Методическая статья

Количественная оценка полимеразной цепной реакции в режиме реального времени экспрессии микроРНК в почках и сыворотке мышей с возрастной почечной недостаточностью

DOI:

10.3791/63258

⸱

29 апреля 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 2Division of Intensive Care Unit, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 3Department of Medical Physiology, Meiji Pharmaceutical University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представлен метод оценки экспрессии микроРНК в почках и сыворотке мышей с возрастной почечной недостаточностью методом количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

МикроРНК (миРНК) представляют собой небольшие, некодирующие РНК, состоящие из 21-25 оснований. Они не переводятся в белки, а скорее работают, чтобы препятствовать функционированию своих целевых мессенджерных РНК (мРНК), дестабилизируя их и нарушая их трансляцию. Хотя были исследованы профили экспрессии миРНК в различных органах и тканях мышей, не было стандартных методов очистки и количественной оценки миРНК почек и сыворотки мыши. Мы установили эффективный и надежный метод извлечения и оценки экспрессии миРНК в сыворотке и почках мышей с возрастной почечной недостаточностью.

Метод использует количественную обратную транскрипцию-полимеразную цепную реакцию (qRT-PCR), и протокол требует шести этапов: (1) подготовка мышей с ускоренным сопротивлением старению 1 (SAMR1) и мышей, склонных к старению (SAMP1); (2) извлечение образцов сыворотки из этих мышей; (3) извлечение образца почки из каждой мыши; (4) извлечение общей РНК (включая миРНК) из образцов почек и сыворотки крови каждой мыши; (5) синтез комплементарной ДНК (кДНК) с обратной транскрипцией из миРНК; (6) проведение qRT-PCR с использованием полученной кДНК.

Этот протокол был использован для подтверждения того, что по сравнению с контрольной группой экспрессия miRNA-7218-5p и miRNA-7219-5p была значительно изменена в почках и сыворотке мышиной модели возрастной почечной недостаточности. Этот протокол также прояснил взаимосвязь между почкой и сывороткой мышиной модели возрастной почечной недостаточности. Этот протокол может быть использован для определения экспрессии миРНК в почках и сыворотке мышей с возрастной почечной недостаточностью.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Известно, что экспрессия различных мРНК, которые играют важную роль как в физиологии, так и в заболевании (например, воспаление, фиброз, метаболические нарушения и рак), регулируется миРНК, которые являются короткими, некодирующими РНК, которые вызывают деградацию и ингибируют транскрипцию мРНК1. Поэтому возможно, что некоторые микроРНК могут служить новыми кандидатами-биомаркерами и/или терапевтическими мишенями для различных заболеваний 2,3,4,5. Были проведены исследования профилей экспрессии миРНК в различных органах и тканях мышей (включая мозг6, сердце7, легкие8, печень9 и почки10). Однако не существует стандартных или установленных методов извлечения и оценки миРНК в почках или сыворотке мышей с возрастной почечной недостаточностью.

Поэтому мы установили протокол, который можно использовать для надежной очистки и обнаружения экспрессии миРНК в сыворотке и почках мышей с возрастной почечной недостаточностью. Протокол состоит из шести основных этапов: (1) подготовка как 50-недельных самцов мышей SAMR1, так и самцов мышей SAMP1; (2) извлечение образцов крови из нижней полой вены обоих штаммов мышей с последующим использованием шпицевой трубки с гепарином с последующим центрифугированием для получения образца сыворотки; (3) извлечение образца почки из мышей - гомогенизатор кремния используется для гомогенизации образца почки отдельно, и образец затем переносят в систему измельчения биополимеров на спиновой колонке11 микроцентрифуги; (4) извлечение общей РНК (содержащей миРНК) из образцов сыворотки с использованием спиновой колонки12 на основе мембраны кремнезема и полной РНК, содержащей миРНК, экстракции из образцов почек с использованием спиновой колонки11 на основе мембраны кремнезема; (5) синтез комплементарной ДНК (кДНК) из общей РНК с использованием обратной транскриптазы, поли(А) полимеразы и олиго-dT праймера13,14; и (6) наконец, определение экспрессии миРНК с помощью qRT-PCR и интеркалирующего красителя13,14.

Этот новый протокол был основан на исследованиях, которые преуспели в извлечении и оценке микроРНК в различных типах тканей 11,12,13. Было продемонстрировано, что система измельчения биополимеров протокола способна очищать высококачественную общую РНК из тканей11. Точность и чувствительность аспектов этого протокола, используемых для оценки экспрессии миРНК методом qRT-PCR с интеркалирующим красителем, были установлены 13,14, например, синтез кДНК с обратной транскриптазой, поли(А)полимеразой и олиго-dT праймерами из экстрагированной общей РНК. Новый протокол имеет ряд преимуществ: простоту, экономию времени и снижение технических ошибок. Таким образом, он может быть использован для исследований, которые требуют точной и чувствительной идентификации профилей миРНК почек и сыворотки. Исследования многих патологических состояний также могут использовать новый протокол.

