Гравитационный метод транскардиальной перфузии для гистологического анализа центральной нервной системы мыши

Краткое содержание

Представлен удобный гравитационный перфузионный метод гистологического анализа центральной нервной системы мыши. Иммунофлуоресцентное обнаружение фосфорилированного α-синуклеина продемонстрировано на мышиной модели болезни Паркинсона. Эта работа также всесторонне описывает этапы транскардиальной перфузии, рассечения, замораживания / встраивания тканей и замороженного сечения.

Аннотация

Гистологический анализ образцов головного и спинного мозга, выделенных у мышей, является обычной практикой для оценки патологии в этой модельной системе. Для поддержания морфологии этих деликатных тканей обычно вводят химический фиксатор, такой как параформальдегид, через канюляцию сердца у анестезированных животных (транскардиальная перфузия). Транскардиальная перфузия сердца мыши традиционно полагалась на использование перистальтических насосов или давления воздуха для доставки как физиологических, так и фиксирующих растворов, необходимых для этого процесса. В качестве легкодоступной альтернативы этим методам эта работа демонстрирует использование гравитационного метода доставки перфусата, в котором используются материалы, доступные в большинстве хозяйственных магазинов.

Чтобы подтвердить этот новый метод перфузии, эта работа демонстрирует все последующие шаги, необходимые для чувствительного обнаружения фосфорилированного α-синуклеина как в головном, так и в спинном мозге. В эти этапы входит рассечение неподвижных тканей головного и спинного мозга, быстрое замораживание/встраивание и криосечение тканей, а также иммунофлуоресцентное окрашивание. Поскольку этот метод приводит к доставке фиксатора по всему телу, он также может быть использован для подготовки других ненейрональных тканей к гистологическому анализу.

Введение

Гистологическая характеристика патологии в центральной нервной системе (ЦНС) мышей является рутинной методикой, используемой в исследованиях нейродегенерации. Поскольку нейронные ткани быстро деградируют после смерти, обычной практикой является доставка химического фиксатора, такого как параформальдегид, в ткани ЦНС для сохранения их морфологии ^1,2. Химическая фиксация может быть выполнена либо через перфузию всего тела фиксирующим раствором, либо через выделение тканей и погружение их в фиксирующий раствор (так называемая «фиксация капли»). Перфузия является предпочтительным методом фиксаторной доставки, так как капельная фиксация может не допускать быстрого проникновения фиксирующего раствора в глубокие структуры ЦНС ^3,4,5. Кроме того, поскольку трудно удалить нефиксированный спинной мозг из позвоночного столба, доставка фиксирующего раствора посредством перфузии позволяет сохранить in situ микроскопическую и грубую анатомию спинного мозга и укрепляет ткань, чтобы свести к минимуму повреждение во время удаления.

Доставка буферных и фиксирующих растворов, необходимых для фиксации, обычно осуществляется с использованием коммерчески доступных насосов или давления воздуха. Гравитационная подача перфусата может служить альтернативой подаче насоса по следующим причинам: (1) Подача насоса или давления воздуха может в некоторых случаях потребовать от пользователя ручного поддержания давления в системе на протяжении всей перфузии. Гравитационная доставка перфузата может поддерживаться без вмешательства пользователя. (2) Перфусатный аппарат с гравитационной доставкой может быть изготовлен по низкой цене для пользователя путем получения материалов, доступных у стандартных научных поставщиков. В этой работе описывается, как построить простое гравитационное перфузионное устройство с использованием бутылок для мойки и виниловых трубок. Используя мышиную модель болезни Паркинсона, эта работа демонстрирует эффективность этой системы в перфузии тканей головного и спинного мозга до их выделения для замороженного сечения. Эта работа всесторонне описывает все этапы, методы и материалы, необходимые для рассечения фиксированной ткани животного, быстрого замораживания / встраивания и криосекции ткани и обнаружения присутствия фосфорилированного α-синуклеина как в головном, так и в спинном мозге с помощью непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии.

Протокол

Данные и экспериментальные шаги, представленные в этом протоколе, были сгенерированы с использованием мышей C57BL/6J. Все методы с участием животных были одобрены Государственным университетом Нью-Йорка Upstate Medical University Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Строительство перфузионного аппарата и платформы для рассечения

1. Как показано на рисунке 1, обрежьте внутренние соломинки от двух бутылок для мойки по 500 мл, разрезав их заподлицо на внутреннюю сторону навинчиваемого колпачка острым лезвием бритвы. Вырежьте квадратное отверстие размером 4 см х 4 см на дне каждой буферной бутылки. Вырежьте небольшое отверстие на дне каждой бутылки, чтобы пропустить изогнутый микропаток из нержавеющей стали.
2. Создайте S-образный изгиб в микропатулах, чтобы их можно было использовать в качестве крючков для подвешивания буферных бутылок. Вставьте согнутые микропатули в соответствующие отверстия в буферных флаконах.
3. Отрежьте две трубки длиной 25 см и плотно соедините их с наружными выходами из соломы бутылки. Соедините концы этих трубок вместе с разъемом Y. Отрежьте 2 м трубки и присоедините ее к свободному концу разъема Y.
4. Снимите поршень со шприца объемом 1 мл и отрежьте шприц примерно на расстоянии 6 см от кончика шприца. Разрежьте шприц, сначала забив пластик лезвием бритвы, а затем резко щелкнув пластиком шприца.
5. Вставьте разрезанную поверхность шприца в свободный конец пластиковой трубки. Вставьте на достаточную глубину, чтобы обеспечить плотное уплотнение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы все соединения внутри перфузионного аппарата были достаточно плотными, чтобы избежать утечки. В случае свободных соединений небольшие зажимы для шлангов из нержавеющей стали могут быть размещены и затянуты на соединениях по желанию, чтобы обеспечить плотное уплотнение в случае необходимости.
6. Пометьте одну буферную бутылку как PFA и одну бутылку как PBS (буфер). Измерьте приблизительно 1/3^длины от отверстия бутылки и проведите линию вокруг окружности бутылки в этой точке, чтобы обозначить соответствующий уровень наполнения растворов перфусата.
7. Выпрямите, а затем создайте петлю в большой скрепке, которая может поместиться по окружности трубки. Поместите эту петлю вокруг трубки непосредственно рядом со шприцем.
8. Поместите блок пенополистирола соответствующего размера в стеклянный лоток. Поместите концы скрепки в блок из пенополистирола, чтобы прикрепить трубку.
9. Используя бумажные полотенца, поднимите передний конец стеклянного лотка примерно на 2 см.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это поместит мышь примерно в 20° от положения Тренделенбурга (наклон назад), чтобы облегчить визуализацию диафрагмы во время рассечения и стимулировать дренаж жидкостей во время перфузии.

