Методическая статья

Моделирование внутрижелудочкового кровоизлияния новорожденных посредством внутрижелудочковой инъекции гемоглобина

DOI:

10.3791/63345

⸱

25 августа 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, University of Kentucky, 2Department of Pediatric Surgery, University of Texas, 3Department of Neurological Surgery, Washington University in St. Louis School of Medicine, 4Department of Orthopedic Surgery, Washington University in St. Louis School of Medicine, 5Department of Pediatrics, Washington University in St. Louis School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представлена модель внутрижелудочкового кровоизлияния новорожденных с использованием крысиных детенышей, имитирующая патологию, наблюдаемую у человека.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Неонатальное внутрижелудочковое кровоизлияние (IVH) является распространенным последствием преждевременных родов и приводит к черепно-мозговой травме, постгеморрагической гидроцефалии (PHH) и пожизненному неврологическому дефициту. В то время как PHH можно лечить с помощью временных и постоянных процедур отвода спинномозговой жидкости (CSF) (желудочковый резервуар и вентрикулоперитонеальный шунт, соответственно), нет фармакологических стратегий для профилактики или лечения IVH-индуцированной черепно-мозговой травмы и гидроцефалии. Животные модели необходимы для лучшего понимания патофизиологии IVH и тестирования фармакологических методов лечения. В то время как существуют модели неонатального IVH, те, которые надежно приводят к гидроцефалии, часто ограничены необходимостью инъекций большого объема, что может усложнить моделирование патологии или внести вариабельность в наблюдаемый клинический фенотип.

Недавние клинические исследования показали, что гемоглобин и ферритин вызывают увеличение желудочков после IVH. Здесь мы разрабатываем простую животную модель, которая имитирует клинический фенотип PHH, используя внутрижелудочковые инъекции продукта распада крови гемоглобина. В дополнение к надежному индуцированию увеличения желудочков и гидроцефалии, эта модель приводит к повреждению белого вещества, воспалению и инфильтрации иммунных клеток в перивентрикулярных и белых областях. В этой статье описывается этот клинически значимый, простой метод моделирования IVH-PHH у неонатальных крыс с использованием внутрижелудочковой инъекции и представлены методы количественной оценки размера желудочка после инъекции.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Неонатальный IVH происходит из зародышевого матрикса, места быстрого деления клеток, которое примыкает к боковым желудочкам развивающегося мозга. Эта высокососудистая структура уязвима к гемодинамической нестабильности, связанной с преждевременными родами. Кровь высвобождается в боковые желудочки при кровоизлиянии в зародышевый матрикс (GMH)-IVH при разрыве хрупких кровеносных сосудов внутри зародышевого матрикса. В случае IVH IV степени перивентрикулярный геморрагический инфаркт также может способствовать высвобождению продуктов крови в головном мозге. 1 Комбинация GMH-IVH может вызвать PHH, особенно после полноценного кровоизлияния (степени III и IV)1. PHH можно лечить с помощью размещения вентрикулоперитонеального шунта, но размещение шунта не обращает вспять черепно-мозговую травму, которая может возникнуть от IVH. Хотя современная неонатальная интенсивная терапия снизила показатели IVH2, 3, нет никаких конкретных методов лечения черепно-мозговой травмы или гидроцефалии, вызванной IVH после того, как это произошло. Существенным ограничением в разработке профилактических методов лечения травм головного мозга, вызванных IVH, и PHH является неполное понимание патофизиологии IVH.

Недавно было показано, что ранние уровни ликвора ключевого продукта распада крови гемоглобина связаны с более поздним развитием ПГ у новорожденных с высокосортным IVH4. Кроме того, уровни ликвора белков пути обработки железа — гемоглобина, ферритина и билирубина — связаны с размером желудочков в неонатальном IVH. Это также было показано в многоцентровой когорте младенцев с недоношенным PHH, где более высокие уровни ферритина в желудочковом ликворе были связаны с большим размером желудочка5.

