Объединенный скрининг библиотеки шРНК для выявления факторов, модулирующих фенотип лекарственной устойчивости

Терапевтические варианты при остром миелоидном лейкозе (ОМЛ) оставались неизменными в течение почти последних пяти десятилетий, с цитарабином (AraC) и антрациклинами в качестве краеугольного камня для лечения заболевания. Одной из проблем успеха терапии ОМЛ является устойчивость лейкемических стволовых клеток к химиотерапии, приводящая к рецидиву заболевания ^1,2. Эпигенетическая регуляция играет жизненно важную роль в патогенезе рака и лекарственной устойчивости, и несколько эпигенетических факторов стали перспективными терапевтическими мишенями ^3,4,5. Эпигенетические регуляторные механизмы влияют на пролиферацию и выживаемость при постоянном воздействии химиотерапевтических препаратов. Исследования в негематологических злокачественных новообразованиях показали, что небольшая часть клеток, которые преодолевают эффект препарата, подвергаются различным эпигенетическим модификациям, в результате чего выживаемость этих клеток^{составляет 6,7}. Однако роль эпигенетических факторов в опосредовании приобретенной резистентности к цитарабину при ОМЛ не изучена.

Высокопроизводительный скрининг - это подход к открытию лекарств, который со временем приобрел глобальное значение и стал стандартным методом в различных аспектах для выявления потенциальных целей в клеточных механизмах, для профилирования путей и на молекулярном уровне ^8,9. Концепция синтетической летальности включает в себя взаимодействие между двумя генами, где возмущение любого гена само по себе является жизнеспособным, но обоих генов одновременно приводит к потере жизнеспособности¹⁰. Использование синтетической летальности при лечении рака может помочь идентифицировать и механически охарактеризовать надежные синтетические летальные генетические взаимодействия¹¹. Мы приняли комбинаторный подход высокопроизводительного скрининга шРНК с синтетической летальностью для выявления эпигенетических факторов, ответственных за приобретенную резистентность к цитарабину при ОМЛ.

Известно, что острые лейкозы, вызванные хромосомной транслокацией гена лейкемии смешанной линии (MLL или KMT2A), связаны с плохой выживаемостью у пациентов. Полученные химерные продукты перегруппировок генов MLL , то есть белки слияния MLL (MLL-FPs), могут трансформировать гемопоэтические стволовые /прогениторные клетки (HSPCs) в лейкемические бласты с участием нескольких эпигенетических факторов. Эти эпигенетические регуляторы представляют собой сложную сеть, которая диктует поддержание программы лейкемии и, следовательно, может формировать потенциальные терапевтические мишени. В этом контексте мы использовали клеточную линию MV4-11 (содержащую ген слияния MLL MLL-AF4 с мутацией FLT3-ITD; называемую MV4-11 P) для разработки приобретенной резистентной к цитарабину клеточной линии, называемой MV4-11 AraC R. Клеточная линия подвергалась воздействию увеличивающихся доз цитарабина с прерывистым восстановлением после медикаментозного лечения, известного как отпуск лекарств. Полумаксимальную ингибирующую концентрацию (IC50) оценивали с помощью анализа цитотоксичности in vitro .

Мы использовали объединенную эпигенетическую библиотеку шРНК (см. Таблицу материалов), управляемую промотором hEF1a с лентивирусной основой pZIP. Эта библиотека содержит шРНК, нацеленные на 407 эпигенетических факторов. Каждый фактор имеет 5-24 шРНК, в общей сложности 5 485 шРНК, включая пять нецелевых контрольных шРНК. Модифицированный каркас miR-30 "UltrmiR" оптимизирован для эффективного первичного биогенеза и экспрессии шРНК^12,13.

Схема этого эксперимента проиллюстрирована на рисунке 1А. Текущий протокол фокусируется на скрининге РНКи с использованием библиотеки шРНК эпигенетического фактора в клеточной линии MV4-11 AraC R (рисунок 1B), клеточной линии суспензии. Этот протокол может быть использован для скрининга любой целевой библиотеки в любой лекарственно-устойчивой клеточной линии по своему выбору. Следует отметить, что протокол трансдукции будет отличаться для адгезивных клеток.