Рисунок 1: Диаграмма, изображающая собранный перфузионный аппарат. Сокращения: PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор; PFA = параформальдегид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Приготовление раствора параформальдегида (ПФА)

ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор PFA должен быть приготовлен свежим в день перфузии и выброшен в конце перфузии в специально отведенном контейнере для отходов перед удалением обученным персоналом. Этот протокол составляет 1 л 4% раствора PFA, что достаточно для перфузии примерно 4 мышей. PFA очень токсичен, и необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать вдыхания или прямого контакта с кожей в порошкообразной или жидкой форме. Поэтому большинство этапов подготовки выполняются в перчатках, защитных очках и лабораторном халате под вытяжным капюшоном.

1. Промойте стакан объемом 1 л, используя дистиллированную воду, и залейте примерно 800 мл 18 мОм молекулярно-биологического класса H₂O.
2. Нагревайте стакан_H2Oв микроволновой печи в течение 3 мин или до тех пор, пока температура воды не достигнет 65 °C. Поместите на нагревательную/перемешивающую пластину, хранящуюся в вытяжке.
3. Промойте стержень перемешивания дистиллированной водой и поместите его в горячую воду. Запустите мешалку и переверните горячую плиту до среднего огня. Убедитесь, что температура воды не превышает 70 °C.
4. Наденьте хирургическую маску, перчатки, защитные очки и лабораторный халат и отмерьте 40 г порошка PFA. Налейте этот порошок в нагретую воду.
5. Используя трансферную пипетку, добавьте в раствор несколько капель 5 M NaOH. Дайте порошку PFA полностью раствориться. Если порошок не полностью растворился через несколько минут, добавляют капли по 5 М NaOH по мере необходимости.
6. Как только почти весь PFA растворится (будет казаться слегка мутным), прекратите перемешивание / нагрев и немедленно добавьте 100 мл 10x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS). Наконец, доливайте воду до отметки 1 л на стакане, используя 18 мОм молекулярно-биологического класса H₂O. Накройте стакан полиэтиленовой пленкой и поместите его в морозильную камеру с температурой -20 °C, пока раствор не достигнет комнатной температуры (приблизительно 45 мин).
7. Откалибруйте рН-метр с использованием соответствующих стандартов. Пока стакан находится на перемешивающей пластине, измерьте рН раствора и добавляйте HCl до тех пор, пока рН не достигнет 7,4. При необходимости добавляют 5 М NaOH для повышения рН, если он слишком низкий.
8. Подключите вакуумную колбу для вакуума и поместите в колбу чистую керамическую воронку Бюхнера с фильтровальной бумагой. Включите вакуум и смочите фильтровальную бумагу с помощью передаточной пипетки, заполненной 4% раствором PFA.
9. Медленно вылейте 4% раствор PFA на фильтровальную бумагу, пока весь раствор не будет отфильтрован.
10. Переложите отфильтрованный раствор в чистую, защищенную от света емкость и храните при температуре 4 °C до использования (хранить не дольше 24 ч).

3. Транскардиальная перфузия «без насоса»

1. В вытяжной шкаф поместите рассекающий блок из пенополистирола в стеклянный лоток. Убедитесь, что рассекающий блок имеет 5-6 коротких игл для удержания мыши во время операции и 2 длинные иглы для поддержки перфузионной трубки.
2. Промыть перфузионный аппарат дистиллированной водой. Дайте всей воде стечь, прежде чем повесить перфузионный аппарат. Повесьте перфузионные флаконы на 1 м выше перфузированного животного (для мыши весом 20-30 г).
3. Приготовьте нестерильный раствор 1x PBS с использованием 10x PBS, разбавленный 18 мОм молекулярно-биологического класса H₂O.
4. Как показано на фиг.2, зажмите основную линию перфузионного аппарата с помощью гемостата. Зажмите линию PFA другим гемостатом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Окклюзия с несколькими гемостатами может быть необходима на линию, чтобы полностью предотвратить поток.
5. Заполните буферный контейнер 1x PBS при комнатной температуре.
6. Поместите шприцевой конец перфузионного аппарата в стакан для сбора буфера отходов и удаления гемостата, закупоривающего основную линию (рисунок 2, слева).
7. Позвольте PBS течь через линию, удаляя захваченный воздух, энергично постукивая по стенкам трубки.
8. После того, как весь воздух был удален из буферных и основных линий, закройте поток, поместив гемостат на основную линию.
9. Удалите гемостат из линии PFA и позвольте PBS течь ретроградным образом до бутылки PFA, выстукивая любые пузырьки в линии PFA (рисунок 2, середина). Продолжайте допускать PBS в линию PFA до тех пор, пока PBS не будет виден чуть выше отверстия бутылки. Закройте линию PFA гемостатом, чтобы остановить поток в бутылку PFA.
10. Подключите иглу для инфузии бабочки к перфузионному шприцу и промывайте PBS через линию (открыв гемостат основной линии), чтобы удалить пузырьки из перфузионного шприца. Закройте гемостат основной линии.
11. Убедитесь, что бутылка PBS теперь примерно на 1/3^полна PBS. При необходимости промывайте PBS через основную линию или заполняйте больше PBS в буферную бутылку до 1^{/3 ее} полной емкости.
12. После того, как все пузырьки будут удалены из PBS, PFA и основных линий, заполните бутылку PFA 4% раствором PFA при комнатной температуре до черной отметки на бутылке (примерно 1^/3 полной) (рисунок 2, справа).

