Методическая статья

Очистка эндогенных каналов транзиторных рецепторов дрозофилы

1.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63260

⸱

28 декабря 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Shenzhen Key Laboratory for Neuronal Structural Biology, Biomedical Research Institute, Shenzhen Peking University-The Hong Kong University of Science and Technology Medical Center

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

На основе механизма сборки белкового комплекса INAD в этом протоколе была разработана модифицированная стратегия аффинной очистки плюс конкуренция для очистки эндогенного канала Drosophila TRP.

Аннотация

Фототрансдукция дрозофилы является одним из самых быстрых известных сигнальных путей, связанных с G-белком. Чтобы обеспечить специфичность и эффективность этого каскада, кальциевый (Ca2+)-проницаемый катионный канал, переходный рецепторный потенциал (TRP), плотно связывается с каркасным белком, инактивирующим без-после-потенциала D (INAD), и образует большой сигнальный белковый комплекс с глаз-специфической протеинкиназой C (ePKC) и фосфолипазой Cβ / No рецепторного потенциала A (PLCβ / NORPA). Однако биохимические свойства канала Drosophila TRP остаются неясными. На основе механизма сборки белкового комплекса INAD была разработана модифицированная стратегия аффинной очистки плюс конкуренция для очистки эндогенного канала TRP. Во-первых, очищенный фрагмент NORPA 863-1095, помеченный гистидином (His), был связан с Ni-шариками и использовался в качестве приманки для вытягивания эндогенного белкового комплекса INAD из гомогенатов головки Drosophila . Затем к Ni-бусинам был добавлен избыточный очищенный фрагмент TRP 1261-1275 с маркировкой ГЛУТАТИОН S-трансфераза (GST), чтобы конкурировать с каналом TRP. Наконец, канал TRP в супернатанте был отделен от избыточного пептида TRP 1261-1275 с помощью размерно-эксклюзионной хроматографии. Этот метод позволяет изучить механизм гакинга канала Drosophila TRP как с биохимического, так и со структурного угла. Электрофизиологические свойства очищенных каналов Drosophila TRP также могут быть измерены в будущем.

Введение

Фототрансдукция — это процесс, при котором поглощенные фотоны преобразуются в электрические коды нейронов. Он исключительно передает опсины и следующий сигнальный каскад, связанный с G-белком, как у позвоночных, так и у беспозвоночных. У дрозофилы, используя пять доменов PDZ, инактивация каркасного белка без последующего потенциала D (INAD) организует супрамолекулярный сигнальный комплекс, который состоит из канала переходного рецепторного потенциала (TRP), фосфолипазного Cβ/No рецепторного потенциала A (PLCβ/NORPA) и глаз-специфической протеинкиназы C (ePKC)1. Формирование этого супрамолекулярного сигнального комплекса гарантирует правильную субклеточную локализацию, высокую эффективность и специфичность механизма фототрансдукции Drosophila. В этом комплексе светочувствительные каналы TRP действуют как нисходящие эффекторы NORPA и опосредуют приток кальция и деполяризацию фоторецепторов. Предыдущие исследования показали, что открытие канала Drosophila TRP опосредовано протонами, нарушением местной липидной среды или механической силой 2,3,4. Канал Drosophila TRP также взаимодействует с кальмодулином5 и модулируется кальцием как положительной, так и отрицательной обратной связью 6,7,8.

До сих пор электрофизиологические исследования механизма захвата каналов Drosophila TRP и TRP-подобных (TRPL) каналов были основаны на иссеченных мембранных пластырях, записях цельноклеток из диссоциированных фоторецепторов дрозофилы дикого типа и гетеро-экспрессированных каналах в клетках S2, SF9 или HEK 2,9,10,11,12,13, но не на очищенных каналах. Структурная информация о полнометражном канале Drosophila TRP также остается неясной. Для изучения электрофизиологических свойств очищенного белка в восстановленной мембранной среде и получения структурной информации о полноразмерном канале Drosophila TRP получение очищенных полноразмерных каналов TRP является необходимым первым шагом, аналогичным методологиям, используемым в исследованиях каналов TRP млекопитающих 14,15,16,17.