Следуйте руководящим принципам Институционального комитета по биобезопасности (МЧК) и используйте надлежащий механизм для лечения лентивируса (BSL-2). Персонал должен быть надлежащим образом обучен обращению с лентивирусом и его удалению. Этот протокол следует руководящим принципам биобезопасности Христианского медицинского колледжа в Веллоре.

1. Выбор наиболее мощного промотора для получения стойкой и длительной экспрессии шРНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Важно провести эксперимент по трансдукции с использованием лентивирусных векторов с различными промоторами, которые экспрессируют флуоресцентные белки, чтобы идентифицировать промотор, который обеспечивает стабильную и долгосрочную экспрессию шРНК в клеточной линии, выбранной для эксперимента. Наиболее часто используемыми промоторами для этой цели являются hEF1α (фактор удлинения человека 1α), hCMV (цитомегаловирус человека) и промоторы SSFV (селезеночный фокус-образующий вирус), которые экспрессируют белок зеленой флуоресценции (GFP) (рисунок 2A).

1. Выполните подсчет ячеек с помощью метода исключения синего цвета trypan. Суспендировать клетки MV4-11 AraC R в 10% rpmI среде (RPMI с 10% FBS, дополненной 100 Ед/мл пенициллина и 100 Ед/мл стрептомицина), содержащей 8 мкг/мл полибрена. Семена 1 х 10⁶ клеток в 1,5 мл среды/лунки шестилуночной пластины в трех экземплярах.
2. Добавляйте различные объемы концентрированных лентивирусов (например, 10 мкл, 20 мкл и 40 мкл в зависимости от титра лентивирусов) в каждую лунку. Аккуратно покрутите тарелку, чтобы перемешать содержимое.
3. Выполняют спинфекцию центрифугированием при 920 х г при 37 °C в течение 90 мин.
4. Немедленно инкубируйте пластины в инкубаторе CO₂ (5% CO₂ при 37 °C).
5. Наблюдайте экспрессию GFP через 48 ч под флуоресцентным микроскопом, чтобы обеспечить успешную трансдукцию.
6. Количественная оценка экспрессии GFP с помощью проточной цитометрии через 72 ч для оценки эффективности трансдукции.
7. Культивируйте клетки в течение в общей сложности 2 недель и периодически контролируйте экспрессию GFP с помощью проточной цитометрии. Снижение экспрессии GFP, измеренное средней интенсивностью флуоресценции и процентом клеток GFP+, указывает на глушение промотора.
8. Отсортируйте клетки GFP+ на 10-й день и культивируйте клетки в течение 1 недели после сортировки. Периодически проверяйте выражение GFP во время изучения языка и региональных параметров.
9. Используйте непереведенные ячейки для установки ворот. Популяция за пределами шкалы 1 x^{10 1} справа по оси X считается положительной популяцией для GFP.
10. Выберите промотор, который показывает стойкую экспрессию GFP в пролонгированной культуре клеток.

2. Подготовка объединенной лентивирусной библиотеки шРНК эпигенетического фактора человека

1. Культивируйте клетки 293T (при низком количестве проходов с хорошей скоростью пролиферации) в трех чашках для культивирования клеток по 10 см с 8 мл 10% среды DMEM (DMEM с 10% FBS, содержащим 100 Ед / мл пенициллина и 100 Ед / мл стрептомицина) в каждой пластине.
2. Как только клетки достигнут 60% слияния, замените среду полной средой.
3. Приготовьте трансфекционную смесь (как указано в таблице 1), которая содержит безсывороточную среду, лентивирусную упаковку (psPAX2) и плазмиду оболочки (pMD2.G), объединенные библиотечные плазмиды и, наконец, трансфекционный реагент.
4. Смажьте смесь, чтобы хорошо перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 мин.
5. Добавьте трансфекционную смесь в ячейки 293T и аккуратно перемешайте, закручивая пластины. Инкубируйте пластины в инкубаторе CO₂ (5% CO₂ при 37 °C). Измените среду через 24 ч.
6. Через 48 ч проверьте экспрессию GFP под флуоресцентным микроскопом, чтобы обеспечить высокую эффективность трансфекции в клетках 293T.
7. Соберите супернатанты вируса через 48 ч, 60 ч и 72 ч и храните их при 4 °C. Добавляйте свежую среду (8 мл) в каждый момент времени после сбора вируса.
8. Объедините вирусные супернатанты. Общий объем объединенных вирусов составит: ~8 мл/пластина x 3 коллекции= ~24 мл/пластина; ~24 мл/пластина x 3 пластины = ~72 мл из 3 пластин.
9. Фильтруйте объединенные вирусы с помощью фильтра 0,4 мкм.
10. Для получения высокого титра вирусов концентрируют объединенные вирусы методом ультрацентрифугирования. Перенесите отфильтрованный вирусный супернатант в две трубки 70 Ti (32 мл/пробирка) и центрифугу при 18 000x g в течение 2 ч с медленным ускорением и замедлением. Используйте ротор и центрифугу с предварительным охлаждением до 4 °C.
11. Осторожно выньте трубки из центрифуги и полностью удалите супернатант.
12. Используя микропипетку, аккуратно повторно суспендируйте гранулу в 400 мкл DMEM (без FBS и антибиотиков). Инкубировать на льду в течение 1 ч и перемешать гранулы из обеих трубок.
13. Аликвотирует вирусы и замораживается при −80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пробирки и вирусы должны храниться на льду во время этапов 2.10.-2.13. Избегайте вспенивания при повторном использовании вируса с помощью простой среды. Среда должна поддерживаться при температуре 4 °C.
14. Рассчитайте концентрацию (x) вируса следующим образом:
    Общий объем до концентрации = 72 мл (72 000 мкл)
    Объем после концентрирования = 400 мкл
    Концентрация = 72 000/400= 180x

