Визуализация цитоскелет-зависимого трафика липидсодержащих органелл в эмбрионах дрозофилы

Summary

У раннего эмбриона дрозофилы многие органеллы подвижны. В принципе, они могут быть изображены вживую с помощью специальных флуоресцентных зондов, но яичная скорлупа предотвращает прямое нанесение на эмбрион. Этот протокол описывает, как вводить такие зонды с помощью микроинъекции, а затем анализировать объемное движение органелл с помощью велоциметрии изображения частиц.

Abstract

Ранние эмбрионы дрозофилы представляют собой большие клетки, содержащие широкий спектр обычных и специфических для эмбрионов органелл. В течение первых трех часов эмбриогенеза эти органеллы подвергаются драматическим движениям, приводимым в действие цитоплазматическому потоку на основе актина и моторному трафику вдоль микротрубочек. Разработка множества небольших органелл-специфических флуоресцентных зондов (FP) позволяет визуализировать широкий спектр различных липидсодержащих структур в любом генотипе, что позволяет получать живую визуализацию без необходимости генетически закодированного флуорофора. Этот протокол показывает, как вводить жизненно важные красители и молекулярные зонды в эмбрионы дрозофилы для мониторинга трафика конкретных органелл с помощью живой визуализации. Этот подход демонстрируется маркировкой липидных капель (ЛД) и отслеживанием их объемного движения с помощью велоциметрии изображения частиц (PIV). Этот протокол обеспечивает стратегию, поддающуюся изучению других органелл, включая лизосомы, митохондрии, везикулы желтка и ER, а также для отслеживания движения отдельных ЛД вдоль микротрубочек. Использование коммерчески доступных красителей приносит преимущества разделения на фиолетовые/синие и дальние красные области спектра. Путем мультиплексной совместной маркировки органелл и/или цитоскелетных элементов с помощью микроинъекции все генетические ресурсы дрозофилы доступны для исследований незаконного оборота без необходимости введения флуоресцентно меченых белков. В отличие от генетически закодированных флуорофоров, которые имеют низкий квантовый выход и легко отбеливаются, многие из доступных красителей позволяют быстро и одновременно захватывать несколько каналов с высоким выходом фотонов.

Introduction

Жизненно важные красители и молекулярные зонды являются мощными инструментами для изображения конкретных клеточных структур и живых органелл. У эмбриона дрозофилы многие различные органеллы демонстрируют цитоскелетную локализацию ^1,2,3,4, но применение этих небольших молекул является сложной задачей, потому что яичная скорлупа непроницаема для многих из них. Этот протокол описывает метод использования флуоресцентных зондов (FP) в живых эмбрионах с помощью микроинъекции с целью обнаружения крупномасштабного трафика органелл. Процедура включает в себя приготовление инъекционного раствора, сбор яйцеклеток и подготовку эмбрионов, микроинъекцию, визуализацию и анализ изображений.

Драматические пространственные перестройки органелл распространены во многих ооцитах животных, яйцеклетках и эмбрионах, отчасти из-за большого размера этих клеток. Например, в эмбрионе дрозофилы липидные капли (ЛД) и везикулы желтка движутся к центру эмбриона непосредственно перед клеточной протоклетизацией⁵. Это движение зависит от микротрубочек и оставляет область ~ 40 мкм по всей периферии эмбриона, истощенного двумя органеллами. На более ранних стадиях расщепления многие органеллы транспортируются цитоплазматическими потоками, которые управляются сокращениями на основе актин-миозина на поверхности эмбриона⁶. Хотя эмбрионы многих видов демонстрируют сходные перегруппировки, эмбрион дрозофилы особенно подходит для наблюдения за этими процессами путем визуализации, потому что он развивается внешне при стандартной лабораторной «комнатной температуре», относительно прозрачен, достаточно мал, чтобы поместиться на большинстве микроскопов, и им можно манипулировать с помощью мощных генетических инструментов.

Для некоторых органелл доступны флуоресцентно помеченные белки, которые специально маркируют эти структуры. Например, ЛСД-2 (также известный как dPLIN2) представляет собой белок, который в эмбрионах специфически нацелен на ЛД⁷. Доступны линии мух, которые несут либо индуцируемые трансгены, кодирующие слияние между зеленым флуоресцентным белком (GFP) и LSD-2⁸, либо генную ловушку, в которую желтый флуоресцентный белок (YFP) вставляется в кодирующую область эндогенного гена LSD-2 ^9,10. Однако этот подход имеет ограничения, в том числе то, что эти синтезированные белки имеют низкий квантовый выход и имеют тенденцию легко отбеливаться. Кроме того, маркировка нескольких различных структур одновременно может быть сложной задачей: для многих органелл в настоящее время доступен только один тип флуоресцентной метки (часто GFP или mCherry), поэтому визуализация двух органелл одновременно может потребовать новых трансгенов или вставок; кроме того, даже если доступны совместимые метки, введение их в один штамм может потребовать трудоемких крестов. Это также делает использование многих мощных генетических ресурсов менее удобным, например, если два маркера органелл, драйвер Gal4 и индуцируемая конструкция РНКI должны присутствовать в одной матери.

В принципе, эти ограничения могут быть преодолены с использованием FP, включая жизненно важные красители (например, LysoTracker для маркировки лизосом), молекулярные зонды (например, SiR-тубулин для маркировки микротрубочек) и флуоресцентно меченые биологические молекулы (например, C12 BODIPY для зондирования метаболизма жирных кислот¹¹). От использования в культивируемых клетках они, как правило, хорошо проверены как мощные инструменты для исследования клеточной биологии. FP универсальны, обладают превосходными фотоспособностями и совместимы с флуоресцентными белками. Несколько красителей могут быть смешаны и применены одновременно, часто с преимуществами разделения на фиолетовые / синие и дальние красные области спектра и небольшие сдвиги Стокса, предотвращая кровотечение канала. Небольшие сдвиги Стокса позволяют одновременно захватывать несколько каналов визуализации, что позволяет отслеживать сразу несколько органелл. Наконец, они в равной степени могут быть применены для маркировки органелл в эмбрионах других видов дрозофил или даже других насекомых, где не могут быть доступны флуоресцентно помеченные белки.

Тем не менее, большинство из этих FP не могут пересекать сложную яичную скорлупу эмбриона Drosophila . Он состоит из пяти слоев: трех внешних хорионических слоев (хориона), которые предотвращают механическое повреждение, плюс восковой слой, окружающий вителлиновую мембрану, который создает химический барьер¹². Для простоты комбинация воскового слоя и вителлиновой мембраны будет называться «вителлиновой мембраной» ниже. Чтобы обойти яичную скорлупу, этот протокол адаптирует установленный подход к микроинъекции эмбриона для введения FP в эмбрион дрозофилы . Протокол описывает, как контролировать цитоплазматический поток ЛД в эмбрионах стадии расщепления. Он включает в себя подготовку инъекционных игл и клеток для сбора яйцеклеток, процесс сбора яйцеклеток и механическое удаление хориона. В нем рассматривается, как микроинъектировать и изображать эмбрионы и как анализировать объемный поток ЛД с использованием велоциметрии изображения частиц (PIV, адаптированный из⁶). Он предоставляет рекомендации по устранению неполадок для обеспечения выживания эмбрионов и создания лучшей системы для визуализации. Также обсуждается вопрос о том, как протокол может быть модифицирован для одновременного изображения ЛД и микротрубочек или для применения его для изучения других органелл, включая лизосомы, митохондрии, желтковые везикулы и эндоплазматический ретикулум (ER).