Недавно, на основе механизма сборки белкового комплекса INAD 18,19,20, впервые была разработана стратегия аффинной очистки плюс конкуренция для очистки канала TRP от гомогенатов головки дрозофилы бусинами стрептавидина 5. Учитывая низкую емкость и дорогую стоимость бусин стрептавидина, здесь введен улучшенный протокол очистки, в котором используется помеченный Им белок приманки и соответствующие недорогие Ni-бусины с гораздо более высокой емкостью. Предложенный метод поможет изучить механизм гатерации канала ГТО со структурных углов и измерить электрофизиологические свойства канала ГТО очищенными белками.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Очистка фрагментов ГТО с тегами GST и NORPA с тегами His

  1. Очистка фрагмента TRP 1261-1275 с меткой GST
    1. Преобразование плазмиды pGEX 4T-1 TRP 1261-127510 в клетки Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) с использованием метода теплового шокового преобразования CaCl2 2. Инокулируют одну колонию в 10 мл среды Luria Bertani (LB) и растут в течение ночи при 37 °C. Затем амплируйте 10 мл посевной культуры в 1 л среды LB при 37 °C.
    2. После того, как оптическая плотность (OD600) клеток достигнет 0,5, охладите клетки до 16 °C и добавьте 0,1 мМ изопропил β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG; конечная концентрация), чтобы индуцировать сверхэкспрессию белка-мишени и инкубировать при 16 °C в течение 18 ч.
    3. После сверхэкспрессии гранулируют 1 л культивируемых клеток центрифугированием при 3,993 × г в течение 20 мин и повторно суспендируют в 40 мл фосфатно-буферного физиологического (PBS) буфера.
    4. Загрузите повторно суспендированные ячейки в гомогенизатор высокого давления, предварительно охлажденный при 4 °C. Медленно увеличьте давление гомогенизатора до 800 бар. Откройте впускной кран и позвольте повторно суспендированным ячейкам циркулярно пройти через клапан с очень узкими щелями.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки гомогенизируются высокими сдвиговыми силами, вызванными большим падением давления и кавитацией.
    5. Загрузите 5 мл бусин глутатиона в колонку гравитационного потока и промыть шарики 50 мл буфера PBS в общей сложности три раза.
    6. Центрифугирование лизата клеток из гомогенизатора высокого давления при 48,384 х г. Добавьте супернатант центрифугированного клеточного лизата (40 мл) к уравновешенным шарикам глутатиона в колонке гравитационного потока и инкубируйте в течение 30 мин при 4°С. Повторно суспендируйте бусины глутатиона каждые 10 минут.
    7. После 30 мин инкубации откройте выходной кран колонны, чтобы отделить шарики и проточную фракцию. Отбросьте проточную фракцию. Дважды промойте оставшиеся шарики глутатиона 50 мл буфера PBS.
    8. Добавьте 15 мл буфера элюирования к шарикам глутатиона и инкубируйте в течение 30 минут. Повторно суспендируйте бусины каждые 10 минут.
    9. После 30 мин инкубации элюируют меченый GST фрагмент TRP 1261-1275 в конической трубке объемом 50 мл и нагружают в колонну исключения размера (подготовительный класс), которая уравновешивается с использованием буфера 50 мМ Tris (рН 7,5, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ DTT).
    10. Сохраните расход элюирования колонки исключения размеров на уровне 3 мл/мин. Соберите элюированные белки из расчета 5 мл/пробирка.
    11. Определите пик белка-мишени в колонке «размер-исключение» путем анализа сигналов поглощения УФ-излучения при 280 нм и проверьте с помощью анализа геля SDS-PAGE (параметры электрофореза: 150 В для стекирующего геля; 200 В для разрешающего геля). Окрасьте гель синим цветом Coomassie R250.