3. Оценка эффективности трансдукции лентивирусов

1. Трансдуцировать клетки 293Т с концентрированным вирусом в разных объемах (2 мкл, 4 мкл, 8 мкл) для подтверждения успешного получения лентивирусов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если концентрированные вирусы показывают высокую эффективность трансдукции (>50%) в небольших объемах (1-2 мкл), целесообразно разбавить концентрированный вирус в желаемых количествах (от 100x до 75x).
2. Разбавляют концентрированный вирус до 100x DMEM (без FBS и антибиотиков) для проведения экспериментов по титрованию в клеточной линии MV4-11 AraC R.
3. Семена 1 х 10⁶ ячеек (клеточная линия MV4-11 AraC R в 1,5 мл 10% среды RPMI, содержащей 8 мкг/мл полибрена) в одной лунке шестилуночной пластины. Подготовьте четыре скважины для обработки различными объемами вирусов.
4. Добавьте четыре различных объема (например, 1 мкл, 1,5 мкл, 2 мкл и 2,5 мкл) 100x вирусов.
5. Выполняют спинфекцию путем центрифугирования пластины при 920 х г в течение 90 мин при 37 °C.
6. Через 72 ч измеряют процентное содержание клеток GFP+ методом проточной цитометрии.
7. Определить объем вирусов для получения 30% эффективности трансдукции. Эта низкая эффективность трансдукции обеспечивает интеграцию одной шРНК на клетку.

4. Трансдукция объединенной эпигенетической библиотеки шРНК в лекарственно-устойчивую клеточную линию

1. Поддерживайте линию клеток-мишеней MV4-11 AraC R при плотности 0,5 x 10⁶ клеток/мл. Убедитесь, что клетки находятся в фазе экспоненциального роста в культуре.
2. Рассчитайте количество клеток, которые будут взяты для эксперимента, как показано ниже, исходя из количества вирусных интегрантов.
   Количество клеток, необходимых для трансдукции = 5,485 (количество шРНК) × 500 (представление сложенной шРНК) / 0,25 (MOI) = 10 982 000 ~11 x 10⁶ клеток
3. Повторное суспендирование 1,1 х 10⁷ ячеек в 16 мл 10% RPMI среды.
4. Добавьте полибрен (8 мкг/мл) и хорошо перемешайте. Затем добавьте необходимый объем вирусов для получения 30% эффективности трансдукции, как рассчитано в предыдущем разделе.
5. Посейте все ячейки на шестилуночной пластине с плотностью 1 х 10⁶ клеток/1,5 мл 10% rpmI среды на лунку.
6. Центрифугировать пластину в течение 90 мин при 920 х г при 37 °C.
7. Инкубируйте пластину на ночь в инкубаторе CO₂ (5% CO₂ при 37 °C).
8. Через 24 ч изменяют среду и переносят трансдуцированные клетки в колбу Т-75.
9. Через 48 часов проверьте GFP под флуоресцентным микроскопом, чтобы обеспечить успешную трансдукцию.
10. Через 72 ч количественно оцените процентное содержание клеток GFP+ с помощью проточной цитометрии.

