Методическая статья

Высокоскоростной видеомикроскопический анализ для диагностики первой линии первичной цилиарной дискинезии

DOI:

10.3791/63292

⸱

19 января 2022 г.

 ,  ,  , 
1Allergy Centre, Tampere University Hospital, 2Department of Pediatrics, Turku University Hospital, 3Turku Bioscience Center, University of Turku and Åbo Akademi University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Высокоскоростной видеомикроскопический анализ является относительно простым в выполнении, быстрым, экономичным и, в опытных руках, достаточно надежным инструментом для первой линии диагностики первичной цилиарной дискинезии, который должен быть доступен в каждом центре, занимающемся диагностикой и лечением тяжелых заболеваний легких.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Первичная цилиарная дискинезия (ПХД) является врожденным расстройством, преимущественно наследуемым по аутосомно-рецессивному признаку. Расстройство вызывает нарушение движения ресничек, что приводит к серьезному нарушению мукоцилиарного клиренса (MCC). Если диагноз не диагностирован или поставлен слишком поздно, состояние приводит к развитию бронхоэктазов и серьезному повреждению легких в более позднем возрасте. Большинство методов диагностики ПХД отнимают много времени и требуют значительных экономических ресурсов для их установления. Высокоскоростной видеомикроскопический анализ (HSVMA) является единственным диагностическим инструментом для визуализации и анализа живых респираторных клеток с бьющимися ресничками in vitro. Он быстрый, экономичный и, в опытных руках, очень надежный в качестве диагностического инструмента для ПХД. Кроме того, классические диагностические меры, такие как просвечивающая электронная микроскопия (ТЭМ), не применимы к некоторым мутациям, поскольку морфологические изменения отсутствуют.

В данной работе описывается процесс сбора респираторных эпителиальных клеток, дальнейшая подготовка образца и процесс HSVMA. Мы также описываем, как очищенные клетки можно успешно удерживать невредимыми и бить, сохраняя их в питательной среде для хранения и транспортировки к месту исследования в тех случаях, когда клиника не обладает оборудованием для выполнения HSVMA. Также показаны видео с патологическими паттернами биения от пациентов с мутацией в гене тяжелой цепи 11 (DNAH11), которая не может быть диагностирована с помощью ТЭМ; результат неубедительной HSVMA из-за инфекции верхних дыхательных путей, а также неудачного расчесывания с наложением эритроцитов. В этой статье мы хотели бы призвать каждое подразделение, занимающееся пульмонологическими пациентами и редкими заболеваниями легких, выполнять HSVMA в рамках своей повседневной диагностики PCD или отправлять образцы в центр, специализирующийся на выполнении HSVMA.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Первичная цилиарная дискинезия (ПХД) является редким наследственным генетическим заболеванием, которое вызывает нарушения в движении бьющихся ресничек. Если его не диагностировать, это приводит к серьезному повреждению легких в более позднем возрасте из-за серьезного нарушения MCC. В прошлом его распространенность, по оценкам, находилась в диапазоне от 1:4000 до 50 000. Из-за неуклонного улучшения диагностики и растущей осведомленности о состоянии, обновления о распространенности ПХД предполагают, что он может быть гораздо более распространенным и, вероятно, в диапазоне от 1:4000 до 20000 вместо 1,2. Тем не менее, пациенты с ПХД все еще недодиагностированы или диагностированы слишком поздно 1,3. Таким образом, младенцы с врожденным situs inversus и / или гетеротаксией или перинатальной ринореей, респираторным дистрессом новорожденных, заложенным носом и трудностями кормления должны быть подозреваемыми для PCD. В более позднем возрасте хронический отит, рецидивирующая пневмония, риносинусит и хронический, типичный влажный кашель из-за нарушения MCC являются отличительными симптомами PCD, которые в сочетании с бронхоэктазами и нарушением функции легких продолжаются во взрослом возрасте2.

Пациенты с подозрением на наличие ПХД могут быть диагностированы с помощью различных диагностических инструментов. В прошлом TEM считалась золотым стандартом для диагностики первой линии. Однако до 30% случаев ПХД не показывают аномальной ультраструктуры 1,3,4,5,6, требующей иного диагностического подхода. Поэтому все большее число центров и руководящих принципов Европейского респираторного общества (ERS) предлагают комбинацию назального оксида азота (nNO) и HSVMA в качестве диагностики первой линии 1,7,9,10. HSVMA и nNO также являются наиболее экономически эффективными вариантами идентификации пациента с PCD11. Однако, даже если генетическое тестирование было включено в диагностику, следует иметь в виду, что в настоящее время не существует отдельного теста или комбинации тестов, которые могут исключить ПХД со 100% уверенностью 8,9,10.