Protocol

1. Подготовьте необходимые материалы

ПРИМЕЧАНИЕ: Эти приготовления лучше всего делать за несколько дней или недель.

1. Подготовьте инъекционные иглы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Иглы могут храниться неопределенно долго в закрытом контейнере. Иглы должны быть достаточно тонкими, чтобы доставить ~ 700 fL, будучи достаточно прочными, чтобы проткнуть мембрану вителлина.
   1. Поместите капилляр в капиллярный держатель на съемнике иглы. Закрепите капилляр с помощью крыльевых гаек. Выровняйте центр капилляра с нагревательным элементом так, чтобы образовались две симметричные иглы.
   2. Выберите соответствующие настройки на съемнике иглы в соответствии с инструкциями производителя.
   3. Выполняйте контроль качества с помощью рассекающей области.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кончики игл должны быть как можно тоньше. Потрескавшиеся, зубчатые или крупнокалиберные кончики игл выбрасываются.
   4. Готовьте партии по 10 игл (5 капилляров) за один раз.
   5. Поместите деформируемую шпаклевку, которая была свернута в цилиндр, в центре дна контейнера с крышкой. Осторожно вдавите иглы в шпаклевку так, чтобы она удерживала их горизонтально с наконечниками игл, надежно подвешенными в воздухе, чтобы предотвратить повреждение. Накройте крышкой и храните до использования.
2. Подготовьте тарелки для сбора яиц. Хранить при температуре 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тарелки для сбора яиц представляют собой небольшие агаровые пластины, дополненные фруктовым соком для стимулирования яйцекладки. Как их подготовить, описано во многих протоколах, в том числе^{в 13}.
3. Приготовьте гептановый клей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот клей извлекается из двусторонней ленты и используется для надежного прикрепления эмбрионов к крышке. Это останавливает эмбрион от выплытия из фокуса во время инъекции и визуализации. Клей можно приготовить за несколько дней или недель раньше срока.
   1. Поднимите двустороннюю ленту на размер больше, чем мяч для гольфа, и поместите ее на дно стеклянного контейнера объемом ~ 50 мл с плотно закрывающейся крышкой. Плотно упакуйте ленту, чтобы присутствовало достаточно клея.
   2. В вытяжном шкафу наполните стеклянный контейнер гептаном, чтобы покрыть всю ленту. Держите контейнер плотно закрытым, когда он не используется.
      ВНИМАНИЕ: Гептан легковоспламеняется в виде жидкости и пара. Это может вызвать раздражение глаз, кожи и дыхательных путей. Пары дыхания могут вызвать сонливость, головокружение и повреждение легких. Храните гептан вдали от источников воспламенения и храните его в хорошо проветриваемом помещении, предназначенном для легковоспламеняющихся веществ, и вдали от несовместимых веществ.
   3. Дайте гептановому клею постоять на ночь или дольше. Для достижения наилучших результатов поместите контейнер на шейкер или другую мешалку на ночь, чтобы помочь с растворением клея.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сама лента останется, но клей растворится в гептане. На этапе 5.1.2 клей наносится на крышку; гептан испаряется, оставляя клей позади.
   4. Проверьте подготовку гептанового клея, поместив его каплю на стеклянную горку и убедившись, что после испарения гептана остается липкий остаток. Если остаток клея не виден после этого, добавьте больше ленты в стеклянный контейнер и повторите предыдущий шаг.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После приготовления клей можно использовать в течение нескольких месяцев или даже лет.
4. Готовят 1 мг/мл (3,8 мМ) БОДИПИ493/503 стоковым раствором путем разбавления коммерчески полученного препарата в чистом безводном ДМСО. Держите его закрытым, чтобы защитить его от света и воды. Хранить бессрочно при температуре -20 °C или при температуре 4 °C.

2. Подготовьте клетки для сбора яиц

ПРИМЕЧАНИЕ: Делайте это, по крайней мере, за день (предпочтительно за 2 или 3 дня) до запланированной инъекции (инъекций).

1. Приготовьте дрожжевую пасту.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Дрожжевая паста дополняет белок и другие жизненно важные питательные вещества, не содержащиеся в тарелках с яблочным соком. Способствует яйценоскости и яйцекладке.
   1. Добавьте 2-10 г сухих пекарских дрожжей, а затем 1 мл водопроводной воды в небольшой стакан. Перемешать шпателем.
   2. Продолжайте добавлять водопроводную воду с шагом 1 мл до тех пор, пока не будет достигнута желаемая консистенция, похожая на зубную пасту.
   3. Накройте смесь крышкой и храните при температуре 4 °C.
2. Установите клетки для мух для сбора яиц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Самцы и самки мух нужного генотипа обязательны: 10-50 самок в возрасте до 2 недель и аналогичное количество самцов. Доступен ряд различных вариантов нахлыстовых клеток, в том числе самодельные варианты^14,13. Важно, чтобы размер тарелок с яблочным соком соответствовал размеру клеток для мух.
   1. Поместите небольшой мазок дрожжевой пасты на тарелку с яблочным соком. Держите его закрытым и дайте ему дойти до комнатной температуры, потому что мухи не будут откладывать яйца на тарелку, если будет слишком холодно.
   2. Перенесите мух в клетку для сбора эмбрионов, запечатайте пластиной с дрожжевым яблочным соком и закрепите пластину в клетке сбора эмбрионов.
   3. Дайте вновь перенесенным мухам акклиматизироваться в клетке в течение 1-2 дней, заменяя тарелку на свежую ежедневно. Если все дрожжи были съедены к следующему дню, увеличьте количество дрожжевой пасты для будущих сборов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это важный шаг для повышения урожайности яиц, так как сытые самки откладывают больше яиц.

