Методическая статья

Функциональная оценка кинезина-7 CENP-E в сперматоцитах с использованием ингибирования, иммунофлюоресценции и проточной цитометрии in vivo

DOI:

10.3791/63271

⸱

28 декабря 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine, Fujian Province University, 3Fujian Obstetrics and Gynecology Hospital, 4Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital, Affiliated Hospital of Fujian Medical University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье сообщается о ингибировании CENP-E in vivo с помощью абдоминальной хирургии и инъекции яичек GSK923295, ценной модели для мужского мейотического деления. Используя анализы иммунофлуоресценции, проточной цитометрии и просвечивающей электронной микроскопии, мы показываем, что ингибирование CENP-E приводит к смещению хромосом и нестабильности генома в сперматоцитах мышей.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У эукариот мейоз необходим для стабильности генома и генетического разнообразия при половом размножении. Экспериментальный анализ сперматоцитов яичек имеет решающее значение для изучения сборки веретена и сегрегации хромосом при мейотическом делении самцов. Сперматоцит мыши является идеальной моделью для механистических исследований мейоза, однако эффективные методы анализа сперматоцитов отсутствуют. В данной статье сообщается о практическом и эффективном методе ингибирования in vivo кинезина-7 CENP-E в сперматоцитах мышей. Представлена подробная процедура инъекции специфического ингибитора в яички GSK923295 с помощью абдоминальной хирургии у 3-недельных мышей. Кроме того, здесь описан ряд протоколов для сбора и фиксации тканей, окрашивания гематоксилин-эозином, иммунофлуоресценции, проточной цитометрии и просвечивающей электронной микроскопии. Здесь мы представляем модель торможения in vivo с помощью абдоминальной хирургии и инъекции яичек, которая может стать мощным методом изучения мужского мейоза. Мы также демонстрируем, что ингибирование CENP-E приводит к смещению хромосом и остановке метафазы в первичных сперматоцитах во время мейоза I. Наш метод ингибирования in vivo облегчит механистические исследования мейоза, послужит полезным методом для генетических модификаций мужских половых линий и прольет свет на будущие клинические применения.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мейоз является одним из наиболее важных, очень жестких, эволюционно консервативных событий у эукариотических организмов и необходим для гаметогенеза, полового размножения, целостности генома и генетического разнообразия 1,2,3. У млекопитающих половые клетки подвергаются двум последовательным клеточным делениям, мейозу I и II, после одного раунда репликации ДНК. В отличие от сестринских хроматид при митозе, дублированные гомологичные хромосомы объединяются в пары и разделяются на две дочерние клетки во время мейоза I 4,5. При мейозе II сестринские хроматиды разрываются и разделяются, образуя гаплоидные гаметы без репликации ДНК6. Ошибки в любом из двух мейотических делений, включая дефекты сборки веретена и миссегрегацию хромосом, могут привести к потере гамет, синдромам бесплодия или анеуплоидии 7,8,9.

Накопленные исследования показали, что моторы семейства кинезинов играют решающую роль в регуляции выравнивания и сегрегации хромосом, сборки веретена, цитокинеза и прогрессирования клеточного цикла как в митотических клетках, так и в мейотических клетках10,11,12. Кинезин-7 CENP-E (центральномерный белок E) представляет собой кинетохорный двигатель, направленный на плюс-конец, необходимый для рассеивания хромосом, транспорта и выравнивания хромосом, а также для регуляции контрольной точки сборки шпинделя при митозе 13,14,15,16,17,18. Во время мейоза ингибирование CENP-E специфическим ингибитором GSK923295 приводит к остановке клеточного цикла, смещению хромосом, дезорганизации веретена и нестабильности генома в сперматогенных клетках19. Закономерности локализации и динамика CENP-E в центромерах делящихся сперматоцитов указывают на то, что CENP-E взаимодействует с белками кинетохоров для последовательной сборки центромер во время мейоза I20,21. В ооцитах CENP-E необходим для выравнивания хромосом и завершения мейоза I13,22,23. Инъекция антител или морфолино CENP-E приводит к смещению хромосом, аномальной ориентации кинетохора и остановке мейоза I как у мыши, так и у ооцитов дрозофилы 23. По сравнению с существенной ролью CENP-E в митозе, функции и механизмы CENP-E в мейозе остаются в значительной степени неизвестными. Детальные механизмы CENP-E в хромосомном конгрессе и стабильности генома в мужских мейотических клетках еще предстоит выяснить.