    12. Сконцентрируйте очищенный фрагмент TRP 1261-1275 с маркировкой GST от колонны исключения размеров до 1 мл с помощью 15 мл ультрафильтрационной спиновой колонны, центрифугированной при 3000 х г при 4 °C в настольной холодильной центрифуге.
    13. Определить концентрацию концентрированного белка можно с помощью закона Бира-Ламберта. Измерьте УФ-поглощение фрагмента TRP 1261-1275 с GST-меткой при 280 нм с помощью спектрофотометра.
    14. Получение коэффициента вымирания при 280 нм путем импорта белковых последовательностей в программу Protparam (https://web.expasy.org/protparam/). Как правило, 1 л культуры GST-меченого TRP 1261-1275 дает 1 мл 600 мкМ белка (6 х 10-7 моль). Необходимые материалы см. в таблице 1 .
  2. Очищение его меченого фрагмента NORPA 863-1095
    1. Преобразование плазмиды20 pETM.3C NORPA 863-1095 в ячейки E. coli BL21 (DE3) с использованием метода21 трансформации теплового шока CaCl2. Инокулируют одну колонию в 10 мл среды LB и растут в течение ночи при 37 °C. Затем амплируйте посевную культуру объемом 10 мл в 1 л среды LB при 37 °C.
    2. После того, как OD600 клеток достигнет 0,5, охладите клетки до 16 °C и добавьте 0,1 мМ IPTG (конечная концентрация), чтобы индуцировать сверхэкспрессию белка-мишени и инкубировать при 16 °C в течение 18 ч.
    3. После сверхэкспрессии гранулируют 1 л культивируемых клеток центрифугированием при 3,993 х г в течение 20 мин и повторно суспендируют в 40 мл связывающего буфера. Затем лизируйте повторно суспендированные ячейки в гомогенизаторе высокого давления при 4 °C, как описано на этапе 1.1.4.
    4. Загрузите 5 мл Ni-шариков в гравитационную проточную колонну и трижды промыть 50 мл связывающего буфера.
    5. Центрифугирование лизата клеток из гомогенизатора высокого давления при 48,384 х г. Добавьте супернатант центрифугированного клеточного лизата к уравновешенным Ni-шарикам в колонке гравитационного потока и инкубируйте в течение 30 мин при 4°C. Повторно суспендируйте Ni-бусины каждые 10 минут.
    6. После 30 мин инкубации откройте выходной кран колонны, чтобы отделить шарики и проточную фракцию. Отбросьте проточную фракцию и дважды промыть оставшиеся ni-шарики 50 мл промывочного буфера.
    7. Добавьте 15 мл буфера элюирования в Ni-шарики и инкубируйте в течение 30 мин. Повторно суспендируйте Ni-бусины каждые 10 минут.
    8. После 30 мин инкубации собрать элюированный his-меченый фрагмент NORPA 863-1095 в коническую трубку объемом 50 мл и загрузить в колонну исключения размеров (подготовительный сорт), которая уравновешивается с использованием 50 мМ Tris (рН 7,5, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ DTT).
    9. Сохраните расход элюирования колонки исключения размеров на уровне 3 мл/мин. Соберите элюированный белок из расчета 5 мл/пробирка.
    10. Определите пик белка-мишени в колонке «размер-исключение» путем анализа сигналов поглощения УФ-излучения при 280 нм и проверьте с помощью анализа геля SDS-PAGE (параметры электрофореза: 150 В для стекирующего геля; 200 В для разрешающего геля). Окрашивайте гель с помощью Coomassie синим R250.
    11. Сконцентрируйте очищенный фрагмент NORPA 863-1095 с маркировкой His из колонки исключения размеров до 1 мл с помощью 15 мл ультрафильтрационной спиновой колонны, центрифугированной при 3000 х г при 4 °C в настольной холодильной центрифуге.
    12. Определить концентрацию концентрированного белка можно с помощью закона Бира-Ламберта. Измерьте УФ-поглощение гис-меченого фрагмента NORPA 863-1095 при 280 нм с помощью спектрофотометра.
    13. Получение коэффициента вымирания при 280 нм путем импорта белковых последовательностей в программу Protparam (https://web.expasy.org/protparam/). Как правило, 1 л культуры his-меченого фрагмента NORPA 863-1095 дает 1 мл 600 мкМ белка (6 х 10-7 моль). Необходимые материалы см. в таблице 2 .

