Описан протокол выделения стабильно трансфицированных клонов клеток меланомы с помощью стеклянных цилиндров. Мы ориентируемся на практические советы, которые могут иметь решающее значение для успеха всей процедуры.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение стабильно трансфицированных клонов клеток меланомы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Клеточные популяции, которые имеют стабильные изменения в своей геномной информации, широко используются учеными в качестве исследовательской модели. Они не требуют повторной трансфекции клеток, так как это может привести к гетерогенной популяции клеток и переменной эффективности трансфекции, что влияет на воспроизводимость. Кроме того, они предпочтительнее для крупномасштабных анализов. Создание стабильных клеточных клонов полезно для широкого спектра применений, таких как исследования функций генов и производства рекомбинантных белков. Существует несколько методов получения однородной клеточной популяции при начальной транзиторной трансфекции. Здесь мы опишем выделение одноклеточных клонов с помощью стеклянных цилиндров. Хотя этот метод известен уже некоторое время, есть несколько важных шагов, пренебрежение которыми может привести к неудаче. Мы успешно использовали этот метод для получения клонов со стабильной сверхэкспрессией интересующего белка (POI) или с нокаутом интересующего гена (GOI). Мы описываем такие этапы подготовки, как оптимизация выбора концентраций лекарственного средства, подготовка стеклянных цилиндров и проверка наличия у полученных клонов желаемого изменения экспрессии ГОИ с помощью ПЦР, вестерн-блоттинга, иммуноокрашивания или секвенирования гДНК (в зависимости от типа полученных клонов). Мы также обсуждаем фенотипическую гетерогенность хорошо укоренившихся клеточных линий, поскольку это может быть проблемой при получении стабильных клеточных клонов.
Введение
Стабильная трансфекция клеток млекопитающих является рутинно используемым методом в нескольких областях применения клеточных культур, включая исследования рака. Его преимущество перед транзиторной трансфекцией заключается в том, что введенный чужеродный генетический материал не может быть потерян из-за факторов окружающей среды (например, слияния клеток или стадии репликации) и деления клеток, поскольку он интегрирован в геном хозяина1. Разработка стабильно экспрессирующих клеточных линий может быть трудоемкой и сложной, но если требуется устойчивая экспрессия генов в течение длительного п....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Субкультура и посев клеток для оптимизации концентрации препарата
- Подогрейте среду для культивирования клеток (в данном случае модифицированную среду Дульбекко с уменьшенной концентрацией (1,5 г/л) NaHCO3, 10% (v/v) фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% (v/v) L-глутамина и 1% (v/v) антибиотика-антимикотика) и раствор трипсина на водяной бане до 37 °C.
- Отсадите и выбросьте питательную среду из клеток A735, выращиваемых в колбе для клеточных культур T25. Клеточная линия получается из коммерческих источников.
- Вымойте остатки среды для культивирования клеток из клеток, промыв к....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Используя представленный протокол, мы подробно демонстрируем выделение стабильно трансфицированных клонов клеток меланомы методом стеклянного цилиндра (рис. 1А). Наши исследования относятся к клеточной биологии меланомы, и наиболее распространенной исследовательской моделью, которую мы используем, является адгезивная и высокоинвазивная линия меланомы A375. Поскольку наши исследования показали, что клетки меланомы продуцируют гельсолин (GSN) на высоком уровне по сравнению с другими типами рак.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы привели подробное описание выделения стабильно трансфицированных клонов клеток меланомы стеклянными цилиндрами. Получение контрольных клонов важно при получении клонов с измененной экспрессией генов, поскольку результаты, полученные для клонов целевой модификации, всегда следует сравнивать с результатами, полученными для контрольной группы. Таким образом, мы можем проверить, не влияет ли на результаты экспериментов сама трансфекция или культура с селективным антибиотиком, а не какие-т.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана Национальным центром науки, Польша (проект #2016/22/E/NZ3/00654, предоставлен AJM).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Центрифужная пробирка 15 мл | GoogleLab Scientific | G66010522 | |