3. В день инъекции подготовьте инъекционный раствор и загрузите его в иглу

1. Используйте стандартный раствор BODIPY 493/503 (3,8 мМ в ДМСО) в качестве раствора для инъекций.
2. Загрузите одну иглу 1 мкл инъекционного раствора с помощью наконечников для загрузки иглы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стремитесь доставить жидкость до самого кончика, не улавливая пузырьки воздуха. Будьте готовы быстро заменить загруженную иглу в случае случайной поломки.
   1. Прикрепите загрузочный наконечник к микропипетке и втяните в наконечник 1 мкл раствора для инъекций. Используя перчатки, держите иглу в одной руке, отклонив ее кончик, чтобы свести к минимуму риск поломки.
   2. Осторожно вставьте загрузочный наконечник в иглу и прижмите его близко к кончику иглы. Дозируйте жидкость рядом с кончиком иглы. После снятия пипетки держите иглу вертикально кончиком вниз, пока жидкость не потечет к кончику.
3. Храните загруженные иглы в отдельном контейнере со шпаклевкой, как указано выше (см. шаг 1.1.5).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Иглы должны быть приготовлены заранее (до нескольких часов) инъекции, но не должны использоваться более чем через день.
4. Держите иглы подальше от окружающего света, чтобы предотвратить отбеливание красителей. Накройте контейнер для хранения алюминиевой фольгой, не повредив кончики игл. Убедитесь, что весь свет скрыт.

4. Сбор эмбрионов для инъекций

ПРИМЕЧАНИЕ: Сроки сбора зависят от того, на какой стадии эмбрионов должна быть выполнена инъекция. При приведенной ниже временной схеме эмбрионы на момент подготовки к инъекции будут иметь возраст 0-90 мин, что соответствует¹⁵ стадиям расщепления.

1. В день инъекции приготовьте тарелки с яблочным соком с дрожжами, как на шаге 2.2.1. Если планируется N раундов инъекций, подготовьте N + 2 пластины. Храните эти пластины при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнение к N пластинам для сбора эмбрионов для инъекций, одна пластина необходима в качестве предварительной пластины, а другая для кормления мух в клетке после завершения сбора.
2. Замените пластину на клетке на свежую дрожжевую тарелку (тарелку для предварительного сбора) и оставьте ее на клетке на 1-2 ч.
3. Замените тарелку на клетке свежей тарелкой (коллекционной тарелкой). Отбросьте предсборную пластину, так как она будет содержать эмбрионы старше желаемого. Затем дайте мухам отложить яйца в течение 1,5 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку сытые мухи обычно откладывают яйца вскоре после оплодотворения яиц, время сбора 1,5 часа гарантирует, что в конце сбора большинство эмбрионов на пластине имеют возраст 0-90 минут, то есть находятся в стадии расщепления. Самки мух, которых не кормили свежими дрожжами с предыдущего дня, как правило, сохраняют оплодотворенные яйца в течение некоторого неопределенного количества времени перед откладыванием. Следовательно, на предсборной пластине могут быть эмбрионы, которые были оплодотворены до начала сбора и, таким образом, старше 60 минут, иногда намного старше.
4. Замените тарелку на клетке на свежую дрожжевую тарелку. Накройте тарелку сбора, чтобы бродячие мухи не откладывали на них яйца.

5. Подготовка эмбрионов к микроинъекции

1. Соберите необходимые материалы.
   1. Прикрепите кусок двусторонней ленты к стеклянной горке. Избегайте прикосновения к ленте пальцами, так как это уменьшает ее липкость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот слайд будет использоваться для удаления хориона, а не для визуализации.
   2. Используя передаточную пипетку или микропипетку (p200 или p1000), поместите небольшую каплю (200 мкл или менее) гептанового клея примерно в центр прямоугольного покровного листа (60 x 25 мм). Дайте гептану испариться (это занимает менее мин).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот покров будет использоваться для крепления эмбрионов для инъекций и визуализации. Размеры выбраны таким образом, чтобы поместиться в регулируемый металлический держатель на конфокальном микроскопе.
   3. Соберите сушильную камеру, герметичную камеру (например, сэндвич-коробку Tupperware), содержащую высыхающие шарики. Используйте только высыхающие шарики, которые не увлажнены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы эмбрионы принимали инъекционный раствор, эмбрион должен быть слегка высушен для снижения внутреннего давления. Это делается путем помещения покровного листа с дехорионированными, подвергшимися воздействию воздуха эмбрионами в камеру высыхания.
2. Механически удаляют хорион.
   1. Накройте соответствующим образом выдержанную пластину эмбриона тонким слоем галогенуглеродного масла 27, чтобы сделать яичную скорлупу прозрачной.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы становятся полупрозрачными в течение десятков секунд¹⁵. Если этот шаг не происходит эффективно, тарелки с яблочным соком могут быть слишком влажными и должны быть высушены перед использованием.
   2. Посмотрите на пластину под рассечением с трансиллюминацией (то есть светом, проходящим через пластину в окуляры), чтобы подтвердить стадию эмбрионов.
   3. Отбирайте эмбрионы на стадиях расщепления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы стадии декольте полностью непрозрачны; последующие стадии бластодермы могут быть распознаны по полосе прозрачной цитоплазмы вокруг непрозрачного центра¹⁵. Хорошее введение о том, как распознавать различные эмбриональные стадии, доступно на веб-сайте (приведено в ссылке¹⁶), поддерживаемом Обществом биологии развития.
   4. С помощью тонкого пинцета схватите зародыш нужной стадии за его спинные придатки и перенесите его на подготовленную стеклянную горку, покрытую куском двусторонней ленты. Поместите эмбрион на ленту. Сведите к минимуму перенос масла.
   5. Как можно осторожнее прокатите эмбрион по поверхности ленты, осторожно подталкивая эмбрион стороной кончика пинцета. Не тыкайте эмбрион непосредственно острыми кончиками пинцета.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если приложенное усилие слишком низкое, эмбрион не будет катиться. Если он будет слишком высоким, он лопнет. Нахождение соответствующих промежуточных сил требует опыта, и, таким образом, этот шаг следует практиковать заранее.
   6. Продолжайте катать эмбрион до тех пор, пока хорион временно не прилипнет к ленте и не треснет.
   7. Как только хорион треснет, продолжайте катиться, чтобы отделить эмбрион (все еще внутри мембраны вителлина) от хориона, поскольку хорион остается прилипшим к ленте.
   8. Подтвердите, что хорион полностью удален, наблюдая за потерей дорсальных придатков у эмбриона.
   9. Сверните эмбрион обратно на хорион, который менее клейкий, чем лента. Аккуратно натрите эмбрион пинцетом, пока он не прикрепится к пинцету для переноса.
   10. Перенесите эмбрион на крышку с гептановой клеем и приведите его в контакт с клеем, который обычно отделяет его от пинцета.
   11. Отрегулируйте ориентацию эмбриона на крышке.
       1. Встроить боковую поверхность эмбриона в клей.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Поверхность эмбриона, встроенного в клей, будет изображена. Встраивание боковой поверхности является самым простым, но это может быть скорректировано в зависимости от личных предпочтений или биологического вопроса, на который необходимо ответить.
       2. Ориентируйте длинную ось эмбриона перпендикулярно длинной оси покрова.
       3. Если эмбрион не лежит в предпочтительной ориентации, очистите пинцет, чтобы удалить любое масло, которое отделяет эмбрион от клея. Затем осторожно попытайтесь свернуть эмбрион в положение.
   12. Подготовьте нужное количество эмбрионов для инъекции способом, описанным выше.
       ПРИМЕЧАНИЕ: По прошествии времени после удаления хориона окружающий воздух начнет высушивать эмбрионы, и, таким образом, эффект шага 5.3 будет неравномерным для эмбрионов на покрове, которые были дехорионированы в разное время. Как правило, 1-3 эмбриона являются наиболее управляемыми.
3. Высушить эмбрионы.
   1. Поместите крышку с эмбрионами в подготовленную сушильную камеру и запечатайте ее.
   2. Дайте эмбрионам высохнуть в течение 5-12 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сроки этого этапа зависят от температуры и влажности окружающей среды и, следовательно, должны быть определены эмпирически.
   3. Снимите крышку из камеры и поместите на нее каплю галогенуглеродного масла 700, полностью покрыв эмбрионы, чтобы предотвратить дальнейшее высыхание.
   4. Осмотрите эмбрионы на рассекающемся объеме, чтобы судить о правильном высыхании.
   5. Если эмбрионы просто слегка сморщены, но не сдулись, приступают к микроинъекции (шаг 6).
   6. Если эмбрионы недостаточно или чрезмерно высушены, вернитесь к шагу 5.2 и подготовьте новую партию эмбрионов, так как галогенуглеродное масло 700 не может быть удалено. Если эмбрионы были чрезмерно высушены, сократите время высыхания для следующей партии эмбрионов на 3 мин; если они были недостаточно высушены, увеличьте время высыхания на 3 мин.

