Тромбоциты — это маленькие, анулярные клетки крови, необходимые для гемостаза, которые происходят из мегакариоцитов (МК) в костном мозге (КМ). Во время дифференцировки из гемопоэтических стволовых клеток МК развиваются в гигантские клетки в сложном процессе дифференцировки и созревания, который включает полиплоидизацию и цитоплазматическое созревание. На заключительной стадии развития, когда МК находятся в контакте с эндотелиальными клетками, они достигают зрелой стадии и расширяют длинные цитоплазматические расширения, называемые протромбоцитами, в кровеносные сосуды, которые затем фрагментируются, давая начало тромбоцитамв кровотоке. Механизмы, регулирующие созревание МК и образование трансэндотелиальных протромбоцитов, до сих пор до конца не изучены. Цель этой коллекции состоит в том, чтобы свести воедино взаимодополняющие методы, которые будут способствовать лучшему пониманию биологии МК in vitro и in vivo.
Экспансия и дифференцировка МК in vitro широко используется для изучения механизмов, лежащих в основе биогенеза тромбоцитов. В протоколе Pongerard et al. авторы описывают стандартизированный культуральный протокол для дифференцировки МК из гемопоэтических предшественников CD34+ человека. Они особо подчеркивают, что лейкоцитарные фильтры, имеющиеся в центрах крови, являются исключительным источником для сбора CD34+ клеток. Их статья содержит несколько основных рекомендаций о том, как извлекать CD34+ клетки, как оценивать их чистоту и важность плотности посева. Авторы также предлагают метод калиброванного пипетирования, пять раз подряд, для эффективного высвобождения функциональных тромбоцитов. Интересными областями применения этого метода являются возможность оценки фармакологических соединений или генетической манипулирования CD34+ клетками с использованием метода редактирования генома CRISPR-Cas9 3,4. Для исследований на мышах Kimmerlin et al. представили стратегию сортировки клеток для очистки предшественников MK в количествах, достаточных для молекулярных и клеточных анализов. Авторы обсуждают преимущества использования гребня подвздошной кости в качестве источника костного мозга, содержащего большое количество гемопоэтических предшественников, и проведения двухэтапного магнитного истощения нежелательных клеток перед сортировкой клеток с использованием комбинации маркеров клеточной поверхности. Основным преимуществом этого метода является сокращение количества животных, необходимых для получения высокоочищенных предшественников МК, что, например, может представлять интерес для исследователей, изучающих иерархию гемопоэтических предшественников и их дифференциацию. В этом контексте Boscher et al. описывают метод выращивания предшественников в 3D-среде, состоящей из 2% метилцеллюлозы, для лучшей имитации среды in vivo. На самом деле, эти авторы ранее продемонстрировали, что МК, выращенные в 3D-гидрогеле, достигают большей степени созревания и большей способности к образованию предшественников по сравнению с теми, которые выращиваются в жидкойсреде5. В этом протоколе выделены такие критические этапы, как соответствующий объем метилцеллюлозы для получения оптимальной жесткости среды, количество клеток, которые должны быть эквивалентными в каждом экспериментальном состоянии, и риск загрязнения. Для функциональной верификации уровня созревания авторы объясняют, как ресуспендировать гелево-культивируемые клетки в жидкой среде на третий день культивирования и как зафиксировать клетки для последующего анализа с помощью иммуноокрашивания, проточной цитометрии или электронной микроскопии. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) является предпочтительным методом визуализации для получения ультраструктуры МК с высоким разрешением. В этой статье Скандола и его коллеги совместно используют протокол для анализа ультраструктуры МК в их естественной среде БМ, а также для количественной оценки плотности их клеток и оценки различных стадий созревания. Авторы используют ПЭМ для анализа клеточных событий, которые происходят при взаимодействии МК с синусоидальной стенкой, таких как их короткие инвазивные подосомоподобные выступы, проникающие в эндотелий6. Ограничением метода является то, что начальная фаза вовлечения МК не может быть проанализирована из-за отсутствия специфических ультраструктурных особенностей этих незрелых клеток. Как уже отмечалось, преимущество этого подхода к визуализации заключается в использовании небольших образцов БМ, что позволяет проводить несколько исследований с помощью одной мыши. В качестве примера, другие образцы костного мозга могут быть использованы для техники эксплантации костного мозга, которая представлена в этой коллекции Guinard et al. для изучения динамического удлинения протромбоцитов из МК. Преимущество этого метода заключается в использовании МК, которые развились в БМ, что позволяет избежать любой потенциальной неправильной интерпретации, возникающей в результате артефактов дифференцировки клеток в культуре. Действительно, это было ранее задокументировано на мышах с MK-ограниченной инактивацией MYH9, где расходящиеся результаты были обнаружены in vitro и ex vivo7. Авторы также подчеркивают простую, воспроизводимую и быструю природу этого подхода. Интересным моментом их протокола является возможность использования микроскопов, оснащенных навигационным программным обеспечением, для облегчения отслеживания/количественной оценки МК, удлиняющих протромбоциты. Дополнительным методом модели экспланта является двухфотонная визуализация МК в черепе мыши. Уникальность этой методики заключается в возможности изучения in vivo динамического поведения флуоресцентно меченых МК в костном мозге и визуализации удлинения протромбоцитов. Преимущество этого протокола заключается в том, что он является минимально инвазивным, с ограниченным хирургическим вмешательством, что позволяет избежать воспалительных реакций, которые, как сообщается, влияют на образование тромбоцитов. Как отмечают Борнерт и др., одним из ограничений этого метода является узкая глубина, которую можно изобразить из-за плотности кости, что также требует использования более молодых мышей. Этот метод может быть применен к генетически модифицированным мышам для изучения роли генов, представляющих интерес, в формировании тромбоцитов in vivo. Например, авторы использовали эту методику, чтобы продемонстрировать, что роль микротрубочек в удлинении протромбоцитов различается между условиями in vitro и in vivo 8.
Аномальное развитие МК и выработка тромбоцитов могут привести к тромбоцитопении или тромбоцитемии, увеличивая риск кровотечения или тромбоза соответственно. Продолжающиеся усилия по анализу молекулярных механизмов, управляющих биогенезом тромбоцитов, увеличат наши возможности по разработке новых стратегий лечения тромбоцитопении и тромбоцитемии. В области исследований в области переливания крови эти усилия заложат основу для производства культивируемых тромбоцитов в качестве альтернативы переливанию крови в отдельных ситуациях9.