Рисунок 2: Подготовка перфузионного аппарата к перфузионной хирургии. Во-первых, закройте линию гемостата PFA и откройте гемостат на линии PBS и основной линии. Заполните PBS и удалите пузырьки из строки PBS и основной строки. Затем заполните линию PFA PBS, открыв гемостат на линии PFA и закрыв гемостат на основной линии. Удалите пузырьки в линии PFA. Наконец, закройте гемостат на линии PFA, когда PBS достигнет открытия бутылки PFA. Наполните бутылку PFA на 1/3^полной PFA. Убедитесь, что уровень PBS в бутылке PBS заполнен на 1/3^и либо заполните PBS, либо сливите PBS, открыв основную линию гемостата, если это необходимо. Сокращения: PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор; PFA = параформальдегид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

13. Подготовьтесь к операции, не связанной с выживанием, очистив следующие инструменты водой с последующим 70% этанолом: большие ножницы, тонкие рассекающие ножницы, щипцы кожи, тонкие фенестрированные изогнутые щипцы.
14. Подготовьте анестезию, поместив беспыльные салфетки в коническую трубку объемом 50 мл. В вытяжном шкафу тщательно замочите бессылевые салфетки изофлураном и поместите открытую трубку вверх ногами в стакан емкостью 500 мл. Убедитесь, что на дне стакана нет жидкого изофлурана, и выбросьте любой жидкий изофлуран перед помещением мыши в стакан.
15. Поместите мышь в стакан и поместите полиэтиленовую пленку на отверстие, чтобы начать анестезию.
16. Вводят анестезию до тех пор, пока мышь не перестанет дышать (примерно через 1 мин и 30 с).
17. Когда дыхание прекратится, немедленно снимите мышь с стакана и замените колпачок на конической трубке объемом 50 мл.
18. Убедитесь, что мышь достаточно обезболена, используя рефлекс сжатия пальца ноги. Если животное недостаточно обезболено, вводят больше изофлурана, как описано в шаге 3.15.
19. Работая быстро, поместите мышь на блок из пенополистирола и прижмите лапы наружу, используя четыре короткие иглы (например, иглы для шприца 22 г).
20. Подтягивая кожу живота кожными щипцами, используйте большие ножницы, чтобы прорезать брюшную стенку. Следите за тем, чтобы органы брюшной полости не были разрезаны!
21. Продолжайте брюшной разрез преимущественно по направлению к печени. Отделите печень от передней брюшной стенки и продолжайте начальный разрез преимущественно по направлению к диафрагме. Остановите этот разрез примерно на 1 см ниже диафрагмы. Позаботьтесь о том, чтобы печень не была разрезана!
22. Продолжайте начальный разрез латерально вверх к правой и левой сторонам диафрагмы, чтобы сделать разрез в форме «Y» (рисунок 3A).
23. Когда разрез достигнет диафрагмы, сделайте отверстие в диафрагме с помощью тонких рассекающих ножниц и прорежьте ребра с правой стороны животного. Отрежьте ребра примерно наполовину к правой подмышечной впадине.
24. Сделайте аналогичный, но более длинный разрез через левую сторону диафрагмы почти до всей левой подмышечной впадины.
25. Отразите грудную стенку и прикрепите ее к блоку пенополистирола.
26. При необходимости рассейте жир вокруг сердца, чтобы обнажить левый желудочек. Определите левый желудочек на основе относительно более светлого цвета по сравнению с правым желудочком.
27. После идентификации левого желудочка удерживайте сердце устойчивым, используя легкое давление с помощью тонких изогнутых щипцов. Откройте гемостат основной линии, чтобы позволить PBS течь через иглу. Сразу проткните левый желудочек и убедитесь, что игла введена не более чем на 0,5 см в желудочек. При необходимости слегка отведите иглу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: О точном размещении иглы в левом желудочке свидетельствует ретроградный приток крови в игольчатую трубку. Важно следить за тем, чтобы игла не была слишком глубоко вставлена в желудочек. Это может привести к ретроградному потоку через легочные вены или прокалыванию межжелудочковой перегородки.
28. Положите трубку бабочки на X , изготовленную из пенополистирола, используя две большие иглы 18 G.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это очень важно, так как это позволит избежать движения иглы бабочки в сердце во время перфузии.
29. Определите нижнюю полую вену, когда она выходит из печени, и перерегите ее с помощью тонких рассекающих ножниц (рисунок 3B). Как вариант, открыть правое предсердие ножницами.
30. Немедленно откройте основную линию, чтобы начать перфузию PBS (рисунок 3C).
31. Убедитесь, что PBS сливается с блока пенополистирола в стеклянный лоток ниже. Если этого не происходит, отрегулируйте угол лотка или блока Styrofoak, чтобы обеспечить слив жидкостей в стеклянный лоток.
32. Продолжайте перфузию PBS до тех пор, пока жидкость, вытекающая из нижней полой вены, не останется без крови (примерно 3 мин).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Правильное размещение иглы в сердце приведет к визуальному очищению крови из печени, которая превратится из красного в соломенный цвет. Если этого не происходит, это может быть исправлено путем репозиционирования иглы инфузии в левом желудочке. Небольшой разрез может быть сделан в основании вентрального хвоста для оценки качества перфузии. Правильная перфузия приведет к прозрачному PBS, вытекающему из разреза хвостового основания.
33. Работая быстро, закройте линию PBS гемостатом и откройте линию PFA.
34. Дайте PFA перфусировать в течение нескольких минут, пока хвост не начнет скручиваться. Как только хвост начнет скручиваться, начните 50-минутный таймер. Если хвост не сворачивается после 5 мин перфузии PFA, начните 50-минутный таймер для перфузии PFA.
35. Контролируйте уровень PFA в бутылке непрерывно на протяжении всей перфузии, чтобы убедиться, что уровень не падает слишком низко. Заполните больше PFA во флаконе, если уровень падает ниже 2 см над крышкой бутылки.