6. Микроинъекционные эмбрионы

ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что установка микроинъекции включает в себя перевернутый микроскоп, микроманипулятор для удержания и позиционирования инъекционной иглы и коммерческий микроинжектор для доставки контролируемых объемов.

1. Включите микроинжектор и введите предпочтительные настройки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола рекомендуется использовать линейный выход движения и быструю настройку, но многие другие будут работать. Оператор должен определить личные предпочтения.
2. Загрузите иглу в микроманипулятор. Чтобы предотвратить повреждение иглы при загрузке крышки, содержащей эмбрионы, переместите ее с дороги в безопасное положение.
3. Поместите крышку на сцену с эмбрионами сверху, к игле. Затем осторожно переместите иглу обратно в положение для инъекции, при этом ее кончик все еще значительно выше стадии.
4. Поместите 4-кратный объектив на путь света. Используя ручку фокусировки на микроскопе, поместите эмбрионы в фокус.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет фокальная плоскость, используемая для инъекций, и будет регулироваться только минимально в будущем.
5. С помощью элементов управления стадией переместите эмбрионы горизонтально в центр поля зрения.
   1. Подойдите подальше от эмбрионов, удерживая их на краю поля зрения, в рамках подготовки к опусканию иглы. Оставайтесь в одной фокальной плоскости, чтобы убедиться, что игла опущена в правильное положение.
6. Опустите кончик иглы в правильную фокальную плоскость и убедитесь, что он виден в поле зрения вместе с эмбрионами.
   1. Используя элементы управления микроманипулятора и глядя сверху (еще не через окуляры), медленно опустите кончик иглы в масло, нацеливаясь на область, на которую указывает цель. Поскольку масло довольно вязкое, идите медленно, чтобы не повредить иглу.
   2. Как только игла будет видна через окуляры, продолжайте использовать элементы управления микроманипулятора до тех пор, пока кончик иглы не окажется в фокусе и в центре поля зрения.
   3. Перемещая стадию, верните эмбрионы в центр поля зрения. Используйте управление сценой, микроманипулятор и ручку фокусировки для точной настройки положения эмбриона и кончика иглы относительно друг друга, пока оба находятся в фокусе. Старайтесь выполнять инъекции как можно ближе к крышке.
7. Выполняйте контроль качества игл.
   1. Чтобы убедиться, что игла функциональна, дозируйте часть инъекционного раствора в галогенуглеродное масло 700, окружающее эмбрион, видимое как пузырь в масле.
   2. Если из иглы ничего не вытекает, постепенно увеличивайте давление на инжектор. Если это не сработает, приобретите новую иглу.
8. Введите эмбрион.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Допустимые объемы впрыска варьируются от ~0,06-1 пл. Нижний предел устанавливается тем, что можно визуализировать, входя в эмбрион. Верхний предел устанавливается травмой, которую инъекция оказывает на эмбрион.
   1. Вводите вдоль боковых краев эмбриона, так как это наименее инвазивный.
   2. Используя элементы управления стадией, переместите эмбрион к кончику иглы, пока последний осторожно не проколет эмбрион и не войдет в него.
   3. При этом запустите поток инъекционного раствора и следите за появлением переходного прозрачного пятна на месте кончика иглы, что свидетельствует об успешном переносе жидкости в эмбрион.
   4. Следите за эмбрионом. Если эмбрион сопротивляется игле и разрывается (цитоплазма выплескивается наружу) при входе, вернитесь к шагу 5 и увеличьте время высыхания. Если эмбрион плоский по отношению к покрову и кажется гибким во время инъекции, вернитесь к шагу 5 и сократите время высыхания.
   5. Если краситель не попал в эмбрион, подтвердите, что краситель все еще может свободно течь из иглы, как на этапе 6.7. Если краситель не течет, замените иглу. Если краситель течет, введите новый эмбрион и начните выпускать краситель непосредственно перед тем, как игла проколет эмбрион.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Повторные инъекции одного и того же эмбриона не рекомендуются, так как он разрывает предыдущую рану / место инъекции.
9. Повторяйте до тех пор, пока не будут введены все эмбрионы.

7. Изображение эмбрионов

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использует лазерный сканирующий конфокальный микроскоп.

1. Поместите крышку в металлический держатель на конфокальном микроскопе так, чтобы эмбрионы были изображены непосредственно снизу через крышку; над крышкой есть только масло и никакого другого барьера.
2. В качестве этапа контроля качества сначала используйте функцию эпифлуоресценции на конфокальном микроскопе с 40-кратным объективом. Убедитесь, что флуорофор виден в эмбрионе, прежде чем продолжить.
3. Если желаемая плоскость визуализации отличается от места инъекции, дайте достаточно времени, чтобы краситель диффундировал в целевую область.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для BOPIPY 493/503 это время обычно колеблется в пределах 30-60 мин. Поскольку время диффузии сильно зависит от красителя, другие красители могут потребовать оптимизации места инъекции и времени ожидания.
4. Используйте различные цели для визуализации в разных масштабах. Используйте объектив 40x для изображения всего эмбриона и 63x объектив для изображения подразделов для меньших масштабов.
5. Для визуализации в реальном времени во время синцитиальных стадий перед сотовой связью используйте следующие условия для начала: размер изображения 512 x 512 пикселей, среднее линейное значение 3, частота кадров 0,1 кадра в секунду (т. Е. 1 кадр, полученный каждые 10 с). Отрегулируйте условия в соответствии с возможностями используемого микроскопа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти условия позволяют получить ~500+ изображений из BOPIPY 493/503 и захватить большую часть движения.