Профили экспрессии миРНК у мышей SAMP1, которые являются моделью возрастной почечной недостаточности, могут быть определены, как показано ниже. У человека возрастно-зависимая почечная недостаточность связана с прогрессированием почечной недостаточности и характеризуется как увеличением площади почечного интерстициального фиброза, так и прогрессированием гломерулосклероза15,16. Возрастная почечная недостаточность также является важной и частой особенностью хронической болезни почек и терминальной стадии почечной недостаточности15,16.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экспериментальный протокол был одобрен Комитетом по этике животных Медицинского университета Джичи и выполнен в соответствии с Руководством Медицинского университета Джичи для лабораторных животных и его руководящими принципами, касающимися использования и ухода за экспериментальными животными. Этот протокол использует четырех 50-недельных самцов мышей SAMR1 и самцов мышей SAMP1 (40-45 г).

1. Отбор образцов сыворотки

  1. Подготовьте для каждой мыши следующее: иглы 30 г со шприцем 1,0 мл, центрифугированную трубку шпица 1,0 мл с гепарином, микроцентрифужные трубки 1,5 мл, анестетик изофлуран, пробковый лист, 70% этанол, два ватных тампона, смоченных фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS), чашку Петри с PBS, пинцет и хирургические ножницы.
  2. Обезболивают мышь 1,5% изофлураном и поддерживают на уровне 1,5%. Введите анальгетик (Мелоксикам 5 мг/кг) подкожно, затем введите 1,0 мл 70% этанола в брюшную полость и поместите его в лежачее положение на пробковом листе.
  3. Подтверждают глубину анестезии исчезновением рефлекса снятия педали. Пинцетом и хирургическими ножницами разрезают кожу живота. Отрежьте мышцы и брюшинную оболочку от мочевого пузыря до нижнего левого края ребер.
  4. Используйте пинцет, чтобы поднять перитонеальную мембрану, и сделайте боковой разрез в верхнем крае перитонеальной мембраны хирургическими ножницами. Продолжайте разрез вдоль нижнего края ребер.
  5. Определите нижнюю полую вену с помощью двух увлажненных PBS ватных тампонов. Вставьте одну из игл 30 Г со шприцем 1,0 мл в нижнюю полую вену, а затем потяните шприц. Медленно вытащите иглу из нижней полой вены, чтобы избежать гемолиза. Перенесите кровь в 1,0 мл шпицевой трубки с гепарином, а затем перемешайте ее, перевернув трубку несколько раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь подвергается эвтаназии при вывихе шейки матки.
  6. Раскрутите трубку шпица при комнатной температуре (RT), 3000 × г в течение 10 мин.
  7. Медленно аспирируйте супернатант, убедитесь, что он не содержит осадка, а затем перенесите его в неиспользуемую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
  8. Храните тюбик при температуре −80 °C перед использованием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При немедленном переходе к этапу 3 трубку нет необходимости хранить при температуре −80 °C.

2. Забор проб почек

  1. Приготовьте для каждой мыши следующее: криотрубки объемом 2,0 мл, анестетик изофлуран, пробковый лист, 70% этанола, чашку Петри с PBS, пинцет и хирургические ножницы.
  2. Обезболивают мышь 1,5% изофлураном и поддерживают на уровне 1,5%. Введите анальгетик (Мелоксикам 5 мг / кг) подкожно, затем введите 1,0 мл 70% этанола в его брюшную полость и поместите его в лежачее положение на пробковом листе.
  3. Подтверждают глубину анестезии исчезновением рефлекса снятия педали. Используйте пинцет и хирургические ножницы, чтобы сделать разрез в коже живота. Отрежьте мышцы и брюшинную оболочку от мочевого пузыря до нижнего левого края ребер.
  4. Используйте пинцет, чтобы поднять перитонеальную мембрану и сделать боковой разрез в верхнем крае брюшинной мембраны хирургическими ножницами. Продолжайте разрез вдоль нижнего края ребер.
  5. Определите левую почку. Рефлюкс его с PBS для промывки крови из сосудов до тех пор, пока почка не приобретет желтовато-белый цвет. Сначала иссекните всю почку с помощью хирургических ножниц, чтобы разорвать левую почечную артерию и вену. Поместите почку в чашку Петри и тщательно вымойте ее с помощью PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь подвергается эвтаназии при вывихе шейки матки.
  6. Используйте пинцет и хирургические ножницы, чтобы разрезать почку на образцы 10 мг (10 мг - подходящий размер образца для следующего этапа). Поместите каждый образец почки в свою собственную криотрубу объемом 2,0 мл. Закройте крышку трубки.
  7. Для длительного хранения переложите каждую криотрубу в жидкий азот и храните ее при −80 °C.