5. Обогащение GFP-положительных клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Расширение трансдуцированных клеток путем культивирования их при плотности 0,5 х 10⁶ клеток/мл в течение 5-7 дней. Эти клетки представляют собой смешанную популяцию трансдуцированных и нетрансдуцированных, отобранных на основе GFP путем сортировки, как упоминалось на следующем этапе.

1. Выполните проточную сортировку трансдуцированных ячеек GFP+ с настройками сортировки потока, заданными как высокая чистота и низкий выход. Используйте непереведенные ячейки для установки ворот. Популяция за пределами 1 х 10² вправо считается положительной популяцией.
2. Соберите отсортированные клетки в 5% RPMI (RPMI с 5% FBS с добавлением 100 Ед/мл пенициллина и 100 Ед/мл стрептомицина).
3. Культивируйте отсортированные клетки в 10% RPMI среде.
4. Через 72 ч выполните постсортировочную оценку процента ячеек GFP+, чтобы обеспечить эффективность сортировки >95%.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что после сортировки получено ~3-5 x 10⁶ GFP положительных клеток, чтобы получить представление библиотеки шРНК от 450x до ~500x.

6. Скрининг отсева для выявления эпигенетических факторов, опосредующих лекарственную устойчивость

1. Культивируйте библиотеку шРНК трансдуцированных клеток в 10% RPMI в течение 5 дней. Криоконсервировать трансдуцированные клетки для будущих экспериментов, если это необходимо, перед медикаментозным лечением.
2. Центрифуга 1 х 10⁷ ячеек в дубликатах по 280 х г в течение 5 мин при 25 °С. Выбросьте супернатант и храните гранулы при температуре −80 °C. Эти образцы будут служить базовым ориентиром для эпигенетической библиотеки шРНК.
3. Культивируйте оставшиеся трансдуцированные клетки как дубликаты (R1 и R2), каждая из которых поддерживается при количестве клеток, которое обеспечивает 500-кратное представление библиотеки.
4. Обработать один из дубликатов препаратом (10 мкМ цитарабина) (R2), а другой без медикаментозного лечения (R1).
5. Меняйте среду для колб с препаратом и без него каждые 72 ч. Повторите изменение среды 3 раза при кумулятивном воздействии препарата в течение 9 дней.
6. После 9 дней лечения препаратом проверьте жизнеспособность клеток методом исключения трипан-синего цвета.
7. Центрифугировать оставшиеся ячейки при 280 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Повторно суспендируйте клетки в стерильном PBS и промывайте клетки. Центрифуга при 280 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
8. Выбросьте супернатант и храните гранулы при температуре −80 °C для экстракции ДНК.

7. Амплификация интегрированных шРНК методом ПЦР

1. Экстракция ДНК из трансдуцированных базовых клеток (Т) (стадия 6.2.) и клеток, обработанных препаратом (R2) и необработанных препаратом (R1).
2. Проверьте концентрацию образца с помощью флуорометра.
3. Рассчитайте количество ДНК, необходимое для ПЦР, как показано ниже:
   5 485 (нет. шРНК) × 500 (представление шРНК) × 1 х 6,6⁻¹² (г/диплоидный геном) = 15 мкг ДНК
4. Подвергайте образцы первому раунду ПЦР.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Реакционная смесь ПЦР изображена в таблице 2 с условиями термоциклера. Подробная информация о грунтовках приведена в дополнительной таблице 1.
5. Настройте несколько реакций, содержащих 850 нг ДНК на трубку (в общей сложности 43 реакции).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Первый раунд ПЦР усиливает фланговые области шРНК, в результате чего размер ампликона составляет 397 bp.
6. Объедините продукты ПЦР и очистите продукты ПЦР, используя 3-4 колонки стандартного набора для очистки геля / ПЦР.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация приводится в таблице 3.
7. Элюируют продукт в 50 мкл буфера из каждой колонки и объединяют элюты.
8. Количественно оцените ДНК и сохраните ее при -20 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Реагенты сведены в таблицу 4 с условиями термоциклера. Вторая ПЦР использует праймеры с последовательностью INDEX, необходимой для мультиплексирования в NGS в однопоточной клетке. Таким образом, каждый образец должен быть помечен другим индексом. Последовательности праймеров приведены в дополнительной таблице 1.
9. Настройте четыре реакции с 500 нг первичного продукта ПЦР в общем объеме реакции 50 мкл для каждого образца и отрицательного контроля.
10. Загрузите весь продукт для электрофореза с использованием 2% агарозного геля TBE и подтвердите размер полосы с помощью молекулярной лестницы 1 кб. Размер ампликона составляет 399 bp.
11. Визуализируйте продукты ПЦР в системе документации на гель.
12. Иссейте определенную полосу и очистите с помощью набора для очистки геля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Расчеты по очистке с помощью комплекта приведены в таблице 3.
13. Элюют в конечном объеме 30 мкл буфера элюирования. Приблизительная концентрация каждого элюента составит около 80-90 нг/мкл при общем объеме 30 мкл.