Сперматогенез представляет собой сложный и длительный физиологический процесс, включающий последовательную пролиферацию сперматогонии, мейоз и спермиогенез. Поэтому весь этот процесс чрезвычайно трудно воспроизвести in vitro у млекопитающих и других видов24,25. Индуцировать дифференцировку сперматоцитов после пахитеновой стадии in vitro невозможно. Исследования мужских мейотических делений, как правило, ограничивались экспериментальным анализом ранней мейотической профазы25,26. Несмотря на многие технологические усилия, в том числе кратковременное культивирование сперматоцитов27,28 и методы культивирования органов25, существует мало эффективных методов изучения мужского мейотического деления. Кроме того, генетическая делеция основных генов обычно приводит к остановке развития и эмбриональной летальности. Например, эмбрионы мышей, лишенные CENP-E, не имплантируются и не могут развиваться после имплантации29, что является препятствием для механистических исследований CENP-E в мейозе. Взятые вместе, создание практической и осуществимой системы для изучения мужского мейотического деления может значительно продвинуть область исследований мейоза.

Мелкоклеточный проницаемый ингибитор является мощным инструментом для изучения кинезиновых моторов в процессах деления и развития клеток. Аллостерический ингибитор GSK923295 специфически связывается с моторным доменом CENP-E, блокирует высвобождение АДФ (аденозиндифосфата) и, наконец, стабилизирует взаимодействие между CENP-E и микротрубочками30. В этом исследовании модель мыши с ингибированием in vivo представлена с помощью абдоминальной хирургии и инъекции яичек GSK923295. Ингибирование CENP-E приводит к смещению хромосом в метафазе I первичных сперматоцитов. Кроме того, ингибирование CENP-E приводит к мейотической остановке сперматоцитов и нарушению сперматогенеза. Описан ряд протоколов для анализа сперматоцитов, которые могут быть применены для наблюдения микротрубочек мейотического веретена, гомологичных хромосом и субклеточных органелл в сперматоцитах. Наш метод ингибирования in vivo является эффективным методом для изучения мейотического деления и сперматогенеза.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты на животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Медицинском университете Фуцзянь (номер протокола SYXK 2016-0007). Все эксперименты на мышах проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами Ухода и использования лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения (публикации NIH No 8023, пересмотренные в 1978 году).

1. Построение GSK923295-опосредованных моделей мышей с ингибированием CENP-E

  1. Стерилизуйте хирургические инструменты при температуре 121 °C в течение 30 минут. Облучайте хирургический ультрачистый верстак ультрафиолетом-C (UVC) в течение 2 ч. Взвесьте 3-недельных мышей-самцов ICR (Институт исследований рака), используемых для экспериментов, и рассчитайте необходимые дозы анестетика.
  2. Анестезируют мышей, вводя комбинацию кетамина (100 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг) посредством внутрибрюшинной инъекции. Проверьте глубину анестезии мышей с помощью комбинации мышиного рефлекса роговицы, ноцицептивного рефлекса, дыхания, а также мышечного тонуса. Убедитесь, что мыши находятся под глубоким наркозом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите животное на грелку, чтобы обеспечить тепловую поддержку во время операции.
  3. Свяжите конечности мыши и закрепите их на восковом лотке. Нанесите каплю ветеринарной мази на глаза мыши, чтобы предотвратить сухость под наркозом. Сбрейте волосы на животе мыши от нижней части живота до мошонки с помощью экспериментальной бритвы животного. Закрепите операционную область стерильной простыней.
  4. Продезинфицируйте брюшную полость живота скрабом бетадина, а затем трижды нанесите 75% этанола. Вскройте брюшную полость с помощью стерильного скальпеля и сделайте отверстие <5 мм.
  5. Зажмите кожу стерильными хирургическими зажимами и потяните жировую подушечку придатка яичка стерильными рассекающими щипцами, чтобы найти яички с помощью стерильного пинцета. Зафиксируйте яичко стерильными щипцами под стереоскопом и медленно введите 10 мкл GSK923295 в семенные канальцы в конечной концентрации 10 мкМ, используя 10 мкл реодина30. Для построения контрольной группы вводят 10 мкл 1% раствора ДМСО (диметилсульфоксида)/PBS (фосфатный буферный физиологический раствор).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Храните GSK923295 раствор в концентрации 10 мМ при -80 °C. Растворите 0,1 мкл 10 мМ GSK923295 в 100 мкл раствора PBS для приготовления 10 мкМ раствора GSK923295.
  6. Аккуратно протолкните яичко обратно в брюшную полость стерильными хирургическими щипцами. Сшивают брюшину и кожу отдельно двумя-четырьмя швами, используя линию шва диаметром 0,1 мм.
  7. Пометьте место размером 3 x 3 мм на спине животного перманентным маркером после операции на брюшной полости, поместите мышь обратно в клетку для кормления и обеспечьте чистую среду, свободную от патогенов, с достаточным количеством пищи и воды.
  8. Поддерживайте окружающую среду в стерильном состоянии с помощью отфильтрованного воздуха, стерилизованных продуктов питания и воды. Ухаживайте за животным до тех пор, пока оно не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине. Для послеоперационной анальгезии вводят дозу бупренорфина (0,1 мг / кг) подкожно каждые 12 ч в течение 3 дней. Следите за тем, чтобы мышь не возвращалась в компанию других животных до полного выздоровления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мышам оказывают послеоперационный уход и соответствующим образом вводят в рану местную анестезию с использованием 0,5% лидокаина, чтобы уменьшить послеоперационную боль, когда это необходимо.