3. Полное извлечение РНК из образца сыворотки

  1. Сначала подготовьте следующие продукты: вихревой смеситель, реагент лизиса на основе фенола/ гуанидина, 80% этанол, 100% этанол, 100% хлороформ, спиновые колонки биополимера (в коллекторных трубках2,0 мл 11), мембранно-закрепленные спиновые колонны (в трубках сбора11 2,0 мл), промывочный буфер No 1 (т.е. буфер промывки, содержащий гуанидин и 100% этанол в соотношении 1:2), буфер промывки No 2 (т.е. промывочный буфер, содержащий гуанидин и 100% этанол в соотношении 1:4), воду без РНКазы, микроцентрифужные трубки 1,5 мл и микроцентрифужные трубки 2,0 мл.
  2. Сначала возьмите образец сыворотки объемом 200 мкл в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл, а затем добавьте 1000 мкл реагента лизиса на основе фенола / гуанидина. Вихрь смеси в течение 5 с.
  3. Инкубируйте образец на RT в течение 5 мин.
  4. Добавьте 200 мкл хлороформа к образцу сыворотки в пробирке и плотно закройте крышку пробирки. Инвертируйте пробирку 15x, чтобы смешать хлороформ и образец сыворотки.
  5. Каждый образец инкубируется на RT в течение 3 мин. Затем открутите образец при 4 °C в течение 15 мин при 12 000 х г.
  6. Перенесите 300 мкл супернатанта в новую микроцентрифужную трубку емкостью 1,5 мл, не нарушая гранулу. Добавьте 450 мкл 100% этанола и вращайте трубку в течение 5 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На всех следующих этапах поместите мембранно-закрепленную спиновую колонну для разделения РНК и ДНК в пробирку для сбора 2,0 мл, чтобы центрифугировать ее.
  7. Затем извлеките 700 мкл образца, загрузите его на спиновую колонну с мембранным креплением и закройте колпачок. Раскрутите колонку при RT в течение 15 с при 8000 × g и оставьте супернатант в колонке. Выбросьте гранулы, оставшиеся в коллекционной трубке.
  8. Добавьте 700 мкл промывочного буфера No1, который является частью набора сыворотки/плазмы (см. Таблицу материалов) в мембранную спиновую колонну для тщательной очистки образца. Закройте крышку столбца и раскрутите столбец на RT в течение 15 с при 8000 × g, и оставьте супернатант в столбце. Выбросьте гранулы, оставшиеся в коллекционной трубке.
  9. Для удаления следов солей возьмите 500 мкл промывочного буфера No2 и загрузите его на мембранно-закрепленную спиновую колонну. После закрытия колпачка колонки раскрутите колонку на RT в течение 15 с при 8000 × g и оставьте супернатант в колонке. Выбросьте гранулу в коллекционную трубку.
  10. Для удаления следов солей возьмите 500 мкл 80% этанола и загрузите его на мембранную спиновую колонну. После закрытия колпачка колонки раскрутите колонку на RT в течение 15 с при 8000 × g и оставьте супернатант в колонке. Выбросьте гранулу в коллекционную трубку.
  11. Снова раскрутите спиновую колонну с мембранным креплением при RT в течение 5 мин при 15 000 × г.
  12. После переноса спиновой колонны с мембранным креплением в новую коллекторную трубку объемом 1,5 мл добавьте в колонну 14 мкл войны без РНКазы, чтобы растворить общую РНК. После закрытия крышки колонны подождите 5 мин, оставив трубку на RT. Снова вращайте колонну в течение 1 мин при 15 000 × г при RT.
  13. Храните пробирки с образцами при температуре −80 °C перед использованием.