8. Анализ потока LD сначала с помощью FIJI для подготовки временных рядов изображений, а затем python для анализа PIV

1. Оптимизируйте получение изображений.
   1. Выполняют инъекции нужного красителя на соответствующем этапе. Повторяйте этот шаг до тех пор, пока ежедневные изменения не будут незначительными.
   2. Оптимизируйте параметры получения изображений, включая увеличение, масштабирование, разрешение и частоту кадров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Существует компромисс между высококачественными изображениями (разрешение + усреднение строк) и скоростью захвата (частота кадров).
2. Подготовка данных на ФИДЖИ.
   1. Приобретите высококачественные временные ряды для анализа.
   2. Откройте один кадр временного ряда, чтобы создать маску с помощью FIJI. Продублируйте изображение. Преобразуйте тип изображения в 8 бит.
   3. Определите границу эмбриона с помощью инструмента « Полигон » или «От руки». Используйте команду «Очистить снаружи», чтобы присвоить значениям пикселов вне выделенной области значение 0. Очистить , а затем Инвертировать в выделенной области, чтобы установить максимальное значение пикселов в выделенной области (255).
   4. Снимите флажок, затем используйте команду Histogram , чтобы убедиться, что присутствуют только значения пикселей 0 и 255.
   5. Сохраните эту новую маску изображения для определенного временного ряда.
   6. Откройте интересующий временной ряд. Выберите, какие десять кадров лучше всего фиксируют интересующее время, например, ядерный цикл 9 в начале коркового сокращения. Дублируйте десять интересующих кадров, образуя подстек.
   7. Используйте функцию Stack to Images для создания 10 изображений для анализа с помощью PIV.
   8. Сохраните отдельные файлы таким образом, чтобы сохранить их порядок (SeriesX_1, SeriesX_2, SeriesX_3 ...).
3. Используйте подготовленную маску и отдельные кадры для анализа PIV, используя предоставленный пример скрипта python (Дополнительные данные) или пользовательский скрипт, сгенерированный пользователем.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Предоставленный скрипт основан на приложении python OpenPIV¹⁷. Он выводит расстояние в пикселях, которые могут быть преобразованы с использованием ширины пикселей и частоты кадров для создания скоростей или скоростей.
4. Создайте реплики, выполнив предыдущие шаги для дополнительных эмбрионов и скомпилировав выходные значения.

Results

После инъекции краситель будет локализован только в том месте, где был вставлен наконечник иглы. Затем краситель будет диффундировать от места инъекции в зависимости от его диффузионных характеристик. На рисунке 1 показана инъекция BODIPY 493/503 вскоре после инъекции (панель A) и через 24 мин (панель B). Через 24 минуты краситель добрался примерно до средней точки длинной оси эмбриона.

Анализ подвижности органелл может быть достигнут с помощью инъекций красителя и покадровой визуализации. На рисунке 2 эмбрион вводили совместно с BODIPY 493/503 (Рисунок 2A) и LysoTracker Red (Рисунок 2B) и визуализировали с использованием лазерного возбуждения при 488 и 596 нм соответственно. Затем этот эмбрион был визуализирован (один кадр каждые 30 с в течение 30 мин, анализировался 5 мин). Затем временные ряды были выполнены с помощью анализа PIV, результаты которого показаны с помощью оптимизаций на рисунке 2A, B. Обратите внимание, что обтекаемые части не представляют траекторию отдельных частиц, но цитоплазматический поток выводится из анализа всех частиц в этой области цитоплазмы. Благодаря маркировке двух независимых клеточных структур (ЛД и кислых органелл) анализ PIV обнаруживает аналогичные потоки, причем обе метки сходятся в центральной области эмбриона, где цитоплазма течет внутрь эмбриона⁶.

Доступные в настоящее время FP позволяют маркировать многие другие органеллы и клеточные структуры. На рисунке 3 показана маркировка ER с помощью трекера ER Green. Трекер ER обеспечивает хорошее разрешение ядерной оболочки, позволяя визуализировать основные стадии клеточного цикла. Трекер ER Green визуализируется с использованием возбуждения 488 нм.

Маркировка митохондрий сложна, так как большинство протестированных красителей, по-видимому, попадают в ловушку в первых митохондриях, в которые они входят. С другой стороны, не было обнаружено никаких признаков токсичности красителей, что позволило проследить за мечеными митохондриями через клеточную проветрование и эктодермальный ядерный цикл 15. На фиг.4 показана эктодермальная клетка через несколько часов после инъекции с Mitoview 633 (длина волны возбуждения 633 нм).

BODIPY, Lysotracker и LipidSpot являются надежными и могут использоваться для получения ~ 500 + изображений при 512 x 512, средней линии 3, частоте кадров от 1 / с до 0,1 / с. ER-трекер Green, SiR-тубулин и упомянутые митохондриальные красители менее надежны и дают ~ 50-200 изображений при тех же условиях.

Начиная со стадий бластодермы, ЛД движутся двунаправленно вдоль микротрубочек, приводимых в действие двигателями противоположной полярности кинезин-1 и цитоплазматическим динеином⁵. Это движение может быть визуализировано путем совместной маркировки ЛД и микротрубочек путем инъекции как BODIPY 493/503, так и SiR-тубулина (рисунок 5). Поскольку ЛД часто меняют направление своего движения (поскольку они переключаются между кинезином-1 и цитоплазматическим динеином), более высокая частота кадров во время захвата лучше захватывает критические детали подвижности LD.

Живая визуализация везикул автофлуоресцентного желтка возможна без какой-либо формы инъекции красителя (рисунок 6). Однако автофлуоресценция тусклая, а лазер возбуждения фототоксичный. Таким образом, живая визуализация автофлуоресцентного желтка имеет плохое отношение сигнал/шум по сравнению с инъекцией красителя.

