Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Готовая к использованию qPCR для обнаружения ДНК из Trypanosoma cruzi или других патогенных организмов

1.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63316

⸱

20 января 2022 г.

 ,  ,  , 
1Laboratório de Ciências e Tecnologias Aplicadas em Saúde (LaCTAS), Instituto Carlos Chagas (ICC), Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz), 2Pós-graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia, Universidade Federal do Paraná (UFPR), 3Pós-graduação em Biociências e Biotecnologia, Instituto Carlos Chagas (ICC), Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz)

В этой статье

Краткое содержание

В настоящей работе описываются этапы получения готовой к использованию qPCR для обнаружения ДНК T. cruzi , которая может быть предварительно загружена в реакционный сосуд и храниться в холодильнике в течение нескольких месяцев.

Аннотация

ПЦР в реальном времени (qPCR) является удивительно чувствительным и точным методом, который позволяет амплифицировать мельчайшие количества мишеней нуклеиновых кислот из множества образцов. Он широко используется во многих областях исследований и достиг промышленного применения в таких областях, как диагностика человека и выбор признаков в культурах генетически модифицированных организмов (ГМО). Однако qPCR не является методом защиты от ошибок. Смешивание всех реагентов в одну мастер-смесь, впоследствии распределенную по 96 скважинам обычной пластины qPCR, может привести к ошибкам оператора, таким как неправильное смешивание реагентов или неточное дозирование в скважины. Здесь представлен метод, называемый гелеобразованием, при котором большая часть воды, присутствующей в основной смеси, замещается реагентами, которые образуют золь-гелевую смесь при подаче в вакуум. В результате реагенты qPCR эффективно сохраняются в течение нескольких недель при комнатной температуре или нескольких месяцев при 2-8oC. Детали приготовления каждого растворапоказаны здесь вместе с ожидаемым аспектом гелеобразной реакции, предназначенной для обнаружения спутниковой ДНК T. cruzi (сатДНК). Аналогичная процедура может быть применена для обнаружения других организмов. Запуск гелеобразного запуска qPCR так же прост, как извлечение пластины из холодильника, добавление образцов в соответствующие колодцы и начало запуска, тем самым уменьшая время настройки реакции с полной пластиной до времени, необходимого для загрузки образцов. Кроме того, гелеобразные реакции ПЦР могут производиться и контролироваться на качество партиями, экономя время и избегая распространенных ошибок оператора при выполнении рутинных реакций ПЦР.

Введение

Болезнь Шагаса была обнаружена в начале 20века в сельских районах Бразилии, где бедность была широко распространена 1,2. Даже сегодня болезнь по-прежнему связана с социальными и экономическими детерминантами здоровья в Северной и Южной Америке. Болезнь Шагаса двухфазна, включает в себя острую и хроническую фазы. Он вызван инфекцией паразитом Trypanosoma cruzi, передаваемой насекомыми-переносчиками, переливанием крови врожденным путем или пероральным приемом зараженной пищи 3,4.

Диагностика болезни Шагаса может быть проведена путем наблюдения клинических симптомов (особенно знака Романьи), микроскопии мазка крови, серологии и молекулярных тестов, таких как ПЦР в реальном времени (qPCR) или изотермическая амплификация 4,5,6,7,8,9. Клинические симптомы и микроскопия мазка крови используются при подозрении на острые инфекции, в то время как поиск антител используется в качестве инструмента скрининга у бессимптомных пациентов. Из-за своей чувствительности и специфичности qPCR было предложено использовать в качестве инструмента мониторинга для хронических пациентов, для острых пациентов, проходящих лечение, измеряя паразитарную нагрузку в крови, и в качестве суррогатного маркера терапевтической недостаточности 6,8,10,11,12 . Несмотря на то, что qPCR является более чувствительным и специфическим, чем имеющиеся в настоящее время тесты, он фактически не может быть известен как диагностические инструменты в неблагополучных регионах по всему миру из-за требования низких температур для транспортировки и хранения 13,14,15.