4. Извлечение общей РНК из образца почки

  1. Сначала подготовьте следующие продукты: гомогенизатор кремния, лед, вихревой смеситель, 100% этанол, 100% хлороформ, спиновые колонки биополимера (в коллекторных трубках2,0 мл 11), спиновые колонны с мембранным креплением (в трубках сбора2,0 мл 11), реагент лизиса на основе фенола / гуанидина, промывочный буфер No 1 (тот же буфер, что и на этапе 3.1.), буфер промывки No 2 (тот же буфер, что и на этапе 3.1.), буфер для промывки No 2 (тот же буфер, что и на этапе 3.1.), Вода без РНКазы, микроцентрифужные трубки объемом 1,5 мл и микроцентрифужные трубки объемом 2,0 мл.
  2. Поместите образец почки 10 мг в гомогенизатор кремния и добавьте 700 мкл реагента лизиса на основе фенола / гуанидина.
  3. Настройте гомогенизатор. Осторожно надавите и скрутите пестик гомогенизатора к образцу почки, чтобы гомогенизировать образец. Продолжайте прессовать и скручивать пестик до тех пор, пока образец почки не будет полностью гомогенизирован в реагенте лизиса на основе фенола / гуанидина.
  4. Для дальнейшей гомогенизации берут гомогенизированный лизат (в пробирке для сбора 2,0 мл) и переносят его в спиновую колонну биополимера.
  5. Центрифугировать гомогенизированный лизат на RT в течение 3 мин при 14 000 × г , а затем перенести всю осажденную гранулу в неиспользуемую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл для инвертирования осажденной гранулы
  6. Смешать гранулу со 140 мкл хлороформа в пробирке; затем плотно закройте крышку трубки. Переверните трубку 15x, чтобы смешать лизат и хлороформ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хлороформ можно безопасно использовать без капюшона.
  7. Инкубировать образец на RT в течение 2-3 мин. Центрифугирование образца при 4 °C в течение 15 мин при 12 000 × г.
  8. Перенесите супернатант (который обычно составляет ~300 мкл) в новую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл, не нарушая осадок. Добавьте в 1,5 раза больше его объема (который обычно составляет ~ 450 мкл) 100% этанола. Вихрь смеси в течение 5 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На всех следующих этапах поместите мембранно-закрепленную спиновую колонну для разделения РНК и ДНК в пробирку для сбора 2,0 мл, чтобы центрифугировать ее.
  9. Загрузите 700 мкл образца на одну из спиновых колонн с мембранным креплением. Закройте колпачок и центрифугируйте колонну при 15 000 × g в течение 15 с. Выбросьте осажденный лизат, оставшийся в сборной трубке.
  10. Добавьте 700 мкл промывочного буфера No1 в отжимную колонну, чтобы тщательно промыть ее. Закройте колпачок и центрифугируйте колонну при 15 000 × g в течение 15 с. Выбросьте осажденный лизат, оставшийся в сборной трубке.
  11. Для удаления следовых количеств соли загрузите 500 мкл промывочного буфера No2 на мембранно-закрепленную спиновую колонну. После закрытия колпачка колонны центрифугируют колонну при 15 000 × g в течение 15 с. Выбросьте осажденный лизат в сборную трубку.
  12. Повторите шаг 4.11.
  13. Центрифугировать мембранно-закрепленную спиновую колонну снова в течение 1 мин при 15 000 × г. Выбросьте осажденный лизат в сборную трубку.
  14. Возьмите отжимную колонну с мембранным креплением и перенесите ее в новую трубку для сбора 1,5 мл. Добавьте 30 мкл воды без РНКазы в столб, чтобы растворить общую РНК. После закрытия колпачка колонны подождите 5 мин с трубкой на RT, а затем центрифугируйте колонну в течение 1 мин при 15 000 × г.
  15. Перенесите общий объем образца, содержащего общую РНК, в новую микроцентрифужную трубку. Поместите трубку на лед и измерьте общую концентрацию РНК с помощью спектрофотометрии. Убедитесь, что общая концентрация РНК составляет ~300-1 500 нг/мкл.
  16. Храните пробирки, содержащие образцы, при температуре −80 °C перед использованием.

5. Синтез кДНК с обратной транскрипцией общей РНК в сыворотке крови

ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальная информация для публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени (MIQE) рекомендует использовать лучшие экспериментальные практики для получения надежных, однозначных результатов17. В этом протоколе кДНК синтезируется из общей РНК, очищенной в двухэтапной процедуре с использованием обратной транскриптазы, поли(А) полимеразы и олиго-dT праймеров.

  1. Сначала подготовьте следующий: вихревой смеситель, термоциклер, восьмилуночные ленточные трубки, колпачок каждой восьмиполосной трубки, дистиллированную воду, лед, набор обратной транскриптазы (см. Таблицу материалов)13,14 в расплавленном состоянии и 1,5 мл микроцентрифужных трубок.
  2. Запустите термоциклер.
  3. Приготовить раствор мастер-микса; для получения в общей сложности 8,0 мкл мастер-смеси на восьмилуночную полосную трубку добавляют 2,0 мкл смеси обратной транскриптазы (входит в комплект) и 2,0 мкл 10-кратной смеси нуклеиновых кислот к 4,0 мкл буфера обратной транскрипции в микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл.
  4. Поместите 8,0 мкл раствора основной смеси в каждую трубу восьмискважинной ленточной трубы.
  5. Поместите 12 мкл аликвоты общей РНК в каждую трубку восьмилуночной полосчатой трубки и закройте крышку трубки. Центрифугирование трубки в течение 15 с при РТ и 2000 × г.
  6. Поместите трубку в термоциклер и инкубируйте в течение 60 мин при 37 °C. Инкубируют образец в течение дополнительных 5 мин при 95 °C мин для синтеза кДНК.
  7. После инкубации перенесите кДНК в новую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Разбавьте кДНК десятикратно (1:10) дистиллированной водой. Вихрь и центрифуга трубки в течение 5 с при РТ и 2000 × г.
  8. Храните разбавленную кДНК временно на льду. Храните разбавленные образцы при температуре −80 °C перед использованием.