В этом исследовании мы разработали клинически значимую модель ivH-индуцированной черепно-мозговой травмы и гидроцефалии с использованием инъекции гемоглобина в желудочки головного мозга, которая позволяет количественно оценить черепно-мозговую травму и PHH и протестировать новые терапевтические стратегии (рисунок 1)6, 7. Эта модель IVH использует детенышей неонатальных крыс, которые помещаются под общую анестезию на время процедуры. Разрез средней линии делается на коже головы, а координаты, полученные из ориентиров черепа — брегма или лямбда — используются для нацеливания на боковые желудочки для инъекции. Медленная инъекция с использованием инфузионного насоса доставляет гемоглобин в желудочек. Этот протокол прост в использовании, универсален и может моделировать различные компоненты IVH, которые приводят к PHH.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Все протоколы для животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию. Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех материалах, реагентах, оборудовании и программном обеспечении, используемых в этом протоколе.

1. Препарат растворов гемоглобина и ликвора

  1. Приготовьте стерильный раствор искусственного ликвора (aCSF), добавив 500 мкл раствора aCSF в микропробирку объемом 1,5 мл и храните на льду.
  2. Готовят стерильный раствор гемоглобина 150 мг/мл, добавляя 75 мг гемоглобина к 500 мкл КСФ в микропробирке объемом 1,5 мл и хранят на льду.

2. Подготовка животного к инъекции

  1. Поверните грелку в среду, чтобы поддерживать температуру тела крысы.
  2. Обезболивают крыс на 4-й день (Р4) в индукционной камере, заполненной 3% изофлураном.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подтверждайте достаточную анестезию, используя реакцию щипца пальца ноги /хвоста каждые 15 минут. Мониторинг анестезии с визуальным наблюдением за цветом тканей, температурой тела и частотой дыхания.
  3. Введите обезболивание с помощью подкожной инъекции карпрофена 5 мг/кг анестезированной крысе.
  4. Поместите обезболенную крысу, склонную к стереотаксическому аппарату, с носом, расположенным в адаптере анестезии с постоянным потоком 1,5% изофлурана.
  5. Затяните неразорвавшиеся ушные вкладыши на внешнем слуховом проходе, чтобы закрепить голову.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наносите ветеринарную мазь, чтобы держать глаза увлажненными, если глаза открыты в возрасте инъекции.
  6. Очистите головку, чередуя со стерильными аппликаторами с хлопковыми наконечниками, пропитанными бетадином и 70% этанолом.
    1. Прикоснитесь пропитанным бетадином аппликатором к центру кожи головы и распределите бетадин по кругу, двигаясь наружу.
    2. Повторите этап 2.6.1.1 с аппликатором, пропитанным этанолом.
    3. Повторите этап 2.6.1.1 и шаг 2.6.1.2 3x.
  7. Нанесите стерильную хирургическую драпировку для защиты хирургического поля.
  8. Используя стерильный скальпель, сделайте разрез 0,3 см вертикально вниз по центру головы, чтобы обнажить брегму черепа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При инъекции из лямбды обнажите лямбду черепа вместо брегмы.
  9. Используйте стерильный аппликатор с хлопковым наконечником, чтобы высушить область.

3. Настройка стереотаксического инжектора

  1. Нарисуйте раствор гемоглобина, приготовленный на этапе 1.2, в стерильный шприц объемом 0,3 мл с иглой 30G и поместите шприц в стереотаксическую инжекторную систему.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При создании контрольных условий втягивайте раствор aCSF, приготовленный на этапе 1.1, в стерильный шприц объемом 0,3 мл и приступайте к протоколу.
  2. Включите интерфейс стереотаксического инжектора и нажмите кнопку «Конфигурация », чтобы ввести настройки громкости и скорости впрыска.
    1. Нажмите на Громкость и установите громкость на 20 000 нЛ (20 мкл).
    2. Нажмите на Скорость инфузии и установите скорость 8,000 нЛ/мин (8 мкл/мин).
  3. Выйдите из Configuration , нажав на кнопку Reset Pos.
  4. Промойте кончик иглы, нажав на кнопку Infuse , пока на кончике иглы не появится небольшой шарик раствора гемоглобина.
  5. Аккуратно вытрите раствор гемоглобина из кончика иглы стерильным аппликатором с хлопковым наконечником.