2. Приготовление голов дрозофилы

  1. Собирать взрослых мух в конические центрифугирующие трубки объемом 50 мл с помощью метода обезболиванияСО2 22,23; немедленно заморозить в жидком азоте в течение 10 мин и хранить в морозильной камере -80°C.
  2. Собрав достаточное количество мух, энергично встряхните замерзшие конические трубки объемом 50 мл вручную, чтобы отделить ноги, головы, крылья и тела мух. Переложите смесь на три последовательно уложенных предварительно охлажденных сита из нержавеющей стали (размер ячейки 20/30/40 соответственно) и встряхните сита.
  3. Затем, поскольку головки не могут пройти через 40-сетчатое сито, используйте щетку, чтобы смести головки мух с 40-сетчатого сита, переложить их в конические трубки объемом 50 мл и хранить их при -80 ° C.
  4. Непрерывно собирайте мух и их головы и храните их в морозильной камере -80 °C до тех пор, пока они не достигнут необходимого количества, необходимого для экспериментов (0,5 г). Как правило, для сбора 0,5 г головок необходимо 35 мл мух в конической трубке объемом 50 мл. Необходимые материалы см. в таблице 3 .

3. Очистка канала Drosophila TRP

  1. Взвесьте в общей сложности 0,5 г головок и полностью гомогенизируйте в жидком азоте с помощью предварительно охлажденного раствора-пестика. Растворяют гомогенизированные головки в буфере лизиса 10x v/w (5 мл), инкубируют в шейкере при 4 °C в течение 20 мин, а затем центрифугу при 20,817 x g в течение 20 мин при 4 °C.
  2. Соберите отжимной супернатант («20817 г S», рисунок 4) и далее центрифугируйте его при 100 000 х г в течение 60 мин при 4 °C. Используйте спин-нисходящий супернатант («100 000 г S», рисунок 4) для следующего анализа вытягивания.
  3. Добавьте 1 мл Ni-шариков в столб гравитационного потока и промыть шарики 10 мл двойного дистиллированногоH2O (ddH2O) при 4 °C в общей сложности три раза. Уравновесьте бусины 10-колонными объемами буфера лизиса три раза при 4 °C.
  4. Добавьте 500 мкл 600 мкМ очищенного his-меченого белка NORPA 863-1095 (3 x 10-7 моль) в Ni-колонку и инкубируйте в течение 30 мин при 4 °C. Повторно суспендируйте бусины каждые 10 минут.
  5. Откройте выходной кран колонны, чтобы разделить шарики и проточную фракцию. Возьмем проточную дробь для анализа SDS-PAGE (NORPA F, рисунок 4). В этом разделе белки приманки иммобилизованы на Ni-шариках.
  6. Промыть ni-шарики с 10 колонными объемами лизисного буфера (10 мл) при 4 °C и сохранить промывочную фракцию для анализа SDS-PAGE (Wash 1, рисунок 4A). Повторите описанные выше шаги и сохраните образец для анализа SDS-PAGE (Wash 2, рисунок 4A). В этом разделе удаляются избыточные белки приманки на Ni-шариках.
  7. Добавьте супернатант гомогената головки дрозофилы после центрифугирования 100 000 х г в Ni-колонку при 4 °C, где иммобилизован фрагмент NORPA 863-1095, помеченный His.
  8. Инкубировать супернатант с Ni-шариками при 4 °C в течение 30 мин. Повторно суспендируйте бусины каждые 10 минут. Затем откройте выходной кран колонны, чтобы разделить шарики и проточную фракцию.
  9. Соберите супернатант для анализа SDS-PAGE (лизис головы Dro F, рисунок 4A). В этом разделе белковые комплексы INAD (INAD/TRP/ePKC) в гомогенатах головы захватываются иммобилизованными фрагментами NORPA 863-1095 на Ni-шариках.
  10. Промыть ni-шарики с 10-колонными объемами лизисного буфера (10 мл) при 4 °C и сохранить супернатант от гравитационных осадков для анализа SDS-PAGE (Wash 3, рисунок 4A). Повторите описанные выше шаги и соберите супернатант для анализа SDS-PAGE (Wash 4, рисунок 4A). В этом разделе удаляются несвязанные белки на Ni-шариках.
  11. Добавьте 500 мкл 600 мкМ помеченного GST белка TRP 1261-1275 (3 x 10-7 моль) в Ni-шарики и инкубируйте в течение 20 мин при 4 °C. Повторно суспендируйте бусины каждые 10 минут.
  12. Соберите элюированную фракцию из гравитационного столба (TRP E1, рисунок 4B), который содержит эндогенный канал Drosophila TRP. Повторите описанные выше шаги и соберите фракцию элюирования (TRP E2, рисунок 4B). На этом этапе, используя помеченные GST фрагменты TRP 1261-1275 в качестве конкурента, каналы TRP элюируются из захваченных белковых комплексов INAD (INAD / TRP / ePKC) на Ni-шариках.
  13. Промыть Ni-бусины 10 колонными объемами связывающего буфера (10 мл; Таблица 1) при 4 °C и собрать промывочную фракцию для анализа SDS-PAGE (Wash 5, рисунок 4B).
  14. Добавьте 500 мкл буфера элюирования (таблица 1) в Ni-шарики и инкубируйте в течение 20 мин при 4 °C. Соберите фракцию элюирования из колонки гравитационного потока (NORPA E1, рисунок 4B). Повторите описанные выше шаги и соберите фракцию элюирования (NORPA E2, рисунок 4B).
  15. Используя буфер элюирования, элюируют помеченный His фрагмент NORPA 863-1095, сопровождаемый белковыми комплексами INAD/ePKC. Затем повторно суспендируйте Ni-шарики в 500 мкл связывающего буфера.
  16. Возьмите повторно суспендированные Ni-бусины для запуска SDS-PAGE (окрашенного Coomassie в синий цвет R250), чтобы проанализировать эффективность элюирования и оценить, работает ли буфер элюда (бусины, рисунок 4B). Необходимые материалы см. в таблице 4 .