Из доступных диагностических вариантов HSVMA является единственным тестом, который фокусируется на живых, покрытых ресничками респираторных клетках и оценивает цилиарный паттерн биения (CBP) и частоту цилиарного биения (CBF). В отличие от ТЕА, результаты HSVMA доступны быстро, обычно в день тестирования, тогда как результаты TEM могут поступать через несколько месяцев после взятия образца. HSVMA может применяться для всех возрастных групп, тогда как nNO требует высокой степени соответствия; попытки использовать его в возрасте до 5 лет обычно оказываются безуспешными10. В опытных руках HSVMA обладает отличной чувствительностью и специфичностью для диагностики PCD на 100% и 96% соответственно12.

В этой статье описывается пошаговая процедура выполнения HSVMA, включая сбор дыхательных клеток, покрытых ресничками, из нижней носовой раковины, сохранение собранных клеток в питающей клетки среде для транспортировки к месту исследования и процесс микроскопического видеоанализа для определения CBF и CBP. Кроме того, показаны некоторые видеоклипы от пациентов, сравнивающие нормальные CBP и CBF с аномальной функцией ресничек (Video 3, Video 4, Video 5, Video 6, Video 7 и Video 8).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Заявление об этике:

Это исследование было одобрено местным комитетом по этике (69/2017) и было проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией.

1. Сбор и транспортировка респираторных эпителиальных клеток

  1. Чистки
    1. Перед чисткой зубов введите пациенту двухнедельный курс пероральной амоксициллин-клавулановой кислоты для уничтожения биопленок, мешающих функции ресничек. Убедитесь, что антибиотик прекращен за 2 дня до процедуры.
    2. Чтобы уменьшить наложение слизистого материала на полоски эпителиальных клеток, попросите пациента тщательно выморкаться. Попросите родителей помочь своим маленьким детям сморкаться.
    3. Для чистки щеткой используйте межзубную щетку размером 0,6 мм (см. Таблицу материалов). Держите голову пациента неподвижной одной рукой, а другой рукой расчесывайте нижнюю носовую раковину обеих ноздрей, чтобы собрать достаточное количество полосок эпителиальных клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшое сопротивление обычно наблюдается при вставке межзубной щетки глубоко под нижнюю носовую раковину. Чистка носа осуществляется быстрым поворотом и отбором в течение примерно 2 с. Более длительное и интенсивное расчесывание может в противном случае привести к серьезному повреждению эпителия и последовательному эпистаксису.
    4. Если бронхоскопия планируется по причинам, отличным от подозрения на ПХД, соберите образцы во время бронхоскопии путем чистки киля или эпителия бронхов или биопсии13.
    5. Поместите собранные клеточные полоски в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл, содержащую питающую клетки модифицированную орлиную среду Dulbecco (DMEM).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полоски эпителиальных клеток обычно легче опускаются с кисти, бросая и поворачивая щетку к стенке трубки.
    6. Закройте крышку трубки микроцентрифуги и прижмите трубку к источнику света. Встряхните трубку, чтобы обнаружить собранные клеточные полоски и конгломераты.
  2. Транспортировка образца
    1. Поместите микроцентрифужные трубки в плотно закрытую полистирольную коробку и убедитесь, что крышка трубок правильно закрыта, а трубки закреплены внутри коробки.
    2. Добавьте холодный компресс; однако избегайте замораживания образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная температура для сохранения образца перед исследованием составляет приблизительно 4-8 °C (39,2-46,4 °F).
    3. Убедитесь, что сохраненные образцы анализируются в течение следующих 24 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этих экспериментах среднее время между чисткой щеткой и HSVMA составляло 3 ч.

2. Высокоскоростной видеомикроскопический анализ (HSVMA)