Рисунок 3: Диаграмма, изображающая транскардиальную перфузию. (А) Брюшная стенка сначала разрезается, а затем два боковых направленных разреза в сторону подмышечной впадины, образующей «Y». (B) После проникновения в грудную полость и обнажения сердца игла пропускается в левый желудочек. Затем IVC или правое предсердие транссектируется, чтобы обеспечить дренаж перфусатов после того, как они циркулируют по организму. IVC режется лучше диафрагмы. (C) Порядок введения перфузатов. Аббревиатура = IVC = нижняя полая вена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

35. По истечении 50 мин засекают основную линию гемостатом и выводят иглу из левого желудочка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вся мышь жесткая в этот момент и теперь может быть помещена в маркированный контейнер с 4% PFA на ночь при 4 °C. На этом этапе можно рассеченить ткани ЦНС и поместить их индивидуально в фиксатор на ночь. В этой работе вся мышь помещается в фиксатор, так как это сокращает интервал между фиксацией и размещением при 4 °C. Это также позволяет избежать любого возможного механического искажения нервной ткани, которое может произойти, если животные предварительно рассечены до завершения ночной фиксации.

4. Рассечение ЦНС

1. Подготовьте следующие инструменты для рассечения водой с последующим 70% этанолом: ножницы, кожные щипцы, изогнутые фенестрированные щипцы, изогнутые тонкие щипцы, прямые тонкие щипцы, тонкие ножницы.
2. Пометьте четыре трубки на мышь следующим образом и заполните стерильной 20% сахарозой: Mouse ID, Brain 1, Mouse ID, Brain 2, Mouse ID, Lumbar, Mouse ID, Cervical.
3. Извлеките мышь из раствора PFA и смойте ее насухо бумажным полотенцем, чтобы удалить избыток PFA.
4. С помощью больших ножниц удалите головку мыши, разрезав шею.
5. Поместите корпус в раствор PFA. Сохраните голову, чтобы рассечь мозг от черепа.
6. Чтобы рассечь мозг, начните с отражения кожи черепа вперед, чтобы обнажить весь череп (рисунок 4A).
7. Сделайте неглубокий разрез в слуховом проходе, используя тонкие рассекающие ножницы, чтобы проникнуть в череп
8. Продолжайте этот разрез вдоль поперечной пазухи до тех пор, пока череп не будет разрезан между обоими слуховыми каналами.
9. Сделайте разрез перпендикулярно предыдущему разрезу вдоль продольной трещины вплоть до самой ростральной части черепа (примерно между глазами).
10. Используя фенестрированные изогнутые щипцы, отразите череп сбоку, чтобы обнажить передний мозг. Продолжайте удалять череп до тех пор, пока весь передний мозг, включая обонятельные луковицы, не будет открыт.
11. Начните рассечение каудальной области черепа, сделав разрез через затылочную кость и медленно продолжая этот срез в сторону большого отверстия.
12. Отразите два куска черепа сбоку, чтобы обнажить мозжечок и ствол мозга каудально (рисунок 4B).
13. Используйте ультратонкие изогнутые щипцы, чтобы отделить обонятельные луковицы от переднего черепа и начать отслаивать мозг от основания черепа, начиная с обонятельных луковиц.
14. Поскольку мозг отслояется от основания черепа, используйте ультратонкие щипцы, чтобы разрезать черепные нервы и позволить удалить мозг.
15. Продолжайте отслаивать мозг от основания черепа до тех пор, пока весь неповрежденный мозг не будет удален (рисунок 4C, D).
16. Разрежьте мозг пополам вдоль продольной трещины, чтобы отделить правое и левое полушария друг от друга (рисунок 4E,F).
17. Поместите одно полушарие в мозг 1 трубку, а второе полушарие в мозг 2 трубки. Храните эти трубки при температуре 4 °C до тех пор, пока полушария мозга не утонут (примерно на ночь).

Рисунок 4: Удаление неподвижного мозга. (А) Верхняя часть черепа. (B) Обнаженный мозг в черепе. (C) Изолированный мозг (дорсальный аспект). (D) Изолированный мозг (вентральный аспект). E) Левое полушарие (боковой аспект). F) Левое полушарие (медиальный аспект). Шкала стержней = 1 см (E и F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

18. Чтобы рассечь спинной мозг, удалите тело мыши из PFA и промойте его насухо.
19. Поместите мышь на рассекающий блок из пенополистирола в положении лежа и прижмите лапы к блоку с помощью четырех игл.
20. Начните рассечение, разрезав кожу по средней линии мыши от шеи до хвоста, чтобы обнажить всю заднюю сторону.
21. Отразите мышцы и фасции на спине, чтобы обнажить заднюю часть позвоночного столба.
22. Начиная с самых черепных позвонков, используйте тонкие рассекающие ножницы, чтобы разрезать пластинку, избегая спинного мозга (рисунок 5A).
23. Поместите ультратонкие изогнутые щипцы под пластинку и потяните вверх, чтобы сломать позвонки, чтобы обнажить спинной мозг (рисунок 5B).
24. Используйте изогнутые щипцы, чтобы отразить переломы позвонков и обнажить наиболее боковые области спинного мозга.
25. Продолжайте этот процесс для следующих позвонков, помещая ультратонкие изогнутые щипцы ниже ламины и разрывая позвонки. Продолжайте ломать позвонки до тех пор, пока весь шейный и грудной отдел позвоночника не будут обнажены (рисунок 5C).
26. Продолжают обнажать спинной мозг до конца поясничного отдела спинного мозга (рисунок 5D).
27. Используя острое лезвие бритвы, прорежьте весь путь через среднегрудный отдел спинного мозга.
28. Используя ультратонкие изогнутые щипцы, трансецируют спинномозговые нервы латерально от позвоночника и фасции спереди к спинному мозгу, чтобы медленно отделить шейный спинной мозг от позвоночного столба.
29. Продолжайте рассекать шейный спинной мозг до тех пор, пока он не освободится от позвонков (рисунок 5Е). Поместите шейно-среднегрудный отдел спинного мозга в трубку, помеченную шейным отделом. Храните эту трубку при температуре 4 °C до тех пор, пока шейный отдел спинного мозга не опустится (примерно на ночь).
30. Продолжайте ломать грудные позвонки вплоть до конского хвоста, как описано в шагах с 4.22 по 4.25. Когда конский хвост обнажается, используйте острое лезвие бритвы, чтобы разрезать спинной мозг на 1 см ниже поясничного отдела спинного мозга (рисунок 5F).
31. Рассекните поясничный спинной мозг от позвонков, как описано в шагах 4.26-4.27. Поместите пояснично-среднюю часть спинного мозга конского хвоста в трубку, помеченную поясничной. Храните эту трубку при температуре 4 °C до тех пор, пока поясничный отдел спинного мозга не опустится (примерно на ночь).
32. Когда все ткани утонут в 20% сахарозы, перенесите их в меченые пробирки с 30% сахарозой, пока они не утонут или в течение 3 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ткани позвоночника часто не опускаются на 30% сахарозы.