4. Очистка колонки уменьшения размера канала Drosophila TRP

  1. Установите на систему очистки белка колонку исключения размеров (аналитическую марку). Уравновешивайте колонну с буфером колонны (50 мМ Tris-HCl pH 7,5, 150 мМ NaCl, 2 мМ DTT, 0,75 мМ DDM), который фильтруется фильтром 0,45 мкм.
  2. Концентрируйте фракции TRP E1 и E2 на стадии 3.14 с помощью спиновой колонны ультрафильтрации 4 мл, центрифугированной при 3000 х г при 4 °C в охлажденной центрифуге.
  3. Смойте цикл образца с помощью буфера столбцов и загрузите образец в цикл образца. Вводят образец в колонку исключения размеров и элюируют белки с надлежащей скоростью потока (0,5 мл/мин).
  4. Определите пик целевого белка путем абсорбции при 280 нм и запустите гель SDS-PAGE для обнаружения очищенного эндогенного канала Drosophila TRP (рисунок 5). Необходимые материалы см. в таблице 5 .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этой статье продемонстрирован метод очистки белка для очистки эндогенного канала Drosophila TRP (рисунок 1).

Во-первых, экспрессия и очистка рекомбинантного белка применяются для получения приманки и белков конкурентов. Затем фрагмент TRP 1261-1275, помеченный GST, экспрессируют в клетках E. coli BL21 (DE3) в среде LB и очищают с использованием шариков глутатиона и колонки исключения размера (рисунок 2). Образцы бы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