  1. Видеомикроскопия образцов
    1. После получения микроцентрифужных трубок, содержащих образцы, нагревайте их до 37 °C (98,6 °F), чтобы имитировать оптимальную, in vivo-подобную среду.
    2. Если микроскоп оснащен нагревательным блоком, поместите трубки под капот и прогрейте их там. В качестве альтернативы, используйте инкубатор для разогрева образцов.
    3. Запустите камеру и программное обеспечение видеоблока на ПК.
    4. Используя пипетку, возьмите небольшое количество образца и поместите две капли в кювету или стеклянную посуду (см. Таблицу материалов). Накройте кювету или блюдо крышкой и поместите под микроскоп.
    5. Для оценки образцов используют дифференциально-интерференционный микроскоп, оснащенный источником холодного света и видеокамерой, способной вести запись на высокой скорости (не менее 200 кадров/с). Используйте масляную иммерсионную линзу с 100-кратным увеличением и нанесите каплю погружного масла на поверхность оптики.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуются микроскопы с линзой, приближающейся снизу.
    6. Подойдите к нижней части тарелки с помощью линзы микроскопа и найдите кластеры клеток без эритроцитов и с низким содержанием слизи. Найдя репрезентативную область интереса (ROI), сосредоточьтесь на одной конкретной группе биющихся ресничек с наибольшими движениями ресничек и запишите видеопоследовательность. Записывайте клетки с биением ресничек сбоку и сверху. После этого найдите другой репрезентативный кластер клеток и повторите запись.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки, покрытые ресничками, должны быть исследованы при увеличении 1000x, а избиение ресничек должно быть записано с помощью цифровой высокоскоростной видеокамеры (DHSV), установленной на частоте кадров 200 / с или более (256 / с в этом протоколе). Поскольку данные, полученные из записанных видеоклипов, требуют много места на жестком диске, рекомендуется использовать внешний жесткий диск SSD.
  2. Анализ видеопоследовательностей
    1. Чтобы определить CBF и CBP, воспроизводите видеоклипы кадр за кадром.
    2. Чтобы определить CBF, установите частоту кадров в замедленное движение с 15 кадрами / с и подсчитайте 10 последовательных ударов.
    3. Запишите количество кадров, проходящих мимо в течение одного цикла из 10 ударов, и вставьте результат в Eq (1). Определить частоту путем расчета среднего значения всех зарегистрированных циклов биения ресничек и сравнить результат с эталонными значениями по возрасту (см. Таблицу 1)14.
      figure-protocol-1 (1)
      Где X — количество кадров, проходящих мимо в течение цикла из 10 ударов.
    4. Для оценки CBP следите за тем, находится ли движение бьющихся ресничек в полном диапазоне (см. Рисунок 1) и синхронизировано ли оно. Попросите двух независимых операторов оценить CBP, чтобы предотвратить смещение выбора.
    5. Сообщите, что результаты анализа HSVMA совместимы, маловероятны или неубедительны с PCD.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Видео 1 и Видео 2 показывают нормальный контроль, где CBF и CBP находятся в нормальном диапазоне (см. Рисунок 1). Видео 3, Видео 4, Видео 5 и Видео 6 представляют два случая пациентов с ПХД с гомозиготной мутацией в гене DNAH11 (c.2341G > A; p. Glu781Lys)3. Эти репрезентативные видео были выбраны потому, что фенотипы мутаций в гене DNA...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь описан и обсужден процесс диагностики ПХД с использованием HSVMA в свете диагностики первой линии. Несмотря на то, что HSVMA относительно проста в установлении, экономически эффективна11 и является надежным методом в опытных руках12, HSVMA не является диагностической мерой без подводных камней. Аномальные CBF и CBP могут быть вызваны вторичной инфекцией, приводящей к воспалению бронхо-респираторного эпителия15, и по той же причине курящие люди ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотим выразить особую благодарность детской медсестре г-же Йоханне Юванкоски за ее отличную помощь с чистками зубов. Мы также хотели бы выразить особую благодарность профессору Хеймуту Омрану (Университетская клиника Мюнстера, Великобритания) за предоставление разрешения на использование схематической фигуры нормального цилиарного движения с их веб-сайта. Наконец, мы хотели бы поблагодарить г-на Алана Брауна БА (с отличием), PGCE, за корректуру рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Амоксицилин-клавулановая кислотаOrion Oyj40 мг/кг разделить на 2 приема/день, для взрослых 875/125 мг 1 таблетка x2/день
Программное обеспечение камерыHamamatsuHCI
Image Cold packanyдля сохранения и транспортировки
Дифференциальный интерференционный микроскопCarl ZeissInverted, микроскоп с клеточным наблюдением
Digitial High Скоростная видеокамераHamamatsuOrca Flash 4.0, цифровая камера типа C11440
Dulbecco´ s Модифицированная среда дляMedium Thermo Fisher10565018среде для базальных клеточных культур
ПробиркаEppendorf301200861,5 мл
Чашка для микролунок со стеклянным дном MatTekP35G-1.5-14-CКювета для микроскопии
Нагревательный блокCarl Zeiss/PeCon810-450001Инкубационные элементы Carl Zeiss с контролем
температуры PeCon TempModule S1Межзубная ершика 0,6 ммDoft872267Межзубная ершика на длинной проволоке с многоразовой ручкой и колпачком в застежке-молнии
ObjectiveCarl Zeiss100x/1.46, α Plan-Apochromat DIC objective
Маленькая полистирольная коробка с крышкойлюбаядля транспортировки
базальных клеточных культур Eagle

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H. Diagnosis and management of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 4 (1), 2(2015).
  2. Mirra, V., Werner, C., Santamaria, F. Primary ciliary dyskinesia: An update on clinical aspects, genetics, diagnosis and future treatment strategies. Frontiers in Pediatrics. 5, 135(2017).
  3. Schultz, R., Elenius, V., Lukkarinen, H., Saarela, T. Two novel mutations in the DNAH11 gene in primary ciliary dyskinesia (CILD7) with considerable variety in the clinical and beating cilia phenotype. BMC Medical Genetics. 21 (1), 237(2020).
  4. Knowles, M. R., et al. Mutations of DNAH11 in patients with primary ciliary dyskinesia with normal ciliary ultrastructure. Thorax. 67 (5), 433-441 (2012).
  5. Boon, M., et al. Primary ciliary dyskinesia: critical evaluation of clinical symptoms and diagnosis in patients with normal and abnormal ultrastructure. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9, 11(2014).
  6. Kouis, P., et al. Prevalence of primary ciliary dyskinesia in consecutive referrals of suspected cases and the transmission electron microscopy detection rate: a systematic review and meta-analysis. Pediatric Research. 81 (3), 398-405 (2017).
  7. Marthin, J. K., Nielsen, K. G. Choice of nasal nitric oxide technique as first-line test for primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 37 (3), 559-565 (2011).
  8. Jackson, C. L., Behan, L., Collins, S. A. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
  9. Lucas, J. S., et al. European Respiratory Society guidelines for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 49 (1), 1601090(2017).
  10. Shoemark, A., Dell, S., Shapiro, A., Lucas, J. S. ERS and ATS diagnostic guidelines for primary ciliary dyskinesia: similarities and differences in approach to diagnosis. European Respiratory Journal. 54 (3), 1901066(2019).
  11. Kouis, P. Cost-effectiveness analysis of three algorithms for diagnosing primary ciliary dyskinesia: a simulation study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 14 (1), 142(2019).
  12. Rubbo, B., et al. Accuracy of high-speed video analysis to diagnose primary ciliary dyskinesia. Chest. 155 (5), 1008-1017 (2019).
  13. Friedman, N. R., Pachigolla, R., Deskin, R. W., Hawkins, H. K. Optimal technique to diagnose primary ciliary dyskinesia. The Laryngoscope. 110 (9), 1548-1551 (2000).
  14. Chilvers, M. A., Rutman, A., O´Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
  15. Lucas, J. S., Paff, T., Goggin, P., Haarman, E. Diagnostic methods in primary ciliary dyskinesia. Paediatric Respiratory Reviews. 18, 8-17 (2016).
  16. Ballenger, J. J. Experimental effect of cigarette smoke on human respiratory cilia. New England Journal of Medicine. 263, 832-835 (1960).
  17. Stanley, P. J., Wilson, R., Greenstone, M. A., Mac William, L., Cole, P. J. Effect of cigarette smoking on nasal mucociliary clearance and ciliary beat frequency. Thorax. 41 (7), 519-523 (1986).
  18. Kobbernagel, H. E., et al. Efficacy and safety of azithromycin maintenance therapy in primary cilia dyskinesia (BESTCILIA): a multicentre, double-blind, randomised, placebo-controlled phase 3 trial. Lancet Respiratory Medicine. 8 (5), 493-505 (2020).
  19. Takeyama, K., Tamaoki, J., Chiyotani, A., Tagaya, E., Konno, K. Effect of macrolide antibiotics on ciliary motility in rabbit airway epithelium in-vitro. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 45 (8), 756-758 (1993).
  20. Toskala, E., Haataja, J., Shirasaki, H., Rautliainen, M. Culture of cells harvested with nasal brushing: a method for evaluating ciliary function. Rhinology. 43 (2), 121-124 (2005).
  21. Pifferi, M., et al. Simplified cell culture method for the diagnosis of atypical primary ciliary dyskinesia. Thorax. 64 (12), 1077-1081 (2009).
  22. Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative, diagnostic aid. PLoS One. 9 (2), 89675(2014).
  23. Papon, J. F., et al. Quantitative analysis of ciliary beating in primary ciliary dyskinesia: a pilot study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 7 (10), 78(2012).
  24. Smith, C. M., et al. Cilia FA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1 (8), 14(2012).
  25. Sampaio, P., et al. Ciliar Move: new software for evaluating ciliary beat frequency helps find novel mutations by a Portuguese multidisciplinary team on primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal Open Research. 7 (1), 00792(2021).
  26. Mullowney, T., et al. Primary ciliary dyskinesia and neonatal respiratory distress. Pediatrics. 134 (6), 1160-1166 (2014).
  27. Leigh, M. W., et al. Standardizing nasal nitric oxide measurement as a test for primary ciliary dyskinesia. Annals of the American Thoracic Society. 10 (6), 574-581 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

DNAH11

Похожие статьи