Рисунок 5: Удаление неподвижных сегментов спинного мозга. (А) Начальный врез в пластинку шейных позвонков. (B) Установка изогнутых щипцов для перелома отдельных позвонков. (C) Открытый шейный отдел позвоночника. (D) Обнаженный шейный, грудной и поясничный отделы позвоночника. (E) Удаление шейного отдела позвоночника после перерезания спинномозговых нервов. (F) Разрезание крестцового отдела позвоночника. (G) Изолированный шейный отдел позвоночника. (H) Изолированный поясничный отдел позвоночника. Шкала стержней = 1 см (G и H). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

5. Встраивание OCT и хранение тканей

1. Для каждой мыши пометьте четыре криомольда прямоугольной формы: Идентификатор мыши, Правое полушарие, Дата встраивания; Идентификатор мыши, левое полушарие, дата встраивания; Идентификатор мыши, Шейка матки, Дата встраивания; Идентификатор мыши, поясница, дата встраивания.
2. Установите контейнер из пенополистирола и повесьте металлическую чашку над контейнером.
3. Заполните контейнер из пенополистирола жидким азотом примерно наполовину. Наполните металлическую чашку свежим 2-метилбутаном примерно наполовину.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 2-метилбутан токсичен, очень летучий и легковоспламеняющийся. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать вдыхания путем выполнения последующих шагов в вытяжном шкафу и вдали от источников горения.
4. Медленно опустите металлическую чашку в жидкий азот и избегайте брызг жидкого азота в металлическую чашку.
5. Дайте 2-метилбутану начать замерзать. Пока 2-метилбутан замерзает, возьмите нужную ткань из 30% раствора сахарозы и промойте ее насухо на беспыльной салфетке.
6. Поместите ткань в криомольд с ростральной областью, направленной в сторону верхней (немаркированной) части формы.
7. Экономно заливайте ткань в криомольде оптимальной температуры реза при температуре встраивания среды (ОКТ), используя только достаточно, чтобы полностью покрыть ткань. Избегайте использования чрезмерного центра развертывания Office, так как это может привести к растрескиванию. Удалите все пузырьки из центра развертывания Office.
8. Когда замороженный 2-метилбутан полностью покроет внутреннюю поверхность металлической чашки, полностью погружают криомольд в вышележащую жидкую фазу 2-метилбутана на 12 с. Через 12 секунд поместите криомоль для слива в помеченный квадрат из алюминиевой фольги и оберните весь криомольд. Немедленно поместите обернутый криомольд на сухой лед и избегайте оттаивания. Убедитесь, что замороженный OCT/криомольд всегда покрыт сухим льдом.
9. Повторите шаги с 5.6 по 5.8 для всех тканей. Поместите ткань для одной мыши в запечатанный небольшой пластиковый пакет, а затем в криобезопасный, герметичный контейнер. Храните этот контейнер в морозильной камере с температурой -80 °C до тех пор, пока не будут разрезаны секции.

6. Криосекционирование

1. Перед криосечением убедитесь, что температура криостатной камеры и головка образца установлены на соответствующие настройки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Температура камеры -20 °C, температура головки образца -20 °C и толщина сечения 30 мкм используются для резки срезов головного мозга. Для резки секций спинного мозга используется температура камеры -23 °C, температура головки образца -30 °C и толщина сечения 30 мкм. Важно отметить, что настройки криостата (особенно температура головки образца) должны быть скорректированы во время секционирования для решения проблем с качеством тканей. Как правило, температура головки образца понижается для коррекции для размазывания тканей. И наоборот, температура головки образца увеличивается, чтобы исправить чрезмерное скручивание тканей.
2. Извлеките нужный блок OCT из морозильной камеры с температурой -80 °C и поместите неупакованный блок криомольда/OCT в криостатную камеру.
3. Дайте блоку OCT акклиматизироваться к температуре камеры в течение 30 минут.
4. Очистите патрон с 70% этанолом и протрите его насухо беспыльной салфеткой. Поместите очищенный патрон в криостатную камеру и сделайте на патроне круг OCT размером с монету. Дайте ОКТ замерзнуть (примерно 1-2 мин).
5. Когда OCT замерзнет, поместите точку свежего OCT размером с горошину на патрон и немедленно поместите тканевый блок OCT на патрон. Убедитесь, что ткань идеально перпендикулярна патрону, прежде чем OCT полностью замерзнет.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, самая ростральная область мозга расположена к патрону так, что сечение начинается с каудального конца. Для спинного мозга, как правило, наибольшая каудальная область помещается на патрон так, что сечение начинается с рострального конца.
6. Когда oct затвердеет, поместите больше OCT вокруг основания блока OCT, чтобы действовать как структурная опора во время секционирования. Когда эта опора немного затвердеет, поместите патрон на головку образца и дайте блоку OCT достичь температуры головки образца в течение 30 минут.
7. Поместите микротомное лезвие в держатель лезвия и очистите антикатальную пластину. Отрегулируйте расстояние антиката, чтобы убедиться, что ткань проходит прямо под пластиной во время сечения. Для получения дополнительной информации о правильном расположении противоролловой пластины обратитесь к руководству по криостату.
8. После того, как блок OCT акклиматизировался к температуре головки образца, начните обрезку блока OCT до тех пор, пока ткань не будет достигнута. Когда ткань будет видна, переключитесь с обрезки на секционирование и начните резку 30 мкм секций. Отодвиньте в сторону противокатанную пластину и, используя предметное стекло микроскопа, поднимите секцию.
9. Продолжайте резать и собирать срезы до тех пор, пока не будут удовлетворены анатомическим расположением срезов или вся ткань не будет разрезана. Поместите горки сушиться при комнатной температуре в течение 1-3 дней. После высыхания поместите слайды в коробку для слайдов и поместите эту коробку в запечатанный пластиковый пакет. Пометьте пакет идентификатором мыши и информацией о ткани перед размещением слайдов в морозильной камере с температурой -80 °C.