2. Окрашивание гематоксилин-эозином (ГЭ) и гистопатология

  1. Через четыре дня после операции на брюшной полости усыпьте мышей CO 2 со скоростью потока 2 л / мин в камере CO2. Подтвердите смерть от вывиха шейки матки в качестве подтверждающего метода эвтаназии. С помощью хирургических ножниц вскройте мошонку и удалите яички щипцами. Собирают семенники мыши через 4 дня после GSK923295 инъекции и фиксируют их в 30 мл 10% раствора формальдегида при комнатной температуре в течение 12 ч.
  2. Для градиентной дегидратации последовательно инкубируют пробу в 40 мл 70% этанола в течение 1 ч, в 40 мл 85% этанола в течение 1 ч, в 40 мл 95% этанола в течение 1 ч и в 40 мл 100% этанола в течение 1 ч.
  3. Инкубируют образец в 40 мл ксилола в течение 40 мин, а затем в 40 мл парафина в течение 1 ч при 65 °C. Поместите салфетки на дно встраиваемой коробки. Добавьте расплавленный парафин в коробку для встраивания. Охладите салфетки до полного застывания при 4 °C в течение 6 часов.
  4. Закрепите образцы на держателе ультрамикротома, держите угол между образцами и поверхностью ножа 5-10° и отрегулируйте толщину среза до 5 мкм. Подготовьте срезы толщиной 5 мкм с помощью ультрамикротома, распределите предметные стекла на водяной бане при 40 ° C и высушите срезы в сушилке для горок в течение 12 часов при 37 ° C.
  5. Инкубировать предметные стекла в 200 мл ксилола в течение 40 мин, в 200 мл 100% этанола в течение 6 мин, в 200 мл 95% этанола в течение 2 мин, в 200 мл 90% этанола в течение 2 мин, в 200 мл 80% этанола в течение 2 мин и в 200 мл 70% этанола в течение 2 мин, соответственно.
  6. Промойте предметные стекла в дистиллированной воде в течение 5 мин и окрашивайте их раствором гематоксилина Майера в течение 6 мин при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор гематоксилина Майера: 0,011 моль/л гематоксилина, 6,7% безводного этанола, 0,646 моль/л сульфата калия алюминия и 0,003 моль/л йодата натрия.
  7. Промойте предметные стекла в проточной воде в течение 5 мин и инкубируйте с дистиллированной водой в течение 2 мин.
  8. Инкубируют предметные стекла в 1% этанолом гидрохлориде в течение 3 с, а затем промывают их в проточной воде в течение 2 мин.
  9. Окрашивают образцы 1% эозином в течение 15 с, а затем инкубируют их с 95% этанолом в течение 5 с, со 100% этанолом в течение 2 мин и в ксилоле в течение 40 мин.
  10. Запечатайте предметные стекла с помощью 15 мкл нейтральной жевательной резинки и покровного стекла размером 24 x 50 мм.