6. Синтез кДНК с обратной транскрипцией общей РНК в почках

ПРИМЕЧАНИЕ: Руководящие принципы MIQE поощряют более совершенную экспериментальную практику для обеспечения надежных и недвусмысленных результатов17. Этот протокол использует обратную транскриптазу, поли(А) полимеразу и олиго dT праймеры для синтеза кДНК из 1,0 мкг очищенной общей РНК в двухэтапной процедуре.

  1. Сначала подготовьте следующее: вихревой смеситель, тепловой циклер, микроцентрифужные трубки объемом 1,5 мл, восьмискважинные ленточные трубки, крышку каждой восьмиполосной трубки, дистиллированную воду, лед и комплект обратной транскриптазы (см. Таблицу материалов)13,14 в расплавленном состоянии.
  2. Запустите термоциклер.
  3. Приготовить раствор мастер-микса; для получения в общей сложности 8,0 мкл раствора мастер-микса на пробирку добавляют 2,0 мкл смеси обратной транскриптазы, входящей в комплект, и 2,0 мкл 10-кратной смеси нуклеиновых кислот к 4,0 мкл буфера обратной транскрипции.
  4. Добавьте 8,0 мкл раствора основной смеси в каждую трубу восьмилуночной ленточной трубы.
  5. Отрегулируйте общую плотность РНК следующим образом. Для отделения 1,0 мкг общей РНК от образца почки с 12 мкл рваазной воды берут подходящее количество общей РНК и переносят ее в дистиллированную воду, используя концентрацию, измеренную, как описано выше (на этапе 4.15.).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При наличии загрязнения ДНК загрязненная ДНК совместно амплодируется с помощью qRT-PCR.
  6. Выполните тот же процесс, что и описанный выше в шагах 5.5.-5.8.

7. qRT-PCR миРНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Для qRT-ПЦР миРНК используется интеркаляторный метод. Для РНК используются праймеры: U6 малый ядерный 2 (RNU6-2), miRNA-223-3p, miRNA-423-5p, miRNA-7218-5p и miRNA-7219-5p.

  1. Подготовьте следующее: вихревой смеситель, систему ПЦР в режиме реального времени, реакционную пластину с 96 лунками для qRT-PCR, клейкую пленку для реакционной пластины с 96 лунками, аппликатор клейкой пленки, ротор центрифуги с 96 лунками, праймеры, специфичные для миРНК, набор ПЦР на основе зеленого красителя, содержащий 2-кратную главную смесь ПЦР и 10-кратную универсальную грунтовку (см. Таблицу материалов)13,14, и микроцентрифужная трубка объемом 1,5 мл.
  2. После смешивания их в микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл вихрь: 6,25 мкл дистиллированной воды, 1,25 мкл каждого из 5 мкМ праймера миРНК, растворенного в воде без нуклеазы, 12,5 мкл 2x ПЦР-мастер-смеси и 2,5 мкл 10x универсального праймера.
  3. Подготовьте и расплавьте синтезированную кДНК, как описано на этапе 5 (сыворотка) или этапе 6 (почка). Вихрь и центрифугирование кДНК в течение 5 с.
  4. Возьмите 22,5 мкл аликвот реагента (как описано в шаге 7.2. выше) и поместите их отдельно в каждую лунку 96-луночной пластины.
  5. Добавьте 2,5 мкл аликвоты кДНК к каждой лунке пластины.
  6. Чтобы закрепить клейкую пленку на пластине, используйте аппликатор клейкой пленки. Центрифугирование пластины в течение 30 с при 1000 х г в 96-луночном центрифужном роторе. Стабилизируйте реакцию на дне каждой скважины.

8. Использование системы и программного обеспечения ПЦР в режиме реального времени для запуска программы цикличности ПЦР