Чтобы обойти это препятствие, методы сохранения, такие как лиофилизация и гелеобразование, были изучены16,17. В то время как лиофилизация обеспечивает сохранение в течение многих лет, она требует специально изготовленных реагентов без присутствия глицерина, который обычно используется для стабилизации / сохранения ферментов18. Хотя было показано, что гелеобразование обеспечивает сохранение в течение нескольких месяцев, оно позволяет использовать обычные реагенты19. Раствор для гелеобразования содержит четыре компонента, каждый из которых играет определенную роль в процессе: сахара трегалоза и мелезитоза защищают биомолекулы в процессе высыхания, уменьшая молекулы свободной воды в растворе, гликоген производит более широкую защитную матрицу, а аминокислота лизин используется в качестве поглотителя свободных радикалов для ингибирования реакций окисления между карбоксилом биомолекулы, амино- и фосфатные группы. Эти компоненты определяют золь-гелевую смесь, которая предотвращает потерю третичной или четвертичной структуры в процессе высыхания, тем самым помогая поддерживать активность биомолекул при регидратации19. После стабилизации внутри реакционных трубок реакции могут храниться в течение нескольких месяцев при 2-8 °C или нескольких недель при 21-23 °C вместо обычных -20 °C. Этот подход уже был включен в тесты, предназначенные для диагностики таких заболеваний, как болезнь Шагаса, малярия, лейшманиоз, туберкулез и циклоспориаз 13,14,15,20.

Настоящая работа описывает все этапы подготовки необходимых растворов для процедуры гелеобразования, подводные камни в процессе и ожидаемый конечный аспект готовой к использованию гелеобразной qPCR внутри восьмитрубных полосок. Тот же протокол может быть адаптирован для одиночных труб или плит с 96 скважинами. Наконец, обнаружение ДНК T. cruzi будет показано как контрольный запуск.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Приготовление стоковых растворов и гелеобразующих смесей

ПРИМЕЧАНИЕ: Четыре исходных раствора будут приготовлены (400 мг/мл мелезитозы, 400 мг/мл трегалозы, 0,75 мг/мл лизина и 200 мг/мл гликогена) и смешаны в соответствии с пропорцией, указанной в таблице 1 , для получения гелеобразной смеси. Хотя протокол описывает производство 10 мл стоковых растворов, он может быть адаптирован для более низких или больших объемов.

  1. Мелезитоза раствор
    1. Взвесьте 4 г мелезитозы в пластиковой пробирке объемом 15 мл, добавьте 6 мл воды без нуклеазы и вихрь на максимальной скорости инструмента до тех пор, пока порошок не будет солюбилизирован.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно добавить больше воды для облегчения солюбилизации, заботясь о том, чтобы не превысить конечный объем (см. Ниже).
    2. Восполнить конечный объем до 10 мл водой без нуклеаз. Этикетка и хранение при температуре 2-8 °C в течение 6 месяцев.
  2. Трегалозный раствор
    1. Взвесьте 4 г трегалозы в пластиковой трубке объемом 15 мл, добавьте 6 мл воды без нуклеазы и вихрь на максимальной скорости инструмента до тех пор, пока порошок не будет солюбилизирован.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно добавить больше воды для облегчения солюбилизации, заботясь о том, чтобы не превысить конечный объем (см. Ниже).
    2. Заполните объем до 10 мл водой без нуклеазы и процедите раствор через фильтр 0,2 мкм. Этикетка и хранение при температуре 2-8 °C в течение 6 месяцев.
  3. Раствор гликогена
    1. Взвесьте 2 г гликогена в пластиковой трубке объемом 15 мл, добавьте 6 мл воды без нуклеазы и вихрь на максимальной скорости инструмента до тех пор, пока порошок не будет солюбилизирован.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно добавить больше воды для облегчения солюбилизации, заботясь о том, чтобы не превысить конечный объем (см. Ниже).
    2. Держите раствор в состоянии покоя при 2-8 °C в течение 8-12 ч, потому что при солюбилизации гликогена образуется много пузырьков (рисунок 1). Восполнить объем до 10 мл водой без нуклеаз. Этикетка и хранение при температуре 2-8 °C в течение 6 месяцев.
  4. Раствор лизина
    1. Взвесьте 7,5 мг лизина в пластиковой трубке объемом 15 мл, добавьте 6 мл воды без нуклеазы. Вихрь на максимальной скорости инструмента до тех пор, пока порошок не будет солюбилизирован.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно добавить больше воды для облегчения солюбилизации, заботясь о том, чтобы не превысить конечный объем (см. Ниже).
    2. Заполните объем до 10 мл водой без нуклеазы и процедите раствор через фильтр 0,2 мкм. Переложите раствор в янтарную колбу или защитите ее от света. Этикетка и хранение при температуре 2-8 °C в течение 6 месяцев.
  5. Гелеобразующая смесь (ГМ)
    1. В пластиковой тубе объемом 50 мл смешайте объемы стоковых растворов согласно таблице 1.
    2. Смешайте реагенты десятью сквозными инверсиями трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости в этапе фильтрации, если этот этап выполняется в ламинарной защитной вытяжке. Если этот этап не выполняется в чистой среде, отфильтруйте раствор через фильтр 0,2 мкм перед переноской его в колбу янтаря.
    3. Переложите раствор в янтарную колбу или защитите ее от света. Этикетка и хранение при температуре 2-8 °C в течение 3 месяцев.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве этапа контроля качества для приготовления гелеобразующей смеси убедитесь, что измеренные значения рН, проводимости и плотности находятся в следующих диапазонах: рН 5,55-6,66; проводимость 0,630-0,757 мСм/см; и плотность 1,08-1,11 г/см3. Все измерения должны проводиться при температуре 25 °C.