3. Иммунофлуоресценция и конфокальная микроскопия

  1. Соберите парафиновые срезы яичек мыши толщиной 5 мкм для иммунофлуоресценции. Инкубируют предметные стекла в ксилоле в течение 40 мин, в 100% этаноле в течение 6 мин, в 95% этаноле в течение 2 мин, в 90% этаноле в течение 2 мин, в 80% этаноле в течение 2 мин и в 70% этаноле в течение 2 мин. Промойте предметные стекла в дистиллированной воде в течение 5 минут и промойте предметные стекла 0,01 М PBS в течение 5 минут.
  2. Поместите предметные стекла в раствор для извлечения антигена (0,01 М цитратный буфер) и кипятите под высоким давлением в скороварке в течение 4 мин для извлечения антигена. Охладите предметные стекла естественным путем до комнатной температуры. Смойте дистиллированной водой в течение 5 минут дважды, а PBS - в течение 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 0,01 М цитратный буфер (рН 6,0): 2,1 ммоль / л лимонной кислоты, 11,6 ммоль / л дигидрата цитрата тринатрия.
  3. Проникают в клетки путем инкубации предметных стекол в 500 мкл 0,25% TritonX-100/PBS в течение 10 мин. Промойте предметные стекла PBS в течение 5 минут три раза.
  4. Для блокирования антигена инкубируют образцы с 300 мкл 3% бычьего сывороточного альбумина (BSA)/PBST (0,1% Tween-20 в PBS) в течение 1 часа. Инкубируют образцы с первичными антителами в 3% BSA/PBST в течение 16 ч при 4 °C. Положите предметные стекла в увлажненную коробку, чтобы предотвратить высыхание тканей. Разогрейте горки естественным путем до комнатной температуры в течение 30 минут.
  5. Выбросьте первичные антитела, а затем промойте предметные стекла в PBST в течение 5 мин три раза. Разбавляют вторичные антитела в 3% BSA/PBST. Инкубируют образцы со вторичными антителами в течение 1-2 ч при 37 °C. Промойте образцы в PBST в течение 5 минут пять раз.
  6. Окрашивают ядра 50 мкл 4', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в течение 5 мин при комнатной температуре. Установите покровное стекло с помощью монтажного носителя с защитой от выцветания и запечатайте покровное стекло лаком для ногтей.
  7. Наблюдайте и записывайте флуоресцентные сигналы на предметных стеклах с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного объективом NA 40x/0,75.

4. Проточная цитометрия

  1. Соберите семенники мыши в чашки Петри диаметром 6 см и разрежьте семенники на1 мм 3 части с помощью хирургических ножниц.
  2. Переваривают яички, используя 1 мл 1% коллагеназы в центрифужной пробирке объемом 1,5 мл в течение 10 мин при 37 ° C, а затем центрифугируют образцы при 1000 x g в течение 5 мин, чтобы осаждать сперматогенные клетки.
  3. Выбросьте надосадочную жидкость, а затем добавьте 1 мл 0,25% раствора трипсина-ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты) в течение 20 мин при 37 ° C, а затем центрифугируйте образцы при 1,000 x g в течение 5 мин.
  4. Выбросьте надосадочную жидкость, а затем инкубируйте осажденные клетки с 1 мл 70% холодного этанола в течение более 8 ч при 4 ° C.
  5. Центрифугируют образцы при 1000 x g в течение 5 мин, а затем собирают клеточные осадки. Окрашивают сперматогенные клетки окрашивающим раствором 500 мкл йодида пропидия (PI) (50 мкг/мл PI, 100 мкг/мл РНКазы A и 0,2% Triton X-100 в PBS) при 37 °C в течение 30 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно встряхивайте центрифужную пробирку каждые 5 минут, чтобы избежать скопления клеток.
  6. Отфильтруйте образцы с помощью сетки 300 меш, чтобы избавиться от клеточного мусора; соберите клетки в проточную трубку и храните их при температуре 4 °C.
  7. Обнаружение сигналов флуоресценции и рассеяния света на длине волны возбуждения 488 нм с помощью проточного цитометра. Проанализируйте содержание ДНК и рассеяние света с помощью программного обеспечения Modfit MFLT32.