INAD, который содержит пять доменов PDZ, является основным организатором механизма фототрансдукции Drosophila. Предыдущие исследования показали, что INAD PDZ3 связывается с С-концевым хвостом канала ГТО с изысканной специфичностью (KD = 0,3 мкМ)18. Тандем INAD PDZ45 взаимодействует с фрагментом NORPA 863-1095 с чрезвычайно высоким сродством связывания (KD = 30 нМ). Эти результаты обеспечивают прочную биохимическую основу для разработки стратегии аффинной очистки плюс...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (No 31870746), грантами на фундаментальные исследования в Шэньчжэне (JCYJ20200109140414636) и Фондом естественных наук провинции Гуандун, Китай (No 2021A1515010796) W. L. Мы благодарим LetPub (www.letpub.com) за лингвистическую помощь при подготовке этой рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Bacterial штаммы
BL21(DE3) Компетентные клеткиNovagen69450Сверхэкспрессия белка
Экспериментальные модели
D.melanogaster: W1118 штаммBloomington Drosophila Stock CenterBDSC:3605Дрозофила головка препарат
<сильный>Материал
20/30/40 меш сита из нержавеющей сталиJiufeng металлическая сетка компанияGB/T6003.1Drosophila головка
препарат 30% Акриламид-N,N′-метиленбисакриламид (29:1)LableadA3291SDS-PAGE гель препарат
персульфат аммонияInvitrogenHC2005SDS-PAGE гель-препарат
Коктейльный ингибитор протеазыRoche05892953001Ингибитор протеазы
Coomassie brilliant blue R-250Sangon BiotechA100472-0025SDS-PAGE окрашивание гелем
DL-Dithiothreitol (DTT)Sangon BiotechA620058-0100Выделение размера колоночный буферный препарат
Этилендиаминтетрауксусная кислота динатриевая соль (ЭДТА)Sangon BiotechA500838-0500Выделение размера Колоночный буферный препарат
ГлицинSangon BiotechA610235-0005SDS-PAGE Буферный препарат
Глутатион Сефароза 4 Fast Flow шарикиЦитива17513202Аффинная хроматография
ИмидазолСангон BiotechA500529-0001Элюирующий буфер препарат для Ni-колонки
Изопропил-бета-D-тиогалактопиранозид (IPTG)Sangon BiotechA600168-0025Индукция сверхэкспрессии белка
Порошок бульона LBSangon BiotechA507002-0250E.coli. клеточная культура
L-глутатиона восстановлена (GSH)Sigma-aldrichG4251-100GЭлюционный буферный препарат для гранул
глутатионаNi-Sepharose excel гранулыCytiva17371202Аффинная хроматография
N-додецил-бета-D-мальтозид (ДДМ)Sangon BiotechA610424-001Моющее средство для очистки белка
N,N,N',N'-Тетраметилэтилендиамин (TEMED)Sigma-aldrichT9281-100MLSDS-PAGE гель-препарат
PBSSangon BiotechE607008-0500Гомогенизационный буфер для E.coli. клетки
PMSFLableadP0754-25GИнгибитор протеазы
Престейнированный маркербелка Thermo Scientific26619/26616Престейнированный белок-лестница
Колонка исключения размера (степень препарата)Cytiva28989336HiLoad 26/60 Superdex 200 PG колонка
размера (аналитическая степень)Cytiva29091596Superose 6 Increase 10/300 GL колонка
Хлорид натрияSangon BiotechA501218-0001Буферный препарат для очистки белка
Додецилсульфат натрия (SDS)Sangon BiotechA500228-0001SDS-PAGE гель/буферный препарат
Трис-базаSigma-aldrichT1503-10KGБуферный препарат для очистки белка
Ультрафильтрационный спин колонкаMilliporeUFC901096/801096Концентрация белка
Equipment
Аналитические весыDENVERAPX-60Metage of Drosophila head
Настольная высокоскоростная центрифуга с охлаждением на 15 мл и 50 мл конические центрифугирующие пробиркиEppendorf5810RКонцентрация белка
Настольная высокоскоростная рефрижераторная центрифуга 1,5 мл центрифужные пробиркиEppendorf5417RЦентрифугирование Drosophila головного лизата после гомогенизации
Пустая колонна гравитационного потока (внутренний диаметр = 1,0 см)Bio-Rad738-0015Очистка белка TRP
Пустая колонна гравитационного потока (внутренний диаметр = 2,5 см)Bio-Rad738-0017Очистка приманок и белков конкурентов от E.coli.
Gel Documentation SystemBio-RadUniversal Hood II Gel Doc XR SystemSDS-PAGE imaging
Высокоскоростная охлаждаемая центрифугаBeckman coulterAvanti J-26 XPЦентрифугирование E.coli. клеток/лизата
клеток Гомогенизатор высокого давленияUNION-BIOTECHUH-05Гомогенизация клеток E.coli.
Резервуар для жидкого азотаTaylor-WhartonCX-100Drosophila head Система
очистки белкаОчиститель CytivaAKTAОчистка белка
Холодильник (-80°; C)Thermo900GPem>Drosophila head preparation
СпектрофотометрMAPADAUV-1200OD600 Измерение E.coli.
клеток СпектрофотометрThermo ScientificNanoDrop 2000cОпределение концентрации белка
УльтрацентрифугаBeckman coulterOptima XPN-100 УльтрацентрифугаУльтрацентрифугирование
исключения <