  1. Запустите систему ПЦР в режиме реального времени. Поместите созданную пластину, как описано в шаге 7.6. в системе ПЦР реального времени. Измените настройки; укажите название эксперимента, а затем выберите 96-луночную скважину (0,2 мл) в качестве типа эксперимента системы, сравнительную КТ (ΔΔCT) в качестве метода количественного определения, стандартную в качестве режима работы системы и зеленые реагенты SYBR в качестве реагентов для обнаружения целевой последовательности.
  2. Укажите имена для образца и целевых миРНК, а также назовите образец и целевую миРНК в каждой лунке. Назначьте дубликаты образцов для получения данных, пригодных для подтверждения результатов, и выберите эталонный образец и эндогенный контроль. Чтобы краситель использовался в качестве пассивного эталона, выберите «Нет». Для устранения перекрестного загрязнения реагентов настройте отрицательную обратную транскриптазу и нешаблонный контроль экспрессии миРНК.
  3. Затем убедитесь, что объем реакции установлен на 20 мкл , а условия цикла ПЦР установлены следующим образом: 95 °C в течение 15 мин, затем 40 циклов денатурации при 94 °C в течение 15 с, отжиг при 55 °C в течение 30 с и, наконец, удлинение при 70 °C в течение 30 с.
  4. Нажмите на анализ в программном обеспечении системы, чтобы проанализировать данные qRT-PCR после завершения процесса. Убедитесь, что пороговая линия, автоматически выбранная программой, подходит для каждой скважины.
  5. Проверьте значение порогового цикла (КТ) эндогенного контроля и целевых микроРНК, проанализированных в каждом образце. Определите значения КТ по пересечению кривой усиления и пороговой линии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании RNU6-2 и miRNA-423-5p использовались в качестве эндогенных элементов контроля для уровней экспрессии целевой миРНК, а метод ΔΔCT использовался для определения относительных уровней экспрессии каждой целевой миРНК18.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для мышиной модели с возрастными нарушениями почек мы использовали 50-недельных самцов мышей SAMP1 весом 40-45 г. Примерно 0,8 мл крови было собрано на одну мышь и перенесено в 1,0 мл шпицевой трубки с гепарином, инвертированной и центрифугированной. Каждую почку промывали PBS, рассекали и хранили в жидком азоте для дальнейшего анализа. Пятидесятинедельные мыши SAMR1 служили в качестве контроля. Основываясь на данных миРНК qRT-PCR, полученных с использованием этой возрастно-зависимой модели почечной недостаточности, мы наблюдали, что уровень miRNA-7219-5p в почках был значительно повышен, а уровень miRNA-7218-5p в почках значительно снизился у мышей SAMP1 по сравнению с контрольной группой (рисунок 1). Сывороточные уровни как miRNA-7219-5p, так и miRNA-7218-5p были значительно увеличены у мышей SAMP1 по сравнению с контрольной группой (рисунок 2). Уровни экспрессии miRNA-223-3p не изменялись ни в одном штамме, а также между почками и сывороткой (Рисунок 1 и Рисунок 2).

figure-results-1
Рисунок 1: Дифференциально экспрессированные микроРНК в почках мышей SAMP1. qRT-PCR анализ экспрессии miRNA-223-3p, miRNA-7218-5p и miRNA-7219-5p у мышей SAMR1 (контроль, n = 4) и SAMP1 мышей (n = 4). Данные являются средними ± стандартной погрешности (полосы ошибок); t-тесты использовались для анализа межгрупповых различий; p < 0,05 считалось значимым (*p < 0,05), n.s.: незначимым. Сокращения: miRNA = микроРНК; SAMP1 = мышь, склонная к ускоренному старению; SAMR1 = сопротивление мыши с ускорением старения 1; qRT-PCR = количественная обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Дифференциально экспрессированные миРНК в сыворотке мышей SAMP1. qRT-PCR анализ экспрессии miRNA-223-3p, miRNA-7218-5p и miRNA-7219-5p у мышей SAMR1 (контроль, n = 4) и мышей SAMP1 (n = 4). Данные являются средними ± SE (полосы ошибок); t-тесты использовались для исследования существенных различий между группами. *p < 0,05 по t-тесту. Сокращения: miRNA = микроРНК; SAMP1 = мышь, склонная к ускоренному старению; SAMR1 = сопротивление мыши с ускорением старения 1; qRT-PCR = количественная обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Уровни экспрессии целевых миРНК были успешно определены по вышеописанному протоколу с использованием qRT-PCR. Оценка извлеченных миРНК является важным шагом в получении значимых данных qRT-PCR. Для подтверждения адекватного качества миРНК перед выполнением qRT-PCR следует использовать спектрофотометрию для определения отношения абсорбции при 260 нм к соотношению абсорбции при 280 нм. Может произойти загрязнение ДНК, и/или димеры праймера в каждой скважине реакционной пластины могут присутствовать, если qRT-PCR не обеспечивает ни одной ПЦР-амплификации ожидаемой длины и температуры плавления или если она обеспечивает мономодальную кривую плавления.

Уровни экспрессии MiRNA могут быть оценены несколькими методами, отличными от qRT-PCR, включая северное блотттинг, микрочип и анализы защиты рибонуклеазы. Тем не менее, метод qRT-PCR является чувствительной, точной, простой и воспроизводимой процедурой, которая требует меньшего объема образца, чем те, которые требуются для северного блоттинга и анализов защиты рибонуклеазы19. Поскольку микрочипы могут измерять экспрессию десятков тысяч микроРНК одновременно, их можно использовать для идентификации маркеров миРНК-кандидатов. Данные микрочипов также показывают высокую общую корреляцию с данными, полученными с помощью qRT-PCR20. Однако не было достигнуто консенсуса относительно оптимальной методологии сравнения данных микрочипов, полученных в различных исследованиях21.

Оценка сывороточных микроРНК имеет следующие особенности. Во-первых, легко собрать сыворотку, и поскольку сывороточные миРНК устойчивы к замораживанию и оттаиванию, температуре и кислоте, миРНК могут быть хорошими биомаркерами. Во-вторых, среди видов высока гомология миРНК, а результаты экспериментов на животных легко экстраполируются на человека. В-третьих, сывороточные миРНК показали потенциал для использования в качестве терапевтических препаратов3. Несколько исследований также продемонстрировали, что уровень экспрессии миРНК в органах коррелирует с миРНК в сыворотке 22,23,24. В настоящем исследовании miRNA-223-3p, уровни в почках которого не показали существенной разницы между мышами SAMR1 и SAMP1, также не показали значимой разницы между штаммами в сыворотке крови. Напротив, miRNA-7218-5p и miRNA-7219-5p, уровни в почках которых показали значительную разницу между мышами SAMR1 и SAMP1, показали значительные различия между штаммами в сыворотке крови.

Этот протокол имеет следующие ограничения. Во-первых, его полезность не была проверена в других органах, таких как печень и легкие, а во-вторых, он не был протестирован на других лабораторных животных, таких как крысы, собаки и свиньи. Несколько исследовательских групп использовали этот протокол для очистки и обнаружения миРНК с помощью qRT-PCR и сообщили, что этот протокол позволил очистить высококачественную РНК из тканей и сыворотки 13,14,22,23,24. Было продемонстрировано, что этот метод обладает высокой точностью и чувствительностью для обнаружения экспрессии миРНК 13,14,22,23,24. Результаты настоящего исследования показывают, что этот протокол может успешно обнаруживать экспрессию миРНК в сыворотке и почках мышей. Поэтому протокол может быть использован для определения профилей экспрессии миРНК сыворотки и почек у мышей с различными патологиями. Благодаря простоте протокола, большое количество образцов может быть обработано одновременно. Анализы экспрессии многих микроРНК при различных патологических состояниях почек могут, таким образом, использовать протокол, описанный в настоящем описании.

Есть определенные аспекты протокола, которые следует иметь в виду. Чтобы избежать деградации очищенных миРНК, которая будет происходить при комнатной температуре, миРНК должны храниться на льду. Образцы почек должны быть гомогенизированы до тех пор, пока они полностью не растворятся в реагенте лизиса. Почка мыши содержит значительное количество соединительной ткани, которая нерастворима в реагенте лизиса, и, таким образом, для дальнейшей гомогенизации требуется столбчатый измельчитель. Кроме того, соответствующая эндогенная контрольная миРНК (со стабильной экспрессией среди образцов) должна быть проверена на протяжении всего эксперимента qRT-PCR. Это связано с тем, что интерференция различных веществ во время выполнения этого протокола может изменять уровни экспрессии эндогенных контрольных микроРНК, возможно, ставя под угрозу результаты. В заключение в этой статье описывается протокол qRT-PCR для обнаружения, очистки и оценки экспрессии миРНК в сыворотке и почках мышей с возрастной почечной недостаточностью.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,0 мл шпица с гепариномGreiner-bio-one450534
Buffer RPE (промывочный буфер #2, содержащий гуанидин и этанол в соотношении 1:4)Qiagen79216Wash buffer 2
Buffer RWT (промывочный буфер #1, содержащий гуанидин и этанол в соотношении 1:2)Qiagen1067933Wash buffer 1
MicroAmp Optical 96-луночный реакционный планшет для qRT-PCRThermo Fisher Scientific431681396-луночная реакционная пластина
MicroAmp Оптическая адгезивная пленкаThermo Fisher Scientific4311971Адгезивная пленка для 96-луночной реакционной пластины
miRNA-223-3p праймерQiagenMS000038715'-CGUGUAUUUGACAAGCUGAGUU
G-3'miRNA-423-5p
праймерQiagenMS000120055'-UGAGGCAGAGAGCGAGACU
UU-3'
miRNA-7218-5p праймерQiagenMS000680675'-UGCAGGGUUUAGUAGAGG
-
праймерQiagenMS000680815'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGA
GA-3'miRNeasy
Mini kitQiagen217004Мембранный якорный спин-колонка в пробирке для сбора 2,0 мл
miRNeasy Serum/Plasma kitQiagen217184Мембранная спиновая колонка в пробирке для сбора 2,0 мл
miScript II RT kit (буфер для обратной транскрипции)Qiagen218161Набор для обратной транскриптазы
miScript SYBR Зеленый набор для ПЦРQiagen218073Набор для ПЦР на основе зеленого красителя
Измельчитель QIAQiagen79654Биополимерные спиновые колонки в пробирке для сбора 2,0 мл
QIAzol Лизис реагент (лизис на основе фенола/гуанидина реагентдлялизиса на основе фенола/гуанидина
QuantStudio 12K Flex Flex Система для ПЦР в реальном времениThermo Fisher Scientific4472380Прибор для ПЦР в реальном времени
QuantStudio 12K Flex Software версии 1.2.1.Thermo Fisher Scientific4472380Программное обеспечение для прибора для ПЦР в реальном времени
РНКаза вода без РНКазыQiagen129112
RNU6-2 праймерQiagenMS00033740Не разглашается в связи с конфиденциальностью
SAMP1 самцы мышейNippon SLC CorporationНе присвоены
SAMR1 самцы мышейNippon SLC CorporationНе присвоены
Стандартный биоизмельчитель TakaraBio9790BГомогенизатор кремния
3'miRNA-7219-5p