5. Просвечивающая электронная микроскопия

  1. Разрежьте семенники на 1 мм 3 части с помощью острого скальпеля и быстро инкубируйте образцы с3 % глутаровым альдегидом и 1,5% раствором параформальдегида в 0,1 М PBS (pH 7,2) в течение 4 ч при 4 °C, чтобы избежать изменений ультраструктуры. Промойте образцы 0,1 М PBS в течение 5 минут три раза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скальпель и ножницы должны быть острыми, и старайтесь избегать искусственного сдавливания и вытягивания. Обработку образцов следует проводить в фиксирующей жидкости.
  2. Зафиксируйте образцы в 1% растворе осмической кислоты-1,5% ферроцианида калия при 4 °С в течение 1,5 ч. Вытрите воду фильтровальной бумагой и промойте образцы 0,1 М PBS в течение 5 мин три раза.
  3. Обезвоживают образцы в 40 мл 50% этанола в течение 10 мин при 4 °C. Инкубируют образцы в 40 мл 70% этанола, насыщенного ацетатным красителем урана, при 4 °C в течение 12 ч, в 40 мл 90% этанола в течение 10 мин при 4 °C, в 40 мл 90% этанола-ацетона в течение 10 мин при комнатной температуре и в 40 мл безводного ацетона в течение 10 мин три раза при комнатной температуре.
  4. Инкубируют образцы в безводной смеси закладочных агентов ацетон-эпоксидной смолы 618 (v/v=1:1) в течение 1,5 ч, а затем заделывают образцы в добавочные агенты эпоксидной смолы 618 при 35 °C в течение 3 ч.
  5. Для полимеризации смолы образцы инкубируют в добавочных агентах эпоксидной смолы 618 при 35 °C в течение 12 часов, при 45 °C в течение 12 часов, а затем при 60 °C в течение 24 часов.
  6. Установите образцы и стеклянный нож, а затем отрегулируйте расстояния между образцами и ножом. Подготовьте ультратонкие срезы толщиной 90 нм с помощью ультратонкого микротома. Нарежьте образцы с постоянной скоростью, а затем поместите предметные стекла на никелевую сетку. Поместите предметные стекла в чашку Петри комнатной температуры.
  7. Окрашивают предметные стекла 2% уранилацетатом в течение 10 мин, а затем окрашивают образцы 2% цитратом свинца в течение 10 мин. Промойте предметные стекла дистиллированной водой. Сушите предметные стекла в течение 24 ч при комнатной температуре.
  8. Наблюдайте за предметными стеклами и записывайте электронные изображения при напряжении 70-100 кВ с помощью просвечивающего электронного микроскопа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы успешно построили in vivo модель ингибирования CENP-E яичек мыши с помощью абдоминальной хирургии и инъекции яичек GSK92329519. Основные технические этапы этого метода были показаны на рисунке 1. После инъекции яичек GSK923295 в течение 4 дней яички были собраны для дальнейшего анализа. В контрольной группе сперматогенная волна в семенных канальцах была регулярной и организованной (рис. 2А). Однако в GSK923295 группе сперматог...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании мы создали модель ингибирования CENP-E in vivo яичек мыши с использованием абдоминальной хирургии и микроинъекции GSK923295. Абдоминальная хирургия и метод инъекций яичек, используемые в этом исследовании, имеют следующие преимущества. Во-первых, он не ограничивается возрастом мышей. Экспериментаторы могут выполнять инъекцию яичек на ранней стадии, например, у 3-недельных или более молодых мышей. Во-вторых, GSK923295 оказывает специфическое и превосходное ингибирующее действие на CENP-E. В-тр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам раскрывать нечего.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим всех сотрудников лаборатории цитоскелета Медицинского университета Фуцзянь за полезные обсуждения. Мы благодарим Цзюнь-Цзинь Линя из Центра обслуживания общественных технологий Медицинского университета Фуцзянь за техническую помощь в проточной цитометрии. Мы благодарим Минг-Ся Ву и Линь-Ин Чжоу из Лаборатории электронной микроскопии Центра обслуживания общественных технологий Медицинского университета Фуцзянь за техническую помощь в электронной микроскопии. Мы благодарим Си-И Чжэн, Ин Линь, Ци Кэ и Цзюнь Сун из Экспериментального учебного центра фундаментальных медицинских наук Медицинского университета Фуцзянь за их поддержку. Это исследование было поддержано следующими грантами: Национальный фонд естественных наук Китая (грант No 82001608), Фонд естественных наук провинции Фуцзянь, Китай (номер гранта 2019J05071), Проект технологий здравоохранения провинции Фуцзянь (номер гранта 2018-1-69), Фонд стартапов для научных исследований, Медицинский университет Фуцзянь (номер гранта 2017XQ1001), Проект финансирования научных исследований высокого уровня талантов Медицинского университета Фуцзянь (грант No XRCZX2017025) и Исследовательский проект онлайн-образования и преподавания аспирантов китайской медицины (грант No B-YXC20200202-06).