2. Приготовление мастер-микса qPCR для гелеобразования

ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе готовится мастер-микс qPCR для гелеобразования. Следовательно, воду не добавляют в смесь, а вместо этого добавляют гелеобразующую смесь (таблица 2).

  1. Разморозьте реагенты в рефрижераторном контейнере. Смешайте реагенты в пробирке объемом 1,5 мл согласно таблице 2. Здесь показан пример реакции с конечным объемом 25 мкл, содержащей 5 мкл образца ДНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образец ДНК не добавляется к смеси на этом этапе; он используется здесь исключительно для расчета конечных объемов каждого реагента мастер-смеси qPCR. Образцы ДНК должны быть добавлены непосредственно перед началом запуска (см. шаг 4 ниже).

3. Гелеобразование реагентов на реакционных сосудах

  1. Соответствующим образом умножьте объемы, указанные в таблице 2 , для приготовления восьмитрубной полосы или 96-луночной пластины.
  2. Пипетировать 18,5 мкл мастер-смеси гелеобразования, показанной в таблице 2 , на каждую реакционную лунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот объем представляет собой объемы олигонуклеотидной смеси, буфера ПЦР и гелеобразующей смеси, используемой для одной реакции (согласно таблице 2), и будет варьироваться в зависимости от концентрации реагентов и объема, необходимого для одной реакции. Конечный объем в мастер-смеси для гелеобразования отличается от объема в обычной мастер-смеси, потому что вода не добавляется.
  3. Поместите трубки/пластины в теплопроводящую опору (например, алюминиевую) внутри вакуумной печи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Теплопроводящая опора является опциональной. Оператор должен убедиться, что нижняя часть трубок находится в контакте с полкой вакуумной печи, чтобы обеспечить быстрое тепловое равновесие.
  4. Поместите один мешок бентонитовой глины на каждые две плиты из 96 скважин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Бентонитовые глиняные мешки используются для поглощения удаленной воды из мастер-смеси гелеобразования под влиянием перепада давления, оказываемого вакуумом. Бентонитовые глиняные мешки оказались ненужными для менее чем двух плит из 96 скважин.
  5. Подвергайте трубки/пластины, содержащие мастер-смесь гелеобразования, трем вакуумным циклам (30 ± 5 мБар) по 30 мин каждый, чередуясь с вакуумным высвобождением до достижения атмосферного давления (900-930 мБар), при контролируемой температуре (30 °C ± 1 °C) (рисунок 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прибор использует программное обеспечение для управления параметрами, и пример цикла показан на рисунке 2. Пользователь должен создать профиль для запуска, указав выбранные параметры.
  6. Когда цикл будет завершен, проверьте трубки / пластины на правильное гелеобразование реагентов, убедившись, что объем заметно уменьшен (рисунок 3) и что жидкости не перемещаются при постукивании по трубкам / пластинам пальцами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если гелеобразование не происходило, раствор разбрызгивался на стенки трубок при постукивании трубок (рисунок 3).
  7. Запечатайте и храните трубки/пластины при температуре 2-8 °C в течение 8-12 ч перед использованием.