Рисунок 1: Диффузия BODIPY 493/503 через эмбрион. Краситель вводили вдоль бокового края к переднему концу (вверху справа) и диффундировали из этого места инъекции в эмбрион, маркируя ЛД. (А) Краситель диффундировал через части эмбриона, прилегающие к месту инъекции. (B) Примерно через 24 мин/2 ядерных цикла краситель диффундировал за пределы средней точки эмбриона. Шкала: 100 мкм. Рама 1024 x 1024 (в среднем по линии 4) приобреталась каждые 30 с. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Велоциметрия изображения частиц (PIV) для ЛД и кислых органелл. Эмбриону вводили BODIPY 493/503 и LysoTracker Red. (A) Канал БОДИПИ. (B) Красный канал LysoTracker. (А',Б') Оптимизируйте диаграммы, генерируемые PIV-анализом двух каналов, генерируемых из 10 последовательных кадров, включая те, которые показаны в A и B. A' соответствует потоку ЛД, а B' соответствует потоку кислых органелл. Обратите внимание, что и A', и B' показывают слияние слева от центра, где эмбриональное содержимое вытекает из плоскости зрения в центр эмбриона. Кроме того, обратите внимание, что BODIPY рассеивается больше, чем LysoTracker, поскольку разные красители имеют разные диффузионные свойства. Шкала: 100 мкм. Рама 1024 x 1024 (в среднем по линии 4) приобреталась каждые 30 с. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Трекер ER метит синцитиальные ядерные деления. Синцитиальный эмбрион бластодермы был микроинъектирован с помощью трекера ER, и часть его поверхности была изображена с течением времени. (A) Сборка шпинделя во время ядерного подразделения. B) абсциссия ядерной оболочки в ходе того же деления. с) последующая интерфаза. D) Начало следующего деления обозначается появлением центросом (появление круговых областей, свободных от ЭР, отмеченных наконечниками стрелок). Обратите внимание на постепенное отбеливание красителем. Длина волны возбуждения: 488 нм. Шкала: 5 мкм. A: начальный кадр, B: 3 мин, C: 10 мин, D: 13 мин. Рама 1024 x 1024 (в среднем по линии 4) приобреталась каждые 30 с. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Маркировка митохондрий Mitoview 633. Эмбрион вводили Mitoview 633 во время синцитиальной стадии бластодермы и визуализировали через 4 ч, после клеточной протоклетизации. На изображении показана нейроэктодермальная клетка эмбриона в расширении зародышевой полосы. Шкала: 5 мкм. Рама 1024 x 1024 (в среднем по линии 4) приобреталась каждые 30 с. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Совместная маркировка ЛД и микротрубочек. Клеточному эмбриону вводили смесь BODIPY 493/503 (желтый A,B,C) и SiR Tubulin (пурпурный A',B',C'). A'', B'', C'' показывают объединенные каналы. Панели A, A' и A'' показывают начальный кадр, панели B, B' и B'' показывают кадр через 5 с, а панели C, C' и C'' показывают кадр через 10 с. Шкала: 5 мкм. Рама 512 x 512 (средняя линия 3) приобреталась каждые 2,5 с. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Визуализация желточного пузырьков автофлуоресценции во время синцитиальных стадий расщепления. (А) В начале сбора. (B) Через 8 мин. (C) Через 16 мин. Длина волны возбуждения: 405 нм. Низкая интенсивность возбуждения использовалась для поддержания жизни эмбриона. Шкала: 100 мкм. Рама 1024 x 1024 (в среднем по линии 4) приобреталась каждые 30 с. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительные данные. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Эмбрион дрозофилы является мощной и удобной моделью для изучения фундаментальных вопросов клеточной и организменной биологии. Его относительная простота, мощная генетика и небольшие размеры делают его отличной системой для визуализации как клеточных процессов, так и развития. Здесь стандартный протокол микроинъекции адаптирован для обеспечения использования FP у эмбрионов. Этот подход позволяет флуоресцентную визуализацию конкретных клеточных структур без необходимости в генетически закодированных флуорофорах, открывая многие генетические фоны для визуализации. Сочетание нескольких красителей и стратегически выбранных флуоресцентно помеченных белков может открыть многоканальную живую визуализацию, охватывающую весь спектр видимого света.

Критические шаги в протоколе:
Этот протокол использует BODIPY 493/503 для маркировки ЛД. Этот подход может быть легко адаптирован для маркировки других клеточных структур. Для последующего анализа изображения одним из наиболее важных факторов является отношение сигнал/шум, т.е. яркость красителя по сравнению с фоновым сигналом. Лизосомы были успешно сфотографированы (LysoTracker Red, 1 мМ), а также митохондрии (Mitoview 633, 200 мкМ), ER (ER tracker Green, 10 мкМ) и микротрубочки (SiR тубулин, 200 нМ в DMSO), как показано на рисунке 2, рисунок 3, рисунок 4, рисунок 5. Кроме того, везикулы желтка являются автофлуоресцентными и выделяют синий свет при УФ-возбуждении (изображение с использованием 405 нм в качестве длины волны возбуждения (рисунок 6)). Для других красителей стремитесь к тому, чтобы концентрация красителя составляла 100-1000x от того, что было бы необходимо для окрашивания культивируемых живых клеток; это аналогично концентрации исходного раствора, который будет разбавлен в клеточных культуральных средах. Поскольку этот протокол требует инъекции 100 fL, а эмбрион Drosophila составляет примерно 9 nL в объеме¹⁸, эти концентрации красителя будут усредняться до внутренней эмбриональной концентрации менее 1/100 от того, что присутствует в клеточной культуральной среде. Временно местная концентрация будет выше в месте инъекции, что наиболее актуально для FP, которые плохо диффундируют (т.е. митохондриальные красители и SiR-тубулин). Для этих FP начните с рекомендуемых высоких концентраций; если наблюдается неожиданная смерть, последовательно разбавляйте в два раза до тех пор, пока не будет достигнут приемлемый компромисс между выживаемостью и силой сигнала.

При совместном введении нескольких красителей оба красителя должны либо находиться в одном растворителе, либо и растворители, и красители должны быть совместимы со смесью (концентрации спирта, превышающие ~10%, не рекомендуются).

Качество игл имеет важное значение для успеха этой процедуры, так как наконечник должен быть как можно тоньше. В противном случае повреждение от инъекционной раны может поставить под угрозу последующее развитие эмбриона. Поскольку коммерческие съемники игл различаются, важно следовать рекомендациям производителя и опробовать несколько параметров вытягивания, пока не будет достигнута желаемая форма. Крайне важно выполнить этап контроля качества 1.1.3, так как работа с треснувшим, зазубренным или большим отверстием наконечника иглы сделает успешную инъекцию более сложной или даже невозможной.

Эмбрион должен быть частично высушен, чтобы во время инъекции можно было добавить дополнительные объемы жидкости. Если эмбрион недостаточно высушен, игла не войдет легко, и цитоплазма будет выплескиваться при проникновении иглы или при введении раствора. Если эмбрион чрезмерно высушен, он будет выглядеть сдутым и не будет развиваться должным образом. Точное время сушки зависит от местных условий, например, влажности воздуха, и может меняться изо дня в день. Он должен определяться эмпирически для каждой сессии.

Способность эмбриона выживать после микроинъекции критически зависит от качества иглы, правильного высыхания и ограничения объема инъекции менее чем 1 пл (в идеале 100 л). До тех пор, пока эти параметры оптимизированы, при введении описанных красителей в рекомендуемых концентрациях не проявляется значительной токсичности. Если эмбрионы выживают на этапах высыхания и инъекции, они, как правило, успешно развиваются в расширение зародышевой полосы, исключением являются микротрубочки и зонды ER, которые вызвали дефекты клеточности на высоких уровнях (инъекция 100 fL концентрации запаса каждого). Тестирование не выявило явных дефектов развития, когда ДМСО, вода и смеси этих двух веществ вводились в рекомендуемых объемах, с выживаемостью эмбриона через расширение микробной полосы ~ 75% или более. Объемы инъекций более 1 пЛ вызывали дефекты, и эмбрионы, введенные с объемами ~ 4 пЛ, развивались менее чем за 1 ч. Поэтому объемы инъекций должны быть низкими, а это означает, что концентрации красителя должны быть высокими.