7. Иммунофлуоресцентное окрашивание

1. Размораживать горки в течение 1 ч при комнатной температуре.
2. Поместите слайды в горизонтальную слайд-банку и мойте секции 3 раза в PBS в течение 10 минут каждую стирку при комнатной температуре на шейкере.
3. Подготовьте блокирующий буфер (2% BSA + 0,3% Triton-X-100 в 1x PBS). Используйте примерно 1 мл на слайд.
4. Создайте увлажненную камеру, добавив воду на дно. Уложите горки лицевой стороной вверх горизонтально и не дайте им высохнуть. Добавляйте 1 мл блокирующего буфера к каждому слайду и инкубируйте в течение не менее 1 ч при комнатной температуре.
5. Готовят раствор первичного антитела путем разведения первичного антитела в буфере антител (0,7% BSA + 0,3% Triton-X-100 в 1x PBS).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для фосфорилированного антитела α-синуклеина использовался коэффициент разведения 1:500.
6. Добавляют 200-300 мкл раствора первичного антитела на слайд. Накройте крышкой, чтобы диспергировать антитело и инкубировать при 4 °C в течение ночи.
7. На следующий день извлеките слайды из увлажненной камеры и поместите их в вертикальную банку Coplin, наполненную 1x PBS, чтобы крышка отвалилась. Делайте это для каждого слайда индивидуально и следите за тем, чтобы не потревожить участок ткани при удалении крышки.
8. Поместите слайды в горизонтальную слайд-банку и мойте секции 3 раза в PBS в течение 10 минут каждую стирку при комнатной температуре на шейкере.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие шаги должны быть выполнены с выключенным светом, чтобы избежать фотоотбеливания флуорофора!
9. Готовят раствор вторичного антитела путем разбавления вторичного антитела в буфере антител.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для обнаружения фосфорилированного α-синуклеина использовали анти-кроликов вторичный конъюгированный с Alexa 488 с коэффициентом разбавления 1:500 в буфере антител (0,7% BSA + 0,3% Triton-X-100 в 1x PBS).
10. Уложите слайды горизонтально в увлажненную камеру и добавьте 200-300 мкл раствора вторичных антител на слайд. Накройте крышкой, чтобы диспергировать антитело. Инкубировать при комнатной температуре не менее 2 ч.
11. Извлеките слайды из увлажненной камеры и поместите их в вертикальную банку Coplin, наполненную 1x PBS, чтобы крышка отвалилась. Делайте это для каждого слайда индивидуально и следите за тем, чтобы не потревожить участок ткани при удалении крышки.
12. Поместите слайды в горизонтальную слайд-банку и мойте секции 3 раза в PBS в течение 10 минут каждую стирку при комнатной температуре на шейкере.
13. Высушите боковые части горок на полотенце и стряхните лишний PBS.
14. Добавьте 3 капли монтажного носителя на каждый слайд. Добавьте крышку и осторожно выталкивайте пузырьки парой щипцов, нажимая на крышку перед визуализацией с помощью конфокальной микроскопии.

Результаты

О качественной перфузии свидетельствует отсутствие крови в печени, спинном мозге и глубоких структурах ЦНС (рисунок 4C и рисунок 5G,H). Задержка крови ниже твердой мозговой оболочки (например, в венозных пазухах) или между твердой мозговой оболочкой и черепом не была проблематичной, поскольку эта кровь не находится в паренхиме мозга. Кровь, показанная на рисунке 4А, расположена между черепом и твердым мозговым веществом и, следовательно, не является проблематичной или наводящей на мысль о некачественной перфузии. Свежий головной и спинной мозг довольно мягкие и легко повреждаются во время обработки. Адекватно закрепленные ткани, по сравнению с ними, твердые. Для оценки качества тканей и сохранения морфологии тканей этим перфузионным методом данная работа демонстрирует обнаружение фосфорилированного α-синуклеина в среднем мозге и поясничном спинном мозге 15-месячной мыши и 7-месячной мыши, экспрессирующей человеческий A53T α-синуклеин (рисунок 6).

Мутация A53T перепредставлена у пациентов с аутосомно-доминантной болезнью Паркинсона (БП). Кроме того, человеческий α-синуклеин с мутацией A53T может повторять многие особенности БП человека при экспрессии у мышей ^6,7. Было показано, что фосфорилирование α-синуклеина в остатке серина 129 in vivo и in vitro индуцирует агрегацию α-синуклеина⁸. Тела Леви являются классическим гистологическим открытием, присутствующим у пациентов с БП или деменцией тела Леви⁹. Большая часть α-синуклеина, присутствующего в телах Леви, фосфорилируется при серине 129^10,11. В результате накопление фосфорилированного α-синуклеина используется как маркер гистологической тяжести патологии БП. Настоящее исследование показывает, что фосфорилированный α-синуклеин накапливается на значительно более высоком уровне у 15,5-месячных симптоматических мышей по сравнению с 7-месячными бессимптомными мышами, экспрессирующими человеческий A53T α-синуклеин. Это согласуется с сообщениями, описывающими обогащение цитопатологии в передних рогах спинного мозга и среднем мозге этих мышей. ⁶ Из этого делается вывод, что описанный здесь упрощенный метод перфузии обеспечивает качественную фиксацию тканей ЦНС для последующей гистологической характеристики.

