Масс-спектрометрическая характеристика нейропептидов обеспечивает информацию о последовательности, количестве и локализации. Этот оптимизированный рабочий процесс полезен не только для исследований нейропептидов, но и других эндогенных пептидов. Представленные здесь протоколы описывают подготовку образцов, сбор РС, анализ РС и генерацию базы данных нейропептидов с использованием LC-ESI-MS, MALDI-MS и визуализации MALDI-MS.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Многогранное масс-спектрометрическое исследование нейропептидов в Callinectes sapidus
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Нейропептиды являются сигнальными молекулами, которые регулируют почти все физиологические и поведенческие процессы, такие как развитие, размножение, потребление пищи и реакция на внешние стрессоры. Тем не менее, биохимические механизмы и полный набор нейропептидов и их функциональные роли остаются плохо изученными. Характеристика этих эндогенных пептидов затруднена огромным разнообразием в этом классе сигнальных молекул. Кроме того, нейропептиды биологически активны в концентрациях 100x - 1000x ниже, чем у нейротрансмиттеров, и склонны к ферментативной деградации после синаптического высвобождения. Масс-спектрометрия (MS) является высокочувствительным аналитическим инструментом, который может идентифицировать, количественно оценивать и локализовать аналиты без всесторонних априорных знаний . Он хорошо подходит для глобального профилирования нейропептидов и помогает в открытии новых пептидов. Из-за низкой численности и высокого химического разнообразия этого класса пептидов несколько методов пробоподготовки, параметров получения РС и стратегий анализа данных были адаптированы из методов протеомики, чтобы обеспечить оптимальную характеристику нейропептидов. Здесь описаны способы выделения нейропептидов из сложных биологических тканей для характеризации последовательностей, квантования и локализации с использованием жидкостной хроматографии (LC)-MS и матричной лазерной десорбции/ионизации (MALDI)-MS. Включен протокол подготовки базы данных нейропептидов синего краба Callinectes sapidus, организма без исчерпывающей геномной информации. Эти рабочие процессы могут быть адаптированы для изучения других классов эндогенных пептидов у разных видов с использованием различных инструментов.
Введение
Нервная система сложна и требует сети нейронов для передачи сигналов по всему организму. Нервная система координирует сенсорную информацию и биологическую реакцию. Сложные и запутанные взаимодействия, участвующие в передаче сигнала, требуют множества различных сигнальных молекул, таких как нейротрансмиттеры, стероиды и нейропептиды. Поскольку нейропептиды являются наиболее разнообразными и мощными сигнальными молекулами, которые играют ключевую роль в активации физиологических реакций на стресс и другие раздражители, интересно определить их конкретную роль в этих физиологических процессах. Нейропептидная функция связана с их аминокислотной структурой, которая определя....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Весь описанный забор тканей был выполнен в соответствии с руководящими принципами Университета Висконсин-Мэдисон.
1. LC-ESI-MS анализ нейропептидов
- Экстракция и обессоливание нейропептидов
- Перед приобретением ткани приготовьте подкисленный метанол (acMeOH) (90:9:1 MeOH:вода:уксусная кислота), как описано в16.
- Соберите мозговую ткань у ракообразного17 и используйте щипцы, чтобы немедленно поместить по одной ткани в пробирку объемом 0,6 мл, содержащую 20 мкл acMeOH.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протоколы рассечения тканей сильно различаются для разных животных и р....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Рабочий процесс подготовки образцов и анализа MS показан на рисунке 1. После рассечения нейрональной ткани проводят гомогенизацию, экстракцию и обессоливание для очистки нейропептидных образцов. Если требуется количественная оценка на основе изотопных этикеток, образцы затем маркируются и обессоливаются еще раз. Полученный образец анализируется с помощью LC-MS/MS для идентификации и количественной оценки нейропептидов.