8. Секвенирование и анализ данных нового поколения

1. Последовательное введение продукта, очищенного гелем, начиная со стадии 7.13. на секвенсоре следующего поколения (например, Illumina) для получения счетчика считывания для истощенных шРНК.
2. Обрежьте последовательности адаптеров сгенерированных считываний FastQ с помощью набора инструментов Fastx (версия 0.7).
3. Выровняйте отфильтрованные чтения по ссылочным последовательностям с помощью элайнера Bowtie с параметром допуска двух несоответствий. Убедитесь, что длина чтения после обрезки адаптера составляет около 21 бит/с.
4. Загрузите файлы с помощью программы Samtools (версия 1.9). Используйте параметр Flagstat и вычислите сводку выравнивания.
5. Загрузите обрезанные файлы fastQ в программное обеспечение CRISPRCloud2 (CC2) (https://crispr.nrihub.org/) вместе с эталонными последовательностями shRNA в виде файлов FASTA и выполните анализ в соответствии с инструкциями.
   1. Нажмите на ссылку Начать анализ в CC2.
   2. Выберите тип экрана Как Экран Выживание и Выпадение. Задайте количество групп и введите имя каждой группы.
   3. Загрузите справочную библиотеку в формате файла FASTA. Загруженные данные обрабатываются. Нажмите на выходной URL-адрес, чтобы получить результаты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это программное обеспечение использует бета-биномиальную модель с модифицированным t-тестом Стьюдента для измерения различий в уровнях сгРНК/шРНК, за которым следует комбинированный вероятностный тест Фишера для оценки значимости на уровне генов. Он вычисляет оценочные общие логарифмические 2-кратные изменения (Log2Fc) шРНК для эпигенетических факторов между обработанными (обогащенными/истощенными) и необработанными образцами (исходными линиями) с «p-значениями» и «значениями FDR».
6. Убедитесь, что значение FDR является «Отрицательным» для экрана выпадения и «Положительным» для экрана выживания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: CC2 является аналитической платформой для подсчета показаний и расчета представления складки (обогащения или истощения) шРНК между образцами.
7. Определите значительно обогащенные и истощенные шРНК (FDR <0,05) из результатов CC2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Существует 5-24 шРНК против каждого фактора. Проверьте значения FDR для каждой из шРНК; рассмотрим FDR, который составляет <0,01, и возьмем среднее значение для выбранных ШРНК. Рассмотрим топ-40 хитов. Построение графика для выбранных факторов на основе отрицательных значений Log2Fc или FDR. Убедитесь, что нецелевые шРНК также имеют значительные значения FDR, чтобы обеспечить подлинность данных, поскольку они служат контрольными шРНК.

Общий рабочий процесс скрининга показан на рисунке 1A. In vitro цитотоксичность MV4-11 AraC R (48 ч) показала, что IC50 к цитарабину в MV4-11 AraC R выше, чем MV4-11 P (рисунок 1B). Эта клеточная линия была использована в исследовании в качестве модели для скрининга эпигенетических факторов, ответственных за резистентность к цитарабину.

На рисунке 2A показаны линеаризованные векторные карты pZIP с тремя различными промоторами: hEF1α (фактор удлинения человека 1α), hCMV (цитомегаловирус человека) и SSFV (вирус, формирующий фокус селезенки), с скремблированной шРНК в последовательности UltramiR. Рисунок 2B иллюстрирует векторную карту pZIP, используемую в библиотечном эксперименте, и шРНК, нацеленную на эпигенетический фактор с Zsgreen и пуромицином в качестве выбираемого маркера, управляемого промотором hEF1a. Эти векторы были использованы при выборе наиболее мощного промоторного эксперимента.