Рисунок 6: Этикетка для фосфорилированного α-синуклеина в тканях среднего мозга и поясничного отдела спинного мозга из мышиной модели болезни Паркинсона. Старую (15,5-месячную) парализованную мышь на конечной стадии сравнивают с 7-месячной здоровой мышью. Обе мыши экспрессируют склонный к неправильному сворачиванию мутантный вариант (A53T) человеческого α-синуклеина, который вызывает патологию, подобную болезни Паркинсона. Шкала стержней = 100 мкм (верхние панели) и 50 мкм (нижние панели). Аббревиатура: α syn-A53T = A53T мутант α-синуклеина; DAPI = 4',6-диамидин-2-фенилиндол; PS129 = фосфорилированный серин 129 α-синуклеина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

В этой работе описываются критические шаги для выполнения транскардиальной перфузии. При построении перфузионного аппарата (протокол раздела 1) важно использовать трубки, которые достаточно гибкие, чтобы быть полностью закупоренным гемостатом. Некоторые жесткие трубки могут быть недостаточно закрыты гемостатом и могут по-прежнему позволять PFA просачиваться в основную линию во время начальной перфузии PBS. При приготовлении 4% раствора PFA важно убедиться, что рН физиологичен (7,4). Поскольку приготовление раствора PFA включает в себя нагрев его до 65 °C, раствор должен быть охлажден до 25 °C до измерения pH, поскольку это температура, при которой pH калибруется на измерителе.

При проведении начального разреза в брюшную полость необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать разрыва органов брюшной полости (протокол раздела 2). При рассечении преимущественно по направлению к диафрагме важно избегать разрыва печени, так как печень обычно прилипает к передней брюшной стенке. Чтобы преодолеть это, печень осторожно и тупо рассекают от передней стенки, прежде чем продолжить разрез в сторону диафрагмы. При проникновении в грудную полость через диафрагму важно избегать рваных ран сердца, магистральных сосудов, легких. Чтобы этого избежать, кончик ножниц держат поверхностно и под острым углом с грудной клеткой.

Первоначальное рассечение для обнажения сердца занимает примерно 2 мин от начального разреза. Ожидается, что за это время на кончик иглы бабочки поступило немного воздуха. Введение этого воздуха в циркуляцию мыши даст некачественную перфузию. Поэтому очень важно, чтобы основная линия была открыта, и PBS промывали через иглу непосредственно перед канюляцией сердца, чтобы удалить пузырьки воздуха. В идеале сердце канюлируется, в то время как небольшая струйка PBS течет через кончик иглы, чтобы обеспечить полное отсутствие воздуха при прокалывании РН.

Когда игла входит в ЛЖ, она не должна уходить так глубоко, чтобы вводить наконечник иглы в правый желудочек (RV). Размещение иглы либо в RV, либо за пределами митрального клапана приведет к немедленной «инфляции» легких при начале перфузии. Это нежелательно, и иглу необходимо слегка отобрать, чтобы обеспечить размещение РН. Если игла размещена правильно, легкие останутся плоскими на протяжении всей перфузии. Когда начинается перфузия, иногда наблюдается, что из открытой пасти животного выходит прозрачная жидкость. Обычно это происходит из-за слишком высокого давления перфузии или из-за неправильного размещения иглы в сердце. Авторы предполагают, что повышенное перфузионное давление приводит к экстравазации перфузата из артериолярного капиллярного русла и ретроградному потоку PBS через бронхиальное дерево в пищевод и ротовую полость.

Перфузионное давление должно быть снижено либо путем снижения уровня PBS в бутылке PBS, либо путем снижения высоты бутылки PBS. В качестве альтернативы, если игла помещена слишком глубоко в левый желудочек, она может пройти через митральный клапан и доставить перфусат в левое предсердие. Это может привести к ретроградному потоку через легочные вены и экстравазации перфузата в артериолы, как описано выше. Тщательный клиренс крови из кровеносной системы с PBS особенно важен, чтобы избежать фиксаторно-индуцированного сшивания компонентов крови, приводящего к окклюзии сосудов при последующей фиксирующей перфузии. Клиренс эффективно оценивается изменением цвета печени и потока PBS из разреза в вентральном основании хвоста. Клиренс крови обычно завершается к 3 мин перфузии с PBS; однако, если визуальные признаки клиренса возникают в более короткие сроки, то фиксатор вводится раньше, чем через 3 мин. Более длительное время зазора не рекомендуется, так как отсроченная фиксирующая перфузия приводит к артефактам в тонкой структуре^{ЦНС 1}.

Когда вводится PFA, важно контролировать уровень раствора PFA во флаконе PFA. Наполните флакон PFA, если уровень PFA падает менее чем на 4 см выше горлышка флакона PFA. После того, как перфузия была завершена, перфузионный аппарат необходимо тщательно промыть дистиллированной водой. Это важно, поскольку остаточный PFA в основной линии загрязнит первоначальную перфузию PBS PFA и приведет к некачественной перфузии. Наконец, иглы бабочки 25 г обычно рекомендуются для взрослых мышей среднего размера в диапазоне 20-30 г. Тем не менее, большим или меньшим мышам могут потребоваться немного большие или меньшие калибровочные иглы в дополнение к регулировке фиксирующих бутылок для обеспечения оптимальной скорости потока.

Для рассечения ЦНС и встраивания ОКТ (раздел протокола 3) ткани спинного мозга обычно не полностью погружаются в 30% сахарозы. Поэтому эти ткани оставляют в сахарозе на 2 дня, а затем встраивают в ОКТ, независимо от того, тонут они или нет. При замораживании тканей в ОКТ возможно, что некоторые ткани могут треснуть при помещении в охлажденный 2-метилбутан. Это чаще встречается с мозгом и обычно происходит, когда слишком много ОКТ помещается на ткань. Чтобы избежать этого, поместите только достаточно ОКТ, чтобы покрыть поверхности тканей до немедленного замораживания. В некоторых протоколах взлом встречается реже, несмотря на полное погружение в OCT. Обычно это связано с более медленным методом замораживания, например, при использовании 2-метилбутана, охлаждаемого сухим льдом, или при размещении криомольда непосредственно на блоке сухого льда. Жидко-азотно-охлажденный 2-метилбутан является предпочтительным в этой работе, поскольку скорость замораживания значительно быстрее и может лучше сохранять морфологию тканей, чем более медленные методы замораживания.

При криосекции ткани (раздел протокола 4) важно избегать многократных циклов замораживания-оттаивания. Поэтому оптимально вырезать все участки из одного блока OCT, чтобы получить определенную область мозга для анализа вместо размораживания и повторного замораживания выбранных областей. Если это нежизнеспособно, после получения нескольких секций пользователи могут повторно заморозить и хранить блоки OCT в глубокой морозильной камере -80 °C еще 1-2 раза для будущего использования.