Как правило, инъекции вдоль бокового края эмбриона рекомендуются, поскольку они приводят к наименьшему повреждению. Тем не менее, место инъекции, возможно, потребуется скорректировать в зависимости от диффузионных свойств используемых FP. BODIPY 493/503 и LysoTracker диффундируют быстрее по всему эмбриону, чем Lipid Spot 610 (еще один краситель для маркировки ЛД), в то время как SiR-тубулин и Mitoview 633 никогда полностью не диффундируют по эмбриону (визуализация уже через 7 ч после инъекции). Таким образом, может потребоваться инъекция в интересующее место или рядом с ним. При инъекции в переднюю или заднюю область рекомендуется особенно тонкая игла.

Получение изображений опирается на конфокальную микроскопию для оптического сечения и разрешения малых органелл и всех компонентов цитоскелета. Методы, требующие анализа многих изображений (например, STORM или PALM), не будут работать, потому что эмбриональное содержимое находится в движении, а флуорофоры не оптимизированы для переключения фотографий. Эпифлуоресцентной микроскопии не хватает бокового и осевого разрешения, чтобы разглядеть большинство органелл и более мелких клеточных структур. По этим причинам настоятельно рекомендуется использовать конфокальный микроскоп или использовать технологию световых листов.

Воспроизводимость анализа изображений в значительной степени зависит от последовательных данных изображения. Для получения наибольших шансов на успех требуется оптимизация техники впрыска и получения изображения. Создание и практика техники, в которой краситель (красители), представляющий интерес, место инъекции, возраст эмбриона, объем инъекции и установка приобретения являются согласованными, будет генерировать наиболее надежные данные для анализа изображений.

Модификации и устранение неполадок метода
Этот протокол демонстрирует метод анализа объемного потока ЛД в эмбрионах стадии расщепления с использованием велоциметрии изображения частиц. Тот же подход может быть использован для других органелл, других стадий развития и других методов анализа. Например, на рисунке 2 показан анализ ЛД и кислых органелл, протекающих на синцитиальных стадиях эмбриогенеза, визуализируемых путем совместного введения BODIPY 493/503 и LysoTracker Red. Достигнута дальнейшая успешная визуализация движения ЛД у эмбрионов до 7 ч после оплодотворения; эти эмбрионы сохраняют инъекционную рану, но способны развиваться в течение нескольких часов.

Данные, собранные с использованием этого протокола, использовались для велоциметрии изображений частиц, но доступно много других методов анализа. Например, программы отслеживания частиц, подобные тем, которые находятся в ImageJ, Imaris или ручном отслеживании, могут использоваться для получения скоростей и направленности движущихся структур. Обратите внимание, что большинство таких программ для отслеживания созданы для работы с данными из систем плоских клеточных культур и не всегда хорошо адаптируются к 3D-структурам, таким как эмбрион дрозофилы . Кроме того, для получения данных отслеживания частиц наилучшего качества необходимо будет визуализировать несколько плоскостей Z; это должно быть осуществимо, если время получения стека изображений составляет менее ~2 с. Этот критерий должен быть достигнут на конфокальных вращающихся дисках, решетчатых световых листах и последних лазерных сканирующих конфокальных системах. Однако возможность отслеживания частиц для обильных органелл, таких как ЛД, митохондрии и лизосомы, низка, поскольку количество положительного сигнала в поле зрения слишком велико для современных методов отслеживания. Отслеживание менее обильных структур, таких как ядра или желточные пузырьки, может быть возможным. PIV для анализа потока хорошо работает для ЛД и кислых органелл на стадиях расщепления, потому что обе органеллы движутся свободно. Органеллы, такие как ядра, ER и митохондрии, привязаны к другим клеточным структурам и, таким образом, не движутся свободно и не подходят для программного анализа, который предполагает свободное движение. Исследователь должен выбрать методы, наиболее подходящие для интересующей органеллы.

Во время синцитиальной и клеточной стадий бластодермы ЛД (а также некоторые другие органеллы) движутся по радиально ориентированным микротрубочкам⁵. Таким образом, можно найти поперечные виды (как на рисунке 5), где одиночные микротрубочки находятся в фокусе на больших расстояниях, что позволяет отслеживать частицы в 2D. Поскольку эти оптические плоскости находятся глубоко внутри эмбриона, общая сила сигнала уменьшается, а отношение сигнал/шум уменьшается.

Для анализа отслеживания визуализация как можно быстрее может выявить важные детали движения и, следовательно, подвижного механизма. Например, липидно-капельное движение представляет собой смесь двух подвижных состояний: медленно-короткого движения (~200 нм/с; среднее расстояние перемещения ~100 нм) и быстрого-длинного движения (~450 нм/с; среднее расстояние перемещения ~1000 нм)¹⁹; таким образом, если снимки делаются каждую секунду или даже реже, медленно-короткое состояние становится незаметным. Однако частая визуализация также вызывает отбеливание флуорофоров и фототоксичность. Поэтому условия визуализации должны быть скорректированы в зависимости от конкретного вопроса, который необходимо решить.

Ограничения метода
В зависимости от желаемого красителя способ может быть ограничен совместимостью между растворимостью красителя и токсичностью инъекционного раствора. Спирты, такие как изопропанол и этанол, трудно обрабатывать внутри иглы из-за их более низкой вязкости и, по-видимому, повреждают клеточные компоненты и убивают эмбрион.

Метод также не очень хорошо подходит для визуализации самых ранних этапов эмбриогенеза, потому что для подготовки эмбрионов к инъекции требуется более 30 минут. При комнатной температуре начальные клеточные циклы эмбриона длятся всего ~10 мин каждый; Таким образом, даже если бы кто-то выбрал недавно оплодотворенную яйцеклетку на этапе 5.2.3, первые несколько клеточных циклов уже были бы завершены к тому времени, когда эмбрион будет готов к визуализации.

Освещение светом в УФ/синем диапазоне значительно более фототоксично, чем для более длинных волн. В таких условиях (например, следовать автофлуоресцентным желтку везикулами; Рисунок 6), необходимо ограничить время визуализации (что приводит к более коротким временным рядам) или использовать более низкую мощность лазера (что приводит к снижению отношения сигнал/шум).

После клеточности красители, вводимые в определенное место, имеют тенденцию плохо диффундировать, так как они должны пересекать многие клеточные мембраны. Это ограничивает область наблюдения на более поздних стадиях развития.