4. Использование гелеобразной qPCR

  1. Извлеките ленту или пластину из холодильника и откройте ее на рабочем месте для обработки образцов. Добавьте 15 мкл воды без нуклеазы в каждый реакционный сосуд.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем гелефикованных реагентов считается около 5 мкл. Таким образом, вместе с объемом образца ДНК (см. ниже) конечный объем реакции составляет 25 мкл.
  2. Добавьте 5 мкл образца ДНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Может быть использован любой шаблон ДНК качества qPCR. В настоящей работе ДНК экстрагировали из 108T. cruzi epimastigotes (штамм Dm28c) и последовательно разбавляли в соотношении 1:10 с использованием буфера TE.
  3. Запечатайте трубки/пластины и приступайте к выбранному оборудованию. Запустите эксперимент и приступайте к регулярному анализу данных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Три реагента, образующих гелеобразную смесь, легко солюбилизируются при сильном вихре. Тем не менее, гликоген требует тщательного вихря, чтобы гарантировать, что порошок был полностью солюбилизирован. К сожалению, сильное вихрь производит много пузырьков, что затрудняет определение фактического объема раствора (рисунок 1А-В). Поэтому важно оставить раствор гликогена в холодильнике до тех пор, пока большая часть раствора, захваченного внутри пузырьков, не пер...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Последние годы подчеркнули необходимость поиска более чувствительных и специфических технологий, помогающих диагностировать тропические и забытые болезни. Несмотря на важность эпидемиологического контроля, паразитологические (оптическая микроскопия) и серологические тесты имеют ограничения, особенно в отношении чувствительности и применимости в месте оказания медицинской помощи. Методы амплификации ДНК, такие как ПЦР, изотермическая амплификация и соответствующие вариации, уже давно используются в лабораторных условиях, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы выразить благодарность Алин Бурда Фариас за техническую помощь с вакуумной печью, а также администрации Института молекулярной биологии Параны (IBMP, Куритиба, Бразилия) за предоставление доступа к указанному оборудованию. Эта работа была частично профинансирована грантом CNPq 445954/2020-5.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Пакеты из бентонитовой глины (активированные)Embamat Global Packaging Solutions (Барселона, Испания)026157/STDНе путать с пакетами с силикагелем
GlycogenAmersham BioscienceCat# US16445
LysineAcros OrganicCat# 365650250
MelezitozeSigma-AldrichCat# 63620
Водабез нуклеазыпредпочтительный поставщик
олигонуклеотидовпредпочтительный поставщик
ПЦР мастермикспредпочтительный поставщик или Институт молекулярной биологии в области парана; (ИМБП, Куритиба, Бразилия)Chagas NAT
PCR термоамплификаторпредпочтительный поставщик
программного обеспечения для вакуумной печиMemmert GmbhCelsius v10.0
TrehaloseSigma-AldrichCat# T9531
Trypanosoma cruzi ДНКиз собственных культивируемых паразитов или приобретенный у аккредитованных поставщиков, таких как ATCC
Vacuum ovenMemmert ГмбхVO-400
Набор