4. Инъекции животным

  1. Установите брегму как ноль на стереотаксической инжекторной системе, регулируя медиолатеральное и переднезаднее положения шприца, прежде чем опустить кончик промытой шприцевой иглы, чтобы осторожно коснуться черепа в брегме.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При введении из лямбды установите лямбду равным нулю.
  2. Определите координаты выбора.
    1. При инъекции из брегмы, у крыс P4, описанных здесь, используйте 1,5 мм латерально, 0,4 мм спереди и 2,0 мм в глубину от брегмы.
    2. При инъекции из лямбды используйте следующие координаты для крыс P4: 1,1 мм боковой, 4,6 мм передний и 3,3 мм в глубину от лямбды.
  3. Поднимите шприцевую иглу на 1 см выше черепа, чтобы очистить кожу головы. Когда шприц поднят, приступайте к установке медиолатеральных и переднезадных координат.
  4. Опустите иглу шприца, чтобы осторожно коснуться черепа. Убедитесь, что игла касается черепа.
  5. Установите дорсовентральную координату на период 30 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При установке дорсовентральной координаты игла проколет череп. Необходимо позаботиться о том, чтобы шприц проходил через череп, не деформируя череп. Деформации черепа можно избежать, медленно отводя иглу вдоль дорсовентральной координаты, если происходит деформация, а затем помещая иглу обратно по той же траектории. Это позволяет игле проходить через отверстие в черепе с меньшей силой и без деформации.
  6. На интерфейсе стереотаксического инжектора нажмите кнопку «Выполнить », чтобы начать инъекцию.
  7. После того, как инъекция закончена, оставьте иглу шприца на месте в течение 2 мин, чтобы свести к минимуму обратный поток раствора.
  8. Медленно вынимайте шприц вдоль дорсовентральной координаты в течение 2 мин, пока кончик иглы не окажется на 2 см выше кожи головы.
  9. Поверните стереотаксический рычаг инжектора в сторону от операционного поля.

5. Послеоперационный уход

  1. Закройте кожу головы монофиламентным швом 6-0. Сделайте один простой прерванный шов в центре разреза 0,3 см.
  2. Выньте щенка из наркоза и поместите его в безопасное место на грелке.
  3. Верните грызуна в домашнюю клетку, чтобы оправиться от наркоза под присмотром его плотины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Своевременное возвращение к уходу за плотиной снижает раннюю послеоперационную смертность.
  4. Следите за животными на предмет анестезии путем потери корректирующего рефлекса ежечасно после операции в течение 3 ч.
  5. Контролируйте животных ежедневно в течение 7 дней для нормальной активности, потребления пищи и увеличения веса. Следите за местом разреза для заживления ран, закрытия и повторного появления меха в месте операции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В редких случаях, когда неврологические изменения, такие как судороги, центральная депрессия или снижение аппетита, наблюдаются во время мониторинга, усыпляют животное с помощью внутрисосудистой перфузии или вывиха шейки матки под наркозом.
  6. Чтобы предотвратить инфекцию после закрытия шва и заживления раны, нанесите местный тройной антибиотик в месте разреза.

6. Получение и количественная оценка МРТ

  1. Выполните МРТ на сканере мелких животных 4.7T или 9.4T.
  2. Поверните грелку в среду, чтобы поддерживать температуру тела крысы.
  3. Индуцировать анестезию в камере с использованием 3% изофлурана.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подтверждайте достаточную анестезию, используя реакцию щипца пальца ноги /хвоста каждые 15 минут. Мониторинг анестезии с визуальным наблюдением за цветом тканей, температурой тела и частотой дыхания.
  4. Поместите анестезируемую крысу, склонную к МРТ, с носом, расположенным в адаптере анестезии с постоянным потоком 1,5% изофлурана.
  5. Выполните Т2-взвешенную визуализацию, выбрав Т2-взвешенную последовательность быстрого спинового эха.
    1. При использовании МРТ-сканера 4.7T введите в программное обеспечение МРТ следующие параметры: время повторения = 3000 мс, время эха = 27,50 мс, количество средних значений = 3, поле зрения = 18,0 мм x 18,0 мм, матрица = 128 x 128, количество осевых срезов = 24, толщина = 0,50 мм.
    2. При использовании МРТ-сканера 9.4T введите в программное обеспечение МРТ следующие параметры: время повторения = 5000 мс, время эха = 66,00 мс, эхо-интервал = 16,50 мс, количество средних значений = 2, повторений = 1, редкий фактор = 8, поле зрения = 16,0 мм x 16,0 мм, матрица = 256 x 256, количество осевых срезов = 32, толщина = 0,50 мм.
  6. Нажмите кнопку Продолжить , чтобы начать последовательность.