Основные преимущества этого метода по сравнению с более традиционным насосом или подачей перфусата под давлением воздуха заключаются в следующем: (1) низкая стоимость и доступность перфузионного аппарата. (2) Пользователям не нужно вручную поддерживать давление в перфузионном аппарате на протяжении всей перфузии. (3) Более низкое и более постоянное перфузионное давление, чем другие недорогие альтернативы перфузии, такие как доставка шприцем. Используя уравнение Бернулли, подсчитывается, что перфузионный аппарат с гравитационной подачей, построенный здесь, будет поддерживать перфузионное давление примерно 73 мм рт. ст., когда бутылки с перфусатом размещаются на высоте 1 м относительно иглы. Учитывая, что это значительно ниже систолического артериального давления этих животных, это перфузионное давление, вероятно, достаточно низкое, чтобы избежать разрыва сосудов¹².

До сих пор авторы успешно использовали эту перфузионную систему для обнаружения присутствия фосфорилированного α-синуклеина в мышиной модели болезни Паркинсона. В течение этого времени не было обнаружено значительных ограничений с этим методом перфузии, которые не присутствуют при методе доставки перфузии насоса. Основным ограничением этого метода является трудоемкий характер перфузии по сравнению с фиксацией капли. Этот метод предпочтительнее для отбрасывания фиксации, так как перфузия приводит к более глубокому проникновению фиксатора в структуры ЦНС. Вторым ограничением этой техники является то, что она требует некоторых хирургических навыков для выполнения, так как сердце должно быть быстро каннулировано после входа в грудную полость. Тем не менее, с опытом, обученные пользователи могут регулярно канулировать сердце в течение 1 минуты после первоначального разреза в брюшную полость.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
2-Метилбутан (сертифицированный ACS), Fisher Chemical	Fisher Scientific	03551-4
Andwin Scientific Tissue-Tek O.C.T Compound	Fisher Scientific	NC1029572
Artman Instruments 4,5-дюймовые прямые пружинные ножницы Castroveijo Amazon		B0752XHK2X	тонкие ножницы"
BD General Use and PrecisionGlide Иглы для подкожных инъекций, 18 г	Fisher Scientific	14-826-5D
BD Иглы для подкожных инъекций общего назначения и PrecisionGlide, 22 г	Fisher Scientific	14-826B
Шприцевые фильтры Corning PES	Fisher	Scientific 09-754-29
Cytiva HyClone Фосфат буферизованный физиологический раствор (PBS), 10x	Fisher Scientific	SH30258
Falcon 50 мл конические центрифужные пробирки	Fisher Scientific	14-432-22
Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) Порошок без протеазы	Fisher Scientific	BP9703100
Fisherbrand Изогнутые щипцы общего назначения Fisher Scientific		16-100-110"	изогнутые фенестрированные щипцы"
Fisherbrand изогнутые очень тонкие прецизионные щипцы Fisher	Scientific	16-100-123	" изогнутые тонкие щипцы"
Fisherbrand Одноразовые градуированные переводные пипетки	Fisher	Scientific 13-711-9AM
Fisherbrand Высокоточные прямые конические ультратонкие пинцеты/щипцы	Fisher	Scientific 12-000-122	"Прямые тонкие щипцы"
Микрошпатели Fisherbrand с закругленными концами Fisher	Scientific	21-401-5
Фарфоровые воронки Бюхнера Fisherbrand с фиксированными перфорированными пластинами	Fisher Scientific	FB966J
Защитное стекло Fisherbrand Premium, 24 x 50	Fisher Scientific	12-548-5M
Premium Тканевые щипцы Fisherbrand 1X2 зубья 5 дюймов. Немецкая сталь	Fisher Scientific	13-820-074	"кожные щипцы"
Многоразовые толстостенные фильтрующие колбы Fisher	Scientific	FB3002000
Fisherbrand стандартные препарирующие ножницы Fisher		Scientific 08-951-20	"Ножницы для препарирования"
Стерильные шприцы Fisherbrand для одноразового использования	Fisher Scientific	14-955-464
Гемостаты с прямой фиксацией	Fisherbrand Fisher	Scientific 16-100-115
Предметные стекла микроскопа Fisherbrand Superfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-15
Комплекты виниловых трубок и соединителей Fisherbrand, 1/4 дюйма.	Fisher Scientific	14-174-1C
Fisherbrand Влажная усиленная качественная фильтровальная бумага Круги	Fisher Scientific	09-790-12F
Fisherbrand Y-образный соединитель с 1/4 дюйма. ID - Полипропилен - QC	Fisher Scientific	01-000-686
Garvey Economy Однолезвийное лезвие для резки	Amazon	B001GXFAEQ
козы против кролика IgG (H+L) вторичное антитело, DyLight 488	ThermoFisher Scientific	35552
Идеальный зажим Stant Зажимы высокого давления	Fisher Scientific	14-198-5A	"хомуты для шланга"
IMEB, Inc Sakura Accu-Edge Низкопрофильные лезвия для микротомов, диспоизируемые	Fisher Scientific	NC9822467
Kawasumi 25 калибра Стандартный набор для сбора крылатой крови	Fisher	Scientific 22-010-137	"Игла-бабочка"
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Деликатные салфетки, 1-слойный	Fisher Scientific	06-666
Молекулярные зонды ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI	Fisher Scientific	P36962
Nalgene Узкогорлые Право на знание Бутылки для мытья ПВД	ThermoFisher Scientific	2425-0506	"Буферные бутылки"
PAP pen abcam		ab2601
Параформальдегид Гранулярная	электронная микроскопия системы	19210
Pyrex Glass Сушка Посуда, 34,9 x 24,9 x 6 см	Fisher Scientific	15-242D
Рекомбинантный антиальфа-синуклеин (фосфо S129) антитело [EP1536Y]	abcam	ab51253
Гидроксид натрия	Sigma-Aldrich	221465-2,5 кг
Чашка для питья из нержавеющей стали 18 унций	амазонка	B0039PPO9U
сахароза для молекулярной биологии CAS: 57-50-1	US Biological	S8010
Triton X-100	Us Biological	T8655
Vetone Fluriso Isoflurane USP	MWI	Ветеринарный 502017