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huang, Y. The novel regulatory role of lncRNA-miRNA-mRNA axis in cardiovascular diseases. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (12), 5768-5775 (2018).
  2. Yang, C., Dou, R., Yin, T., Ding, J. MiRNA-106b-5p in human cancers: diverse functions and promising biomarker. Biomedicine and Pharmacotherapy. 127, 110211(2020).
  3. Lu, T. X., Rothenberg, M. E. MicroRNA. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1202-1207 (2018).
  4. McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring. Cancer and Metastasis Reviews. 34 (1), 145-155 (2015).
  5. Bjorkman, S., Taylor, H. S. MicroRNAs in endometriosis: biological function and emerging biomarker candidates. Biology of Reproduction. 100 (5), 1135-1146 (2019).
  6. Zhou, C. X., et al. miRNA and circRNA expression patterns in mouse brain during toxoplasmosis development. BMC Genomics. 21 (1), 46(2020).
  7. Jing, R., Zhong, Q. Q., Long, T. Y., Pan, W., Qian, Z. X. Downregulated miRNA-26a-5p induces the apoptosis of endothelial cells in coronary heart disease by inhibiting PI3K/AKT pathway. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 23 (11), 4940-4947 (2019).
  8. Xie, W., et al. miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin. Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).
  9. Bala, S., et al. Circulating microRNAs in exosomes indicate hepatocyte injury and inflammation in alcoholic, drug-induced, and inflammatory liver diseases. Hepatology. 56 (5), 1946-1957 (2012).
  10. Ishii, H., et al. MicroRNA expression profiling in diabetic kidney disease. Translational Research. 237, 31-52 (2021).
  11. Latorre Luque, J. Relevance of the epigenetic regulation exercised by hepatic microRNAs in the fatty liver arena: from the bedside to the bench. , Available from: http://hdl.handle.net/10803/671499 (2019).
  12. Mastropasqua, R., et al. Serum microRNA levels in diabetes mellitus. Diagnostics (Basel). 11 (2), 284(2021).
  13. Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Bacopulos, S., Seth, A. MicroRNA detection in prostate tumors by quantitative real-time PCR (qPCR). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3874(2012).
  14. Ahn, J. H., Kwak, J., Lee, J. H., Lee, S. S. Efficient and accurate analysis of microRNA using a specific extension sequence. Molecular Biology Reports. 45 (4), 611-619 (2018).
  15. Denic, A., Glassock, R. J., Rule, A. D. Structural and functional changes With the aging kidney. Advances in Chronic Kidney Disease. 23 (1), 19-28 (2016).
  16. Weinstein, J. R., Anderson, S. The aging kidney: physiological changes. Advances in Chronic Kidney Disease. 17 (4), 302-307 (2010).
  17. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
  18. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  19. Rajeevan, M. S., Vernon, S. D., Taysavang, N., Unger, E. R. Validation of array-based gene expression profiles by real-time (kinetic) RT-PCR. The Journal of Molecular Diagnostics. 3 (1), 26-31 (2001).
  20. Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis. BMC Genomics. 10, 407(2009).
  21. Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate. BMC Genomics. 6, 59(2005).
  22. Petriella, D., et al. miRNA profiling in serum and tissue samples to assess noninvasive biomarkers for NSCLC clinical outcome. Tumour Biology. 37 (4), 5503-5513 (2016).
  23. Skrzypa, M., et al. miRNA-146a-5p is upregulated in serum and cartilage samples of patients with osteoarthritis. Polski Przeglad Chirurgiczny. 91 (3), 1-5 (2019).
  24. Farzanehpour, M., et al. Serum and tissue miRNAs: potential biomarkers for the diagnosis of cervical cancer. Journal of Virology Journal. 16 (1), 116(2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SYBR GreenCt

Похожие статьи