7. Обработка и анализ изображений

  1. Используйте собственные Т2-взвешенные данные для анализа объема мозга. Используйте программное обеспечение сегментации для ручного разграничения боковых желудочков6. Нажмите « Режим кисти» и выберите стиль квадратной кисти . Отрегулируйте размер кисти до 1. Щелкните Инспектор макетов и выберите осевое представление. Нажмите кнопку масштабирования, чтобы соответствовать. Наведите курсор на изображение; проследить и заполнить боковое желудочковое пространство.
  2. Нажмите сегментация на панели инструментов | Объем и статистика для просмотра сегментированных томов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Успешность инъекций была подтверждена радиологическими и иммуногистохимическими средствами. У животных, перенесших инъекцию гемоглобина, развилась умеренная острая вентрикуломегалия при оценке с помощью МРТ (рисунок 2А), со значительно большими боковыми желудочками через 24 ч и 72 ч после инъекции гемоглобина по сравнению с животными, введенными в КСФ (Рисунок 2B, C). Хотя не было выявлено существенной разницы в объеме боковых желудочков между ж...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта модель IVH с использованием инъекций гемоглобина позволяет изучать патологию IVH, специфически опосредованную гемоглобином. Для дополнительных исследований гемоглобин также может быть легко доставлен in vitro и не мешает биохимическим анализам белков, полученных микроглией / макрофагами, которые присутствуют в цельной крови.

Ведущие теории IVH-PHH включают механическую обструкцию циркуляции ликвора, нарушение ресничек, выстилающих эпендимальные стенки, воспаление, фиброз и токсичн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JMS получила финансирование от NIH/NINDS R01 NS110793 и K12 (Neurosurgion Research Career Development Program). BAM получил финансирование от NIH / NINDS K08 NS112580-01A1, University of Kentucky Neuroscience Research Priority Area Award и Hydrocephalus Association Innovator Award.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Инсулиновый шприц 0,3 млBD Microfine + Инсулиновый шприц230-45330,3-0,5 мл синринги подойдут
1,5 мл микропробиркиСША Scientific1615-5500Лот No K194642H -3 511
4,7 Т МРТAgilent/Varian4,7 Т/33 смAgilent/Varian DirectDrive 4,7-T (200-МГц) Система МРТ
6-0 монофиламентный шовETHICON667G
9,4 Т МРТBrukerBioSpec 94/20Используется в данном протоколе без криозонда
Аналитические весыCCURIS InstrumentsW3200-320
Искусственная спинномозговая жидкость (aCSF)Tocris Bioscience3525Номер партии: 72A
BetadinePurdue Products L.P.301005-00NDC 67618-150-09
Карпрофен (инъекционный)Zoetis Inc. PI 4019448Римадилэтанол
Decon Laboratories2701
ГрелкаSunbeamE12107-819UL 612A, Z-1228-001
ГемоглобинMP Biomedicals100714LOT NO. SR02321
IsofluranePiramal Critical CareNDC 66794-017-25
Изофлуран вапорайзерVETEQUIP911103
Свет для стереотаксического оборудованияDolan-Jenner industriesFiber-Lite MI-150
Микроинъекционный шприцевой насосWorld Precision InstrumentsMICRO21Serial 184034 T08K
программное обеспечение для МРТBruker BioSpinParavision 360 3.2
КислородВоздух Газ ЗдравоохранениеUN1072НОМЕР ЛОТА S1432080XA02
Sprague Dawley ratsCharles River LaboratoriesКод штамма: 001
Стереотаксический инструментKOPF InstumentsМодель 900LS Lazy Susan
Стерильный аппликатор с ватным наконечникомFischerbrand23-400-118
Хирургическое лезвиеcovetrus#10
Топический тройной антибиотикТройной антибиотик МазьNDC 51672-2120-1
Программное обеспечение для количественного определения объема желудочковITK-SNAPITK-SNAP 4.0.0 beta

