праймеры для амплификации гена бактериальной 16S рРНКSangon Biotech27-F: 5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3', 1492R: 5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3'
Хлорид натрия (NaCl)Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Гидроксид натрия (NaOH)Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Стальные шарики0,25 мм, используемые для измельчения тканей
СтереомикроскопOLYMPUSSZ61
СахарозаSinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Trans2K plus II DNA маркерTransgene BiotechBM121-01
Трис базаBiosharp Life Sciences1115
ТриптонThermo Fisher Scientific  LP0037
УФ-трансиллюминаторMonad BiotechQuickGel 6100
VortexerScilogexMX-S
ВеткиПарк озера Ша, Ухань, Китай
Ивовый листоедХуачжунский сельскохозяйственный университет, Ухань, Китай
Экстракт дрожжейThermo Fisher ScientificLP0021
NAA KOH тополя без микробов рассады тополя без микробов ивы

Ссылки

  1. Moran, N. A., Ochman, H., Hammer, T. J. Evolutionary and ecological consequences of gut microbial communities. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 50 (1), 451-475 (2019).
  2. Warnecke, F., et al. Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite. Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).
  3. Tokuda, G., et al. Fiber-associated spirochetes are major agents of hemicellulose degradation in the hindgut of wood-feeding higher termites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 11996-12004 (2018).
  4. Wang, G. H., et al. Changes in microbiome confer multigenerational host resistance after sub-toxic pesticide exposure. Cell Host & Microbe. 27 (2), 213-224 (2020).
  5. Shin, S. C., et al. Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling. Science. 334 (6056), 670-674 (2011).
  6. Storelli, G., et al. Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing. Cell Metabolism. 14 (3), 403-414 (2011).
  7. Salem, H., et al. Vitamin supplementation by gut symbionts ensures metabolic homeostasis in an insect host. Proceedings. Biological Sciences. 281 (1796), 20141838(2014).
  8. Koch, H., Schmid-Hempel, P. Socially transmitted gut microbiota protect bumble bees against an intestinal parasite. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19288-19292 (2011).
  9. Cirimotich, C. M., et al. Natural microbe-mediated refractoriness to Plasmodium infection in Anopheles gambiae. Science. 332 (6031), 855-858 (2011).
  10. Kaltenpoth, M., Gottler, W., Herzner, G., Strohm, E. Symbiotic bacteria protect wasp larvae from fungal infestation. Current Biology. 15 (5), 475-479 (2005).
  11. Yuan, C., Xing, L., Wang, M., Hu, Z., Zou, Z. Microbiota modulates gut immunity and promotes baculovirus infection in Helicoverpa armigera. Insect Science. , (2021).
  12. Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. Pheromones - Exploitation of gut bacteria in the locust. Nature. 403 (6772), 851(2000).
  13. Xu, L. T., Lou, Q. Z., Cheng, C. H., Lu, M., Sun, J. H. Gut-associated bacteria of Dendroctonus valens and their involvement in verbenone production. Microbial Ecology. 70 (4), 1012-1023 (2015).
  14. Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402-406 (2018).
  15. Jia, Y., et al. Gut microbiome modulates Drosophila aggression through octopamine signaling. Nature Communications. 12 (1), 2698(2021).
  16. Ma, M., et al. Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels. Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).
  17. Xu, L., et al. Synergistic action of the gut microbiota in environmental RNA interference in a leaf beetle. Microbiome. 9 (1), 98(2021).
  18. Xu, L., et al. Gut microbiota in an invasive bark beetle infected by a pathogenic fungus accelerates beetle mortality. Journal of Pest Science. 92, 343-351 (2019).
  19. Berasategui, A., Shukla, S., Salem, H., Kaltenpoth, M. Potential applications of insect symbionts in biotechnology. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (4), 1567-1577 (2016).
  20. Tikhe, C. V., Martin, T. M., Howells, A., Delatte, J., Husseneder, C. Assessment of genetically engineered Trabulsiella odontotermitis as a 'Trojan Horse' for paratransgenesis in termites. BMC Microbiology. 16 (1), 202(2016).
  21. Wang, S., et al. Fighting malaria with engineered symbiotic bacteria from vector mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12734-12739 (2012).
  22. Leonard, S. P., et al. Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens. Science. 367 (6477), 573-576 (2020).
  23. Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. Generating germ-free Drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions. Current Protocols in Toxicology. 77 (1), 52(2018).
  24. Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).
  25. Correa, M. A., Matusovsky, B., Brackney, D. E., Steven, B. Generation of axenic Aedes aegypti demonstrate live bacteria are not required for mosquito development. Nature Communications. 9 (1), 4464(2018).
  26. Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions. Nature Communications. 12 (1), 942(2021).
  27. Berasategui, A., et al. Gut microbiota of the pine weevil degrades conifer diterpenes and increases insect fitness. Molecular Ecology. 26 (15), 4099-4110 (2017).
  28. Lin, X. L., Kang, Z. W., Pan, Q. J., Liu, T. X. Evaluation of five antibiotics on larval gut bacterial diversity of Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae). Insect Science. 22 (5), 619-628 (2015).
  29. Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y., Shi, Z. Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies. Bio-protocol. 9 (24), 3456(2019).
  30. Gelman, D. B., Bell, R. A., Liska, L. J., Hu, J. S. Artificial diets for rearing the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata. Journal of Insect Science. 1, 7(2001).
  31. Bengtson, D. A. A comprehensive program for the evaluation of artificial diets. Journal of the World Aquaculture Society. 24 (2), 285-293 (2007).
  32. Utsumi, S., Ando, Y., Ohgushi, T. Evolution of feeding preference in a leaf beetle: the importance of phenotypic plasticity of a host plant. Ecology Letters. 12 (9), 920-929 (2009).
  33. Ishihara, M., Ohgushi, T. Reproductive inactivity and prolonged developmental time induced by seasonal decline in host plant quality in the willow leaf beetle Plagiodera versicolora (Coleoptera: Chrysomelidae). Environmental Entomology. 35 (2), 524-530 (2006).
  34. Bright, M., Bulgheresi, S. A complex journey: transmission of microbial symbionts. Nature Reviews: Microbiology. 8 (3), 218-230 (2010).
  35. Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae. Frontiers in Microbiology. 11, 596352(2020).
  36. Hosokawa, T., et al. Obligate bacterial mutualists evolving from environmental bacteria in natural insect populations. Nature Microbiology. 1, 15011(2016).
  37. Habineza, P., et al. The promoting effect of gut microbiota on growth and development of red palm weevil, Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) by modulating its nutritional metabolism. Frontiers in Microbiology. 10, 1212(2019).
  38. Meilan, R., Ma, C. Poplar (Populus spp.). Methods in Molecular Biology. 344, Clifton, N.J. 143-151 (2006).
  39. Wani, Z. A., Ashraf, N., Mohiuddin, T., Riyaz-Ul-Hassan, S. Plant-endophyte symbiosis, an ecological perspective. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (7), 2955-2965 (2015).
  40. Grout, B. W. Meristem-tip culture. Methods in Molecular Biology. 6, Clifton, N.J. 81-91 (1990).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Культивирование тканейстерилизация поверхности яицбезмикробные личинкипроростки тополявзаимодействие хозяина и микробаПЦР 16S рРНКбактериальная колонизация
Подготовка и выращивание топорических насекомых с тканевыми культивируемыми саженцами для исследований взаимодействия микробиоты кишечника хозяина и жука-листоеда
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.