Ссылки

  1. Lewinsohn, R. Carlos Chagas (1879-1934): the discovery of Trypanosoma cruzi and of American trypanosomiasis (foot-notes to the history of Chagas's disease). Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (5), 513-523 (1979).
  2. Bern, C., et al. Evaluation and treatment of Chagas disease in the United States: A systematic review. The Journal of American Medical Association. 298 (18), 2171-2181 (2007).
  3. Pereira, K. S., et al. Chagas' disease as a foodborne illness. Journal of Food Protection. 72 (2), 441-446 (2009).
  4. Tanowitz, H. B., et al. Chagas' disease. Clinical Microbiology Reviews. 5 (4), 400-419 (1992).
  5. Rassi, A., Marin-Neto, J. A. Chagas disease. Lancet. 375 (9723), 1388-1402 (2010).
  6. Ramírez, J. C., et al. Analytical validation of quantitative real-time PCR methods for quantification of trypanosoma cruzi DNA in blood samples from chagas disease patients. The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (5), 605-615 (2015).
  7. Rivero, R., et al. Rapid detection of Trypanosoma cruzi by colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A potential novel tool for the detection of congenital Chagas infection. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 89 (1), 26-28 (2017).
  8. Schijman, A. G. Molecular diagnosis of Trypanosoma cruzi. Acta Tropica. 184, 59-66 (2018).
  9. Besuschio, S. A., et al. Trypanosoma cruzi loop-mediated isothermal amplification (Trypanosoma cruzi Loopamp) kit for detection of congenital, acute and Chagas disease reactivation. Plos Neglected Tropical Diseases. 14 (8), 0008402(2020).
  10. Duffy, T., et al. Accurate real-time PCR strategy for monitoring bloodstream parasitic loads in chagas disease patients. Plos Neglected Tropical Diseases. 3 (4), (2009).
  11. Melo, M. F., et al. Usefulness of real time PCR to quantify parasite load in serum samples from chronic Chagas disease patients. Parasites & Vectors. 8 (1), 154(2015).
  12. Parrado, R., et al. Usefulness of serial blood sampling and PCR replicates for treatment monitoring of patients with chronic Chagas disease. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (2), 01191(2019).
  13. de Rampazzo, R. C. P., et al. A ready-to-use duplex qPCR to detect Leishmania infantum DNA in naturally infected dogs. Veterinary Parasitology. 246, 100-107 (2017).
  14. Rampazzo, R. C. P., et al. Proof of concept for a portable platform for molecular diagnosis of tropical diseases. The Journal of Molecular Diagnostics. 21 (5), 839-851 (2019).
  15. Costa, A. D. T., et al. Ready-to-use qPCR for detection of Cyclospora cayetanensis or Trypanosoma cruzi in food matrices. Food and Waterborne Parasitology. 22, 00111(2021).
  16. Sun, Y., et al. Pre-storage of gelified reagents in a lab-on-a-foil system for rapid nucleic acid analysis. Lab on a Chip. 13, 1509-1514 (2013).
  17. Kamau, E., et al. Sample-ready multiplex qPCR assay for detection of malaria. Malaria Journal. 13, 158(2014).
  18. Kasper, J. C., Winter, G., Friess, W. Recent advances and further challenges in lyophilization. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85 (2), 162-169 (2013).
  19. Rosado, P. M. F. S., López, G. L., Seiz, A. M., Alberdi, M. M. Method for preparing stabilised reaction mixtures, which are totally or partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures. PubChem. , (2002).
  20. Ali, N., Bello, G. L., Rossetti, M. L. R., Krieger, M. A., Costa, A. D. T. Demonstration of a fast and easy sample-to-answer protocol for tuberculosis screening in point-of-care settings: A proof of concept study. PLoS One. 15 (12), 0242408(2020).
  21. Murphy, H. R., Lee, S., da Silva, A. J. Evaluation of an improved U.S. food and drug administration method for the detection of Cyclospora cayetanensis in produce using real-time PCR. Journal of Food Protection. 80 (7), 1133-1144 (2017).
  22. Iglesias, N., et al. Performance of a new gelled nested PCR test for the diagnosis of imported malaria: comparison with microscopy, rapid diagnostic test, and real-time PCR. Parasitology Research. 113 (7), 2587-2591 (2014).
  23. Alonso-Padilla, J., Gallego, M., Schijman, A. G., Gascon, J. Molecular diagnostics for Chagas disease: up to date and novel methodologies. Expert Review of Molecular Diagnostics. 17 (7), 699-710 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Гелефицированная кПЦРобнаружение Trypanosoma CruziПЦР в реальном времениамплификация ДНКобнаружение патогеновмастер-микс для кПЦРпротокол гелефикацииобнаружение нуклеиновых кислотмолекулярная диагностика
Готовая к использованию qPCR для обнаружения ДНК из Trypanosoma cruzi или других патогенных организмов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.