Нейропептиды, идентифицированные с помощью пр.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Точная идентификация, количественная оценка и локализация нейропептидов и эндогенных пептидов, обнаруженных в нервной системе, имеют решающее значение для понимания их функции23,24. Масс-спектрометрия является мощным методом, который может позволить достичь всего этого, даже в организмах без полностью секвенированного генома. Показана способность этого протокола обнаруживать, количественно оценивать и локализовать нейропептиды из ткани, собранной из C. sapidu.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Это исследование было поддержано Национальным научным фондом (CHE-1710140 и CHE-2108223) и Национальными институтами здравоохранения (NIH) через грант R01DK071801. A.P. был частично поддержан грантом NIH Chemistry-Biology Interface Training Grant (T32 GM008505). N.V.Q. был частично поддержан Национальными институтами здравоохранения в рамках Премии Рут Л. Киршштейн Национальной исследовательской службы от Национального института сердца легких и крови в Центр сердечно-сосудистых исследований Университета Висконсина-Мэдисона (T32 HL007936). L.L. хотел бы отметить гранты NIH R56 MH110215, S10RR029531 и S10OD025084, а также финансовую поддержку от профессора выдающихся до....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильно>химикаты, реагенты и расходные материалы | |||
| 2,5-дигидроксибензойная кислота (DHB) матрица | Supelco | 39319 | |
| Уксусная кислота | Fisher Chemical | A38S-500 | |
| Ацетонитрил Optima LC/MS марки | Fisher Chemical | A955-500 | |
| Бикарбонат аммония | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Боранский пиридин | Sigma-Aldrich | 179752 | |
| пептидная калибровочная смесь | Bruker Daltonics | NC9846988 | |
| Capillary | Polymicro | 1068150019 | для создания нанопроточной колонки (75 &; м внутренний диаметр х 360 и микро; м наружный диаметр) |
| Криостатная чашка | Sigma-Aldrich | E6032 | любая чашка или форма должна работать |
| Микроцентрифужные пробирки | Eppendorf | 30108434 | |
| Формальдегид | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Формальдегид - D2 | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Муравьиная кислота Optima LC/MS марка | Fisher Chemical | A117-50 | |
| Желатин | Difco | 214340 | место в 37° C водяная баня для плавления |
| Гидрофобная барьерная ручка | Vector Labs | 15553953 | |
| Стекло с покрытием из оксида индия и олова (ITO) | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25 мм x 75 мм x 0,8 мм (ширина х длина х толщина) |
| Флаконы LC-MS | Thermo | TFMSCERT5000-30LVW | |
| Метанол Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A456-500 | |
| Парапленка | Sigma-Aldrich | P7793 | Гидрофобная пленка |
| pH-индикаторные полоски | Supelco | 109450 | |
| Кластеры красного фосфора | Sigma-Aldrich | 343242 | |
| Обратная фаза C18 материал | Воды | 186002350 | вручную упакованы в нанопроточную колонку |
| Wite-out pen | BIC | 150810 | |
| ZipTip | Millipore | Z720070 | |
| Инструменты и инструменты | |||
| Автоматическая система матричного распыления- M5 | HTX Technologies, LLC | ||
| Центрифуга - 5424 R | Eppendorf | 05-401-205 | |
| Криостат- HM 550 | Thermo Fisher Scientific | 956564A | |
| Адсорбционная | дриерита | 2088701 | |
| Щипцы | WPI | 501764 | |
| мишень из нержавеющей стали MALDI | Bruker Daltonics | 8280781 | |
| Pipet-Lite XLS | Rainin | 17014391 | 200 &; L |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| RapifleX MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | ||
| SpeedVac - SVC100 | Savant | SVC-100D | |
| Ультразвуковой очиститель | Bransonic | 2510R-MTH | для ультразвукового |
| гомогенизатора | Fisher Scientific | FB120110 | FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | предельное предельное давление = 1 x 10-4 |
| Torr Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Водяная баня (37C) - Isotemp 110 | Fisher Scientific | 15-460-10 | |
| Программное обеспечение для анализа данных | |||
| Expasy | https://web.expasy.org/translate/ | ||
| FlexAnalysis | Bruker Daltonics | ||
| FlexControl | Bruker Daltonics | ||
| FlexImaging | Bruker Daltonics | ||
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions, Inc. | ||
| SCiLS Lab | https://scils.de/ | ||
| SignalP 5.0 | https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0 | ||
| tBLASTn | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_ ПРОГРАММЫ=tblastn& PAGE_ TYPE=BlastSearch& SHOW_ DEFAULTS=on& LINK_LOC =blasthome |
Ссылки
- Hökfelt, T., et al. Neuropeptides - an overview. Neuropharmacology. 39 (8), 1337-1356 (2000).
- Radhakrishnan, V., Henry, J. L. Electrophysiology of neuropeptides in the sensory spinal cord. Progress in Brain Research. 104, 175-195 (1995).
- Nässel, D. R., Ekström, ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