Выбор наиболее мощного промотора для получения последовательной и длительной экспрессии в клетках-мишенях проиллюстрирован на рисунке 3. Количественная оценка GFP, измеренная MFI, показала более 90% эффективности трансдукции в конце 72 ч в MV4-11 AraC R для всех трех промоутеров. Гистограмма экспрессии GFP показывает гетерогенную популяцию для hCMV, но однородную в случае hEF1a и SFFV на 3-й день трансдукции (рисунок 3A). Гистограмма показывает экспрессию GFP, управляемую тремя различными промоторами (hEF1α, hCMV и SFFV) на 3-й день трансдукции в MV4-11 AraC R (рисунок 3B). GFP, управляемый SFFV, показал снижение MFI на 5-й день трансдукции (рисунок 3C). Не наблюдалось снижения MFI при первичной сортировке родительской линии MV4-11, управляемой hEF1a. Таким образом, промотор hEF1a был идентифицирован как подходящий промотор для клеточной линии (рисунок 3D).

Рисунок 4А иллюстрирует эффективность трансфекции объединенных плазмид библиотеки шРНК в клетках 293T после 48 ч трансфекции. Выражение GFP было ярким, что указывает на хорошую эффективность трансфекции. После сбора вируса эффективность трансдукции подготовленного объединенного вируса проверяли в клетках 293T в трех различных концентрациях (2 мкл, 4 мкл и 8 мкл). Мы заметили, что даже вирус 2 мкл приводил к той же эффективности, что и вирус 8 мкл, тем самым подтверждая высокий вирусный титр (рисунок 4B).

На рисунке 5 показана трансдукция объединенной библиотеки в клеточной линии MV4-11 AraC R и определение лентивирусного титра. Объединенную библиотеку шРНК лентивирус разбавляли в 100 раз, а затем добавляли к клеточной линии MV4-11 AraC R в разных объемах (1 мкл, 1,5 мкл, 2 мкл и 2,5 мкл). Эффективность была проверена в конце 72 ч. Эффективность трансдукции составила 30% для 2-2,5 мкл вируса, подтверждая одну интеграцию шРНК на клетку (рисунок 5А). Трансдукция с 2,5 мкл объединенного библиотечного вируса в ячейках 1,1 x 107 MV4-11 AraC R привела к эффективности трансдукции 30%. GFP-положительные клетки были отсортированы, представляя собой объединенную библиотеку шРНК (рисунок 5B).

После трансдукции объединенного шРНК эпигенетического лентивируса в клеточной линии MV4-11 AraC R GFP-положительные клетки сортировали на 5-й день или 7-й день (рисунок 6). Эти отсортированные клетки подвергались длительному воздействию цитарабина в течение 9 дней. Жизнеспособность была проверена на 9-й день, и клетки были собраны для ДНК. (Рисунок 6А). Гистограмма показывает снижение скорости пролиферации трансдуцированных клеток в присутствии цитарабина (рисунок 6B).

Извлеченную ДНК из образцов подвергали двум раундам ПЦР, а конечный гель-элюированный продукт представлял собой обогащенные шРНК, количественно оцененные NGS. На рисунке 7А показаны области связывания праймера, используемого в 1-м и 2-м раундах ПЦР, где праймеры 1-го раунда связываются с фланговыми областями интегрированной шРНК, а 2-й прямой праймер связывается с петлевой последовательностью. Обратный праймер связывается с областью амплифицированного вектора в 1-м раунде ПЦР. Рисунки 7B и 7C иллюстрируют размер полосы продукта ПЦР в конце 1-го (397 bp) и 2-го раунда ПЦР (399 bp), который был элюирован гелем, очищен и представлен для анализа NGS.

После подвергнутия ДНК стандартной процедуре контроля качества образцы были обработаны для анализа NGS. Мы использовали CRISPRCloud2, удобную для пользователя облачную аналитическую платформу для выявления обогащенных и истощенных шРНК в объединенном скрининге шРНК. Рисунок 8 иллюстрирует представление обогащенных или истощенных шРНК, нацеленных на эпигенетические факторы, которые могут опосредуть резистентность к цитарабину при ОМЛ.