| 150 мм чашка для клеточных культур с сеткой 20 мм | Falcon | 353025 | |
| 24-луночная тарелка | VWR International | 10062-896 | |
| 35 мм чашка для культивирования | Eppendorf | EP0030700112 | |
| 6-луночная чашка | Eppendorf | EP0030700113 | |
| 96-луночная плита | VWR International | 10062-900 | |
| Уксусная кислота, 80% раствор | Chempur | 115687330 | |
| Agarose | Prona-Abo | BLE500 | |
| антибиотик-антимикотик | Gibco | 15240062 | |
| антитела против GAPDH | Santa Cruz Biotechnology Inc., | sc-47724 | |
| антитела к GSN - клон C20 | Santa Cruz Biotechnology Inc., | sc-6405 | |
| анти-GSN антитела - клон GS-2C4 | Sigma-Aldrich | G44896 | |
| Бычья сыворотка альбумин (БСА) | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Color Taq PCR Master Mix (2x) | EurX | E2525 | |
| Control Double Nickase Plasmid | Santa Cruz Biotechnology Inc., | sc-437281 | |
| Coverslips | bionovo | 16283 | |
| Dako Монтажная среда | Clontech | S3023 | |
| DMSO - Аппличем диметилсульфоксида | A3672,0250 | ||
| Набор для очистки ДНК | EurX | 3555-02 | |
| ослик анти-мышь Alexa Fluor 488 | Invitrogen | # A-21202 | |
| DTT - 1,4-дитиотрейтол | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| EcoRI | Thermo Fisher Scientific | FD0274 | |
| ЭДТА-этилендиамитетрауксусная кислота | Poch (Pol-Aura | )593280117 | |
| EGTA - этиленгликоль-бис(2-аминоэтиловый эфир)- N,N,N',N'-тетрауксусная кислота | Sigma-Aldrich | E0396 | |
| FBS - Фетальная сыворотка крупного рогатого скота | Gibco | 10270-106 | |
| Гельсолин CRISPR Плазмиды | Santa Cruz Biotechnology Inc., | sc-401005-NIC | |
| формальдегид | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Глицерин | Sigma-Aldrich | L-4909 | |
| высокий уровень глюкозы Dulbecco' s модифицированный Eagle' s среды с пониженной концентрацией (1,5 г/л) NaHCO3 | Польская академия наук,Wroc aw, Польша | 11-500 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| L-глютамин | Gibco | 25030-024 | |
| лигнин | Bionovo | B-0521 | |
| Липофектамин 3000 Реагент для трансфекции | Invitrogen | L3000-008 | |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich | S6508 | |
| Na4P2O7 | Sigma-Aldrich | P8010 | |
| NaF | Sigma-Aldrich | 450022 | |
| NEBuilder Инструмент для сборки | http://nebuilder.neb.com/#!/ | ||
| pACGFP-C1 | Clontech | ||
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26616 | |
| Perfect 100.о. ДНК-лестница | EurX | E3134 | |
| фаллоидин-Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A12380 | |
| Коктейль ингибиторов фосфатазы 2 | Sigma-Aldrich | P5726 | |
| Коктейль ингибиторов фосфатазы 3 | Sigma-Aldrich | P0044 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | BCA от Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| Pierce | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| полиэтиленимин (ПЭИ) | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| коктейль ингибиторов протеазы | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| пуромицин | InviviGen | ant-pr | |
| SDS - додецилсульфат натрия | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| силикон | CX80 Polska | ||
| Sodium хлорид - NaCl | Chempur | 7647-14-5 | |
| дезоксихолат натрия | Sigma-Aldrich | D6750259 | |
| сахарозы | Poch (Pol-Aura) | PA-06-772090110 | |
| стеклянные цилиндры | Sigma-Aldrich | C3983-50EA | |
| Колба для культуры тканей 25 мл | VWR | International 10062-868 | |
| Колба для культуры тканей 75 см2 | VWR | 10062-872 | |
| Основание Trisma | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| трипсин | Польская академия наук,Wrocaw, Польша | 20-500 | |
| мочевина | Sigma-Aldrich | 8656 | |
| раствор ксилола | Chempur | 115208603 |
Ссылки
- Recillas-Targa, F. Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals. Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).
- Wurm, F. M.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Эта статья была опубликована
Видео скоро будет доступно