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,25% Трипсин-ЭДТАGibco25200056
1 мл ШприцНесколько коммерческих брендов доступныСтерильные.
1,5 мл центрифужная пробиркаAxygenMCT-150-C
50 мл центрифужная пробиркаCorning430828
6 см чашка ПетриCorning430166
95% этанолSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10009164
тубулин кролик поликлональные антителаBeyotimeAF0001Для иммунофлуоресцентных анализов. Используйте в масштабе 1:100.
кролик антигистон H3 (фосфо S10) моноклональное антителоAbcamab267372Для иммунофлуоресцентных анализов. Используйте в масштабе 1:100.
кролик анти-TUBA4A поликлональное антителоSangon BiotechD110022для иммунофлуоресцентных анализов. Используйте в масштабе 1:100.
Моноклональное антитело к SYCP3 кроликаAbcamab175191Для иммунофлуоресцентных анализов. Используйте в масштабе 1:100.
Адгезионный микроскоп предметные стеклаCITOTEST188105
Alexa fluor 488-меченый козий антикроликантитела BeyotimeA0423Sencodary. Используйте в масштабе 1:500.
Сульфат алюминия и калияSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10001060
безводный этанолSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd100092690
Антивыцветающая монтажная средаBeyotimeP0131Предотвращает фотоотбеливание флуоресцентных сигналов.
BD FACS Canto IIBD BiosciencesFACS Canto II
Бычья сыворотка АльбуминSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd69003435
ЦентрифугаEppendorf5424BK745380
ХлоралгидратSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd80037516
Лимонная кислотаShanghai Experiment Reagent Co., Ltd122670
КоллагеназаSangon BiotechA004194-0100
Покровные стеклаCITOTEST10212020C20 × 20 мм. Толщина 0,13-0,16 мм.
DAPIBeyotimeC1006
Чан с красителемДоступно несколько коммерческих брендов91347802
Eosin Y, спирторастворимыйSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd71014460
EtherSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10009318
формальдегид - водный растворSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10010018
GSK923295MedChemExpressHY-10299
Гематоксилин, безводныйSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd71020784
мыши ICRShanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd
Image J программное обеспечениеНациональных институтов здравоохраненияhttps://imagej.nih.gov/ij/анализ флуоресцентных изображений.
Leica ultramicrotomeLeica
EM UC-7 ультрамикротомLeicaEM UC7
Modfit MFLT32Verity Software HouseДля анализа результатов проточной цитометрии.
Лак для ногтейнесколько коммерческих брендов
Нейтральная камедьSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10004160
Nikon Ti-S2 микроскоп NikonTi-S2
Пикриновая кислотаSinopharm Chemical Reagent Co., LtdJ60807
RheodyneSangon BiotechF519160-000110 μ l реодин
Нарезанный парафинSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd69019461
йодат натрияSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd80117214
Хирургические инструментыНесколько коммерческих брендов доступныдля абдоминальной хирургии. Стерилизовать при 121 градусе; C, 20 мин.
Просвечивающий электронный микроскопFEITecnai G2
Дигидрат цитрата тринатрияShanghai Experiment Reagent Co., Ltd173970
Triton X-100Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd30188928Разведите в стерильном PBS до получения 0,25% рабочего раствора.
Tween 20Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd30189328Разведите в стерильном PBS до получения 0,1% рабочего раствора.
ПараформальдегидSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd80096618
XyleneSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10023418
Доступно

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lenormand, T., Engelstädter, J., Johnston, S. E., Wijnker, E., Haag, C. R. Evolutionary mysteries in meiosis. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1706), 20160001(2016).
  2. Brandeis, M. New-age ideas about age-old sex: separating meiosis from mating could solve a century-old conundrum. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 93 (2), 801-810 (2018).
  3. Lane, S., Kauppi, L. Meiotic spindle assembly checkpoint and aneuploidy in males versus females. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 76 (6), 1135-1150 (2019).
  4. Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nature Reviews Genetics. 11 (2), 124-136 (2010).
  5. Miller, M. P., Amon, A., Ünal, E. Meiosis I: when chromosomes undergo extreme makeover. Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 687-696 (2013).
  6. Duro, E., Marston, A. L. From equator to pole: splitting chromosomes in mitosis and meiosis. Genes & Development. 29 (2), 109-122 (2015).
  7. Eaker, S., Pyle, A., Cobb, J., Handel, M. A. Evidence for meiotic spindle checkpoint from analysis of spermatocytes from Robertsonian-chromosome heterozygous mice. Journal of Cell Science. 114, Pt 16 2953-2965 (2001).
  8. Faisal, I., Kauppi, L. Reduced MAD2 levels dampen the apoptotic response to non-exchange sex chromosomes and lead to sperm aneuploidy. Development. 144 (11), 1988-1996 (2017).
  9. Bolcun-Filas, E., Handel, M. A. Meiosis: the chromosomal foundation of reproduction. Biology of Reproduction. 99 (1), 112-126 (2018).
  10. Lawrence, C. J., et al. A standardized kinesin nomenclature. The Journal of Cell Biology. 167 (1), 19-22 (2004).
  11. Cross, R. A., McAinsh, A. Prime movers: the mechanochemistry of mitotic kinesins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 257-271 (2014).
  12. Camlin, N. J., McLaughlin, E. A., Holt, J. E. Motoring through: the role of kinesin superfamily proteins in female meiosis. Human Reproduction Update. 23 (4), 409-420 (2017).
  13. Yen, T. J., Li, G., Schaar, B. T., Szilak, I., Cleveland, D. W. CENP-E is a putative kinetochore motor that accumulates just before mitosis. Nature. 359 (6395), 536-539 (1992).
  14. Wood, K. W., Sakowicz, R., Goldstein, L. S., Cleveland, D. W. CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell. 91 (3), 357-366 (1997).
  15. Abrieu, A., Kahana, J. A., Wood, K. W., Cleveland, D. W. CENP-E as an essential component of the mitotic checkpoint in vitro. Cell. 102 (6), 817-826 (2000).
  16. Mao, Y., Desai, A., Cleveland, D. W. Microtubule capture by CENP-E silences BubR1-dependent mitotic checkpoint signaling. The Journal of Cell Biology. 170 (6), 873-880 (2005).
  17. Gudimchuk, N., et al. Kinetochore kinesin CENP-E is a processive bi-directional tracker of dynamic microtubule tips. Nature Cell Biology. 15 (9), 1079-1088 (2013).
  18. Yu, K. W., Zhong, N., Xiao, Y., She, Z. Y. Mechanisms of kinesin-7 CENP-E in kinetochore-microtubule capture and chromosome alignment during cell division. Biology of the Cell. 111 (6), 143-160 (2019).
  19. She, Z. Y., et al. Kinesin-7 CENP-E regulates chromosome alignment and genome stability of spermatogenic cells. Cell Death Discovery. 6, 25(2020).
  20. Parra, M. T., et al. Sequential assembly of centromeric proteins in male mouse meiosis. PLoS Genetics. 5 (3), 1000417(2009).
  21. Parra, M. T., et al. Expression and behaviour of CENP-E at kinetochores during mouse spermatogenesis. Chromosoma. 111 (1), 53-61 (2002).
  22. Duesbery, N. S., et al. CENP-E is an essential kinetochore motor in maturing oocytes and is masked during mos-dependent, cell cycle arrest at metaphase II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (17), 9165-9170 (1997).
  23. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
  24. Parks, J. E., Lee, D. R., Huang, S., Kaproth, M. T. Prospects for spermatogenesis in vitro. Theriogenology. 59 (1), 73-86 (2003).
  25. Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
  26. Staub, C. A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro. Journal of Andrology. 22 (6), 911-926 (2001).
  27. Handel, M. A., Caldwell, K. A., Wiltshire, T. Culture of pachytene spermatocytes for analysis of meiosis. Developmental Genetics. 16 (2), 128-139 (1995).
  28. La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods in Molecular Biology. 558, 279-297 (2009).
  29. Putkey, F. R., et al. Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Developmental Cell. 3 (3), 351-365 (2002).
  30. Wood, K. W., et al. Antitumor activity of an allosteric inhibitor of centromere-associated protein-E. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5839-5844 (2010).
  31. Nam, D., Sershon, R. A., Levine, B. R., Della Valle, C. J. The use of closed incision negative-pressure wound therapy in orthopaedic surgery. Journal of the American Academy Orthopaedic Surgeons. 26 (9), 295-302 (2018).
  32. She, Z. Y., et al. Kinesin-5 Eg5 is essential for spindle assembly and chromosome alignment of mouse spermatocytes. Cell Division. 15, 6(2020).
  33. She, Z. Y., et al. Kinesin-6 family motor KIF20A regulates central spindle assembly and acrosome biogenesis in mouse spermatogenesis. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1867 (4), 118636(2020).
  34. Wellard, S. R., Hopkins, J., Jordan, P. W. A seminiferous tubule squash technique for the cytological analysis of spermatogenesis using the mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56453(2018).
  35. Sato, M., Ishikawa, A., Kimura, M. Direct injection of foreign DNA into mouse testis as a possible in vivo gene transfer system via epididymal spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61 (1), 49-56 (2002).
  36. Coward, K., et al. Expression of a fluorescent recombinant form of sperm protein phospholipase C zeta in mouse epididymal sperm by in vivo gene transfer into the testis. Fertility and Sterility. 85, 1281-1289 (2006).
  37. Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
  38. Zhao, H. T., et al. LRRK2 antisense oligonucleotides ameliorate α-Synuclein inclusion formation in a Parkinson's Disease mouse model. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 8, 508-519 (2017).
  39. Shahzad, K., et al. CHOP-ASO Ameliorates Glomerular and Tubular Damage on Top of ACE Inhibition in Diabetic Kidney Disease. Journal of the American Society of Nephrology. 3, 2021040431(2021).
  40. Kang, K., Niu, B., Wu, C., Hua, J., Wu, J. The construction and application of lentiviral overexpression vector of goat miR-204 in testis. Research in Veterinary Science. 130, 52-58 (2020).
  41. Karabasheva, D., Smyth, J. T. Preparation of Drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60961(2020).
  42. Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).
  43. Cobb, J., Cargile, B., Handel, M. A. Acquisition of competence to condense metaphase I chromosomes during spermatogenesis. Developmental Biology. 205 (1), 49-64 (1999).
  44. Cobb, J., Reddy, R. K., Park, C., Handel, M. A. Analysis of expression and function of topoisomerase I and II during meiosis in male mice. Molecular Reproduction and Development. 46 (4), 489-498 (1997).
  45. Inselman, A., Handel, M. A. Mitogen-activated protein kinase dynamics during the meiotic G2/MI transition of mouse spermatocytes. Biology of Reproduction. 71 (2), 570-578 (2004).
  46. Muramatsu, T., Shibata, O., Ryoki, S., Ohmori, Y., Okumura, J. Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer. Biochemical and Biophysical Research Communications. 233 (1), 45-49 (1997).
  47. Yamazaki, Y., et al. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells by deoxyribonucleic acid injection into seminiferous tubules and subsequent electroporation. Biology of Reproduction. 59 (6), 1439-1444 (1998).
  48. Yamazaki, Y., Yagi, T., Ozaki, T., Imoto, K. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a marker. The Journal of Experimental Zoology. 286 (2), 212-218 (2000).
  49. Coward, K., Kubota, H., Parrington, J. In vivo gene transfer into testis and sperm: developments and future application. Archives of Andrology. 53 (4), 187-197 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CENP E

Похожие статьи