Рисунок 1: Схема и модель исследования. (A) Иллюстрация обзора рабочего процесса. (B) MV4-11 родительские и AraC-резистентные клетки, обработанные повышением концентрации цитарабина (от 0,1 мкМ до 1000 мкМ) и жизнеспособность, оцененные с помощью анализа МТТ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2. Иллюстрация линеаризованных векторов. (A) Три векторные карты с тремя различными промоторами, hEF1α (фактор удлинения человека 1α), hCMV (цитомегаловирус человека) и SSFV (вирус, формирующий фокус селезенки), с скремблированной шРНК в последовательности UltramiR. (B) Иллюстрация векторной карты, используемой в библиотечном эксперименте с промотором hEF1α и шРНК, нацеленной на эпигенетический фактор с Zsgreen и пуромицином в качестве выбираемого маркера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Выбор наиболее мощного промотора для получения стойкой и пролонгированной экспрессии шРНК. (A) Репрезентативные графики потока для GFP, количественно оцененные проточной цитометрией в конце 72 ч для промоторов hEF1a, hCMV и SFFV. hCMV показывает гетерогенный пик, в то время как hEF1a и SFFV показывают один однородный пик. (B) Эффективность промотора в клеточной линии MV4-11 AraC R. (C) GFP, управляемый SFFV, показывает замалчивание GFP в длительной культуре. (D) клетки GFP, управляемые hEF1a, демонстрируют устойчивую экспрессию после сортировки клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Проверка эффективности подготовленного объединенного лентивируса шРНК. (А) Изображения флуоресцентной микроскопии показывают эффективность трансфекции объединенной библиотеки шРНК, трансфектированной в 293Т в конце 48 ч с использованием 10-кратного увеличения. (B) Эффективность трансдукции объединенного вируса оценивали в 293T-клетках с различными объемами вируса (2 мкл, 4 мкл и 8 мкл) с использованием 10-кратного увеличения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Объединенная библиотечная трансдукция в клеточной линии-мишени и определение лентивирусного титра. (A) Клеточная линия MV4-11 AraC R трансдуцируется с различными объемами вируса (1 мкл, 1,5 мкл, 2 мкл и 2,5 мкл). Эффективность проверяли в конце 72 ч. (B) Трансдукция объединенного библиотечного вируса в 1 x 107 MV4-11 AraC R клеток для достижения 30% эффективности трансдукции, затем сортировка GFP-положительных клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Скрининг выпадения для выявления эпигенетических факторов, опосредующих лекарственную устойчивость. (А) Схематическая иллюстрация лекарственного лечения для обогащения резистентных клеток. Зараженные библиотекой клетки подвергались длительному воздействию цитарабина в течение 9 дней с последующей проверкой жизнеспособности и сбором клеток для извлечения ДНК. (B) Снижение жизнеспособности длительного воздействия цитарабина в резистентных клеточных линиях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Получение ампликонов, представляющих интегральную шРНК. (А) Области связывания праймера, используемые в 1-м и 2-м раунде ПЦР, где праймеры 1-го раунда связываются с фланговыми областями интегрированной шРНК, а второй передний праймер связывается с петлевой последовательностью. Обратный связывается с областью амплифицированной векторной области в 1-й ПЦР. (B) Иллюстрация размера полосы продукта ПЦР в конце 1-го раунда ПЦР (397 bp). (C) ПЦР-продукт 2-го раунда (399bp) был элюирован гелем, очищен и введен для NGS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 8: Результаты скрининга в клеточной линии AML (клеточная линия MV-4-11 Ara-C R). После подвергнутия ДНК стандартной процедуре контроля качества образцы были обработаны для анализа NGS. Мы использовали CRISPRCloud2, удобную для пользователя облачную аналитическую платформу, для выявления обогащенных и истощенных шРНК в объединенном скрининге шРНК.  Рисунок представляет собой обогащенные или истощенные шРНК, нацеленные на эпигенетические факторы, которые могут опосредуть резистентность к цитарабину при ОМЛ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Приготовление трансфекционной плазмидной смеси (расчет для 10 см пластины) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 2: Реакционная смесь ПЦР для1-го раунда ПЦР Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 3: Расчеты по очистке продуктов 1-й ПЦР Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 4: Реакционная смесь ПЦР для 2-го раунда ПЦР Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

У авторов нет конфликта интересов и нечего раскрывать.