Ссылки

  1. Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
  2. Huang, J., et al. Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors. Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).
  3. Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL. Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).
  4. Hardie, R. C., Franze, K. Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors. Science. 338 (6104), 260-263 (2012).
  5. Chen, W., et al. Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode. Structure. 29 (4), 330-344 (2021).
  6. Hardie, R. C. Effects of intracellular Ca2+ chelation on the light response in Drosophila photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 177 (6), 707-721 (1995).
  7. Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo. Cell. 91 (3), 375-383 (1997).
  8. Hardie, R. C., Minke, B. Phosphoinositide-mediated phototransduction in Drosophila photoreceptors: the role of Ca2+ and trp. Cell Calcium. 18 (4), 256-274 (1995).
  9. Delgado, R., et al. Light-induced opening of the TRP channel in isolated membrane patches excised from photosensitive microvilli from Drosophila photoreceptors. Neuroscience. 396, 66-72 (2019).
  10. Lev, S., Katz, B., Minke, B. The activity of the TRP-like channel depends on its expression system. Channels (Austin). 6 (2), 86-93 (2012).
  11. Hardie, R. C., Raghu, P. Activation of heterologously expressed Drosophila TRPL channels: Ca2+ is not required and InsP3 is not sufficient. Cell Calcium. 24 (3), 153-163 (1998).
  12. Gutorov, R., et al. Modulation of transient receptor potential C channel activity by cholesterol. Frontiers in Pharmacology. 10, 1487(2019).
  13. Yagodin, S., et al. Thapsigargin and receptor-mediated activation of Drosophila TRPL channels stably expressed in a Drosophila S2 cell line. Cell Calcium. 23 (4), 219-228 (1998).
  14. Guo, W., Chen, L. Recent progress in structural studies on canonical TRP ion channels. Cell Calcium. 83, 102075(2019).
  15. Li, X., Fine, M. TRP channel: The structural era. Cell Calcium. 87, 102191(2020).
  16. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
  17. Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504 (7478), 113-118 (2013).
  18. Liu, W., et al. The INAD scaffold is a dynamic, redox-regulated modulator of signaling in the Drosophila eye. Cell. 145 (7), 1088-1101 (2011).
  19. Ye, F., Liu, W., Shang, Y., Zhang, M. An exquisitely specific PDZ/target recognition revealed by the structure of INAD PDZ3 in complex with TRP channel. Structure. 24 (3), 383-391 (2016).
  20. Ye, F., et al. An unexpected INAD PDZ tandem-mediated plcβ binding in Drosophila photo receptors. eLife. 7, (2018).
  21. Rahimzadeh, M., Sadeghizadeh, M., Najafi, F., Arab, S., Mobasheri, H. Impact of heat shock step on bacterial transformation efficiency. Molecular Biology Research Communications. 5 (4), 257-261 (2016).
  22. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, S. Drosophila: A laboratory handbook. Second Edition. 80 (2), The Quarterly Review of Biology. (2005).
  23. Nicolas, G., Sillans, D. Immediate and latent effects of carbon dioxide on insects. Annual Review of Entomology. 34 (1), 97-116 (1989).
  24. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  25. Hellmich, U. A., Gaudet, R. Structural biology of TRP channels. Handbook of Experimental Pharmacology. 223, 963-990 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

TRP DrosophilaINAD

Похожие статьи