Значение метода по отношению к существующим/альтернативным методам
Движение ЛД и других липидсодержащих органелл у ранних эмбрионов может быть визуализировано с помощью генетически закодированных флуорофоров, методов без меток и путем введения FP. Последнее может быть достигнуто путем пермеабилизации вителлиновой мембраны¹² или микроинъекционного подхода, обсуждаемого здесь.

Генетически закодированные флуорофоры являются универсальными маркерами, уровни которых обычно хорошо воспроизводимы от эмбриона к эмбриону. Тем не менее, они имеют более низкий квантовый выход и отбеливаются легче, чем FP. Как правило, они доступны только в одной или двух помеченных версиях (например, GFP или mCherry), ограничивая выбор того, какие структуры могут быть изображены одновременно. FP, с другой стороны, часто существуют в большом разнообразии; например, различные липидно-капельные специфические красители доступны с спектрами излучения от Autodot в УФ/синем спектре до Lipidtox и LipidSpot 610 в дальне-красном спектре. FP также могут быть непосредственно применены к любому интересующему штамму и, таким образом, не требуют конструирования штамма, чтобы, например, ввести желаемый маркер органеллы в интересующий мутантный штамм. Это преимущество особенно ярко выражено, когда несколько структур должны быть обозначены одновременно; вместо трудоемких крестов, охватывающих несколько поколений, это может быть достигнуто за один день путем смешивания соответствующих красителей и одновременного введения их. Наконец, если клеточные процессы должны быть исследованы с фармакологическим ингибированием, лекарства и красители могут быть введены вместе.

Методы без меток являются очень мощными подходами для обнаружения конкретных клеточных структур. Например, ЛД могут быть специфически обнаружены у ранних эмбрионов с помощью микроскопии третьей гармонической генерации²⁰ или фемтосекундной микроскопии²¹ с стимуляцией рамановской потери. Как и FP, эти подходы могут применяться в любом генетическом фоне, и, поскольку они не вызывают обесцвечивания, они потенциально позволяют быстрее получать изображения. Однако они, как правило, ограничены конкретными органеллами и, таким образом, сами по себе не поддерживают мультиплексную визуализацию; они также требуют специализированных микроскопов.

Существует две общие стратегии введения малых молекул в эмбрионы. Одним из них является используемый здесь подход к микроинъекции; другая - химическая (терпеновая) обработка для пермеабилизации вителлиновой мембраны. Последний подход¹² менее вовлечен, чем микроинъекция, но также более изменчив от эмбриона к эмбриону. Кроме того, после пермеабилизации защита, обеспечиваемая вителлиновой мембраной, скомпрометирована, и собственно эмбрион доступен для внешней среды, что затрудняет его поддержание в живых. Микроинъекция гораздо реже срывает эмбриональное развитие, чем пермеабилизация. Тем не менее, пермеабилизация рекомендуется, если необходимо одновременно контролировать много эмбрионов, например, для целей скрининга лекарств. Чтобы проследить за движением клеточных структур и получить воспроизводимые ряды изображений, пригодные для анализа изображений, микроинъекция является методом выбора.

Важность и потенциал применения метода в конкретных областях исследований
Эмбрион дрозофилы является важной модельной системой для изучения многих клеточно-биологических процессов и процессов развития ^1,5,6. Маркировка органелл флуоресцентными белками внесла большой вклад в понимание того, как развивается ранний эмбрион, как движутся различные органеллы и как такой трафик модулируется в развитии и генетически. Однако их склонность к отбеливанию и проблемы генерации штаммов, в которых несколько органелл помечены разными цветами, ограничивают применение этого подхода. Использование FP, введенных микроинъекцией, решает многие из этих проблем и даже может сочетаться с флуоресцентно помеченными белками. Этот метод позволяет визуализировать множественные органеллы, клеточные структуры и компоненты цитоскелета в любом генетическом фоне. В результате несколько генотипов могут быть сопоставлены с помощью живой визуализации, что позволяет определить влияние мутаций на трафик множественных органелл.

Этот протокол демонстрирует подход к инъекциям FP для эмбрионов Drosophila melanogaster, но в принципе этот подход применяется к любым яйцам насекомых, для которых были установлены методы микроинъекции, включая другие виды Drosophila, сверчков²² и тли²³.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AUTODO	abcepta	SM1000a	Окрашивает липидные капли в фиолетовый/синий
цвет BODIPY 493/503	ThermoFisher	D3922	Окрашивает липидные капли в зеленый
цвет Адсорбирующие бусины – Влагопоглотительно-Индикационный дриерит	W.A. Hammond Drierite Company	21001
Препарирующий микроскоп SteREO DiscoveryV20 с транслюминатовым основанием	Zeiss	4350030000000000
Двухсторонний скотч-Перманентный двусторонний скотч	(3M)	-	Продается многими поставщиками
ER-Tracker Green (BODIPY FL Glibenclamide)	ThermoFisher	E34251	Окрашивает ER/ ядерный конверт
Femptotip II	Eppendorf	H129354N	Готовый к использованию
Стеклянные капилляры -Стекло тонкое с фильтром 1,0 мм 4 дюйма	World Precision Instruments	TW100F-4	Необходимо вытянуть
Стеклянный покровный листок	-	-	Купите подходящий показатель преломления для объектива вашего объектива
Стеклянные стекла -Двойной матовый микроскоп Предметные стекла предварительно очищены	FisherBrand	12-550-343
Галоуглеродное масло 27	Sigma-Aldrich	H8773-100ML
Галоуглеродное масло 700	Sigma-Aldrich	H8898-50ML
Гептан более экологичная альтернатива безводный, 99%	Sigma-Aldrich	246654-1L	Гептан считается токсичным
конфокальным микроскопом	Leica	Sp5	Множество различных типов конфокальных Подойдут микроскопы.
LipidSpot 610	Biotium	#70069	Окрашивает капли липидов в дальний красный
цвет LysoTracker Red	ThermoFisher	L7528	Окрашивает лизосомы в красный
цвет MitoView 633	Biotium	#70055	Окрашивает митохондрии
Наконечники для пипеток с игольчатой загрузкой - наконечники для микродозаторов объемом 20 мкл	Eppendorf	# 5242956.003
P-1000, Пуллер	для микропипеток нового поколенияSutter Instruments	P-1000	Используются следующие настройки: тепло-470, тяга-70, скорость-60, задержка-90, давление-200, рампа-479 при 1х1. Они относятся к интенсивности и продолжительности нагрева, времени тягового усилия и тому, прилагается ли усилие линейно. Используя эти условия, один капилляр генерирует две пригодные для использования иглы с тонкими отверстиями на конце.
SiR-тубулин	Cytosketon Inc	CY-SC014	производится из спирохрома; Cytoskeleton Inc. является дистрибьютором в Северной Америке. Окрашивает микротрубочки в дальний красный цвет
TransferMan	Eppendorf	5178 NK
ViaFluor 405	Biotium	#70064	Окрашивает микротрубочки в фиолетовый/синий цвет