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Robinson, S. Neonatal posthemorrhagic hydrocephalus from prematurity: Pathophysiology and current treatment concepts: A review. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 9 (3), (2012).
  2. Hasselager, A. B., Børch, K., Pryds, O. A. Improvement in perinatal care for extremely premature infants in Denmark from. Danish Medical Journal. 63 (1), to (1994).
  3. Johnston, P. G., Gillam-Krakauer, M., Fuller, M. P., Reese, J. Evidence-Based Use of Indomethacin and Ibuprofen in the Neonatal Intensive Care Unit. Clinics in Perinatology. 39 (1), (2012).
  4. Mahaney, K. B., Buddhala, C., Paturu, M., Morales, D., Limbrick, D. D., Strahle, J. M. Intraventricular Hemorrhage Clearance in Human Neonatal Cerebrospinal Fluid: Associations with Hydrocephalus. Stroke. , (2020).
  5. Strahle, J. M., et al. Longitudinal CSF Iron Pathway Proteins in Posthemorrhagic Hydrocephalus: Associations with Ventricle Size and Neurodevelopmental Outcomes. Annals of Neurology. 90 (2), (2021).
  6. Strahle, J. M., et al. Role of Hemoglobin and Iron in hydrocephalus after neonatal intraventricular hemorrhage. Neurosurgery. 75 (6), (2014).
  7. Garton, T. P., He, Y., Garton, H. J. L., Keep, R. F., Xi, G., Strahle, J. M. Hemoglobin-induced neuronal degeneration in the hippocampus after neonatal intraventricular hemorrhage. Brain Research. 1635, (2016).
  8. SNAP Tutorial and User’s Manual. , Medtext, Inc.. Hinsdale (IL). Available from: http://www.itksnap.org/docs/fullmanual.php (2022).
  9. Goulding, D. S., Caleb Vogel,, Gensel, R., Morganti, J. C., Stromberg, J. M., Miller, A. J., A, B. Acute brain inflammation, white matter oxidative stress, and myelin deficiency in a model of neonatal intraventricular hemorrhage. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 26 (6), (2020).
  10. Strahle, J., Garton, H. J. L., Maher, C. O., Muraszko, K. M., Keep, R. F., Xi, G. Mechanisms of Hydrocephalus After Neonatal and Adult Intraventricular Hemorrhage. Translational Stroke Research. 3, (2012).
  11. Jinnai, M., et al. A Model of Germinal Matrix Hemorrhage in Preterm Rat Pups. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, (2020).
  12. Georgiadis, P., et al. Characterization of acute brain injuries and neurobehavioral profiles in a rabbit model of germinal matrix hemorrhage. Stroke. 39 (12), (2008).
  13. Cherian, S. S., Love, S., Silver, I. A., Porter, H. J., Whitelaw, A. G. L., Thoresen, M. Posthemorrhagic ventricular dilation in the neonate: Development and characterization of a rat model. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 62 (3), (2003).
  14. Balasubramaniam, J., Xue, M., Buist, R. J., Ivanco, T. L., Natuik, S., del Bigio,, R, M. Persistent motor deficit following infusion of autologous blood into the periventricular region of neonatal rats. Experimental Neurology. (1), (2006).
  15. Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances. The Lancet Neurology. 8 (1), (2009).
  16. Dobbing, J., Sands, J. Comparative aspects of the brain growth spurt. Early Human Development. 3 (1), (1979).
  17. Craig, A., et al. Quantitative analysis of perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Experimental Neurology. 181 (2), (2003).
  18. Lodygensky, G. A., Vasung, L., Sv Sizonenko,, Hüppi, P. S. Neuroimaging of cortical development and brain connectivity in human newborns and animal models. Journal of Anatomy. 217 (4), (2010).
  19. Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Developmental Neuroscience. 33 (34), (2011).
  20. Engelhardt, B. Development of the blood-brain barrier. Cell and Tissue Research. 314 (1), (2003).
  21. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for bloodĝ€"brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), (2010).
  22. Alles, Y. C. J., Greggio, S., Alles, R. M., Azevedo, P. N., Xavier, L. L., DaCosta, J. C. A novel preclinical rodent model of collagenase-induced germinal matrix/intraventricular hemorrhage. Brain Research. 1356, (2010).
  23. Christian, E. A., et al. Trends in hospitalization of preterm infants with intraventricular hemorrhage and hydrocephalus in the United States. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 17 (3), 2000-2010 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи