Местное применение Биоанализ для количественной оценки токсичности инсектицидов для комаров и плодовых мух

Комары несут ответственность за более чем 700 000 смертей каждый год из-за болезней, которые они передают людям, причем более половины этих смертей вызваны только малярией¹. Основным профилактическим методом против передачи малярии и других трансмиссивных болезней является использование инсектицидов, часто в форме инсектицидных сеток длительного пользования или остаточного распыления внутри помещений². Однако устойчивость к инсектицидам широко распространена среди комаров и других насекомых-переносчиков, а также сельскохозяйственных вредителей ^3,4. Для эффективного управления сопротивлением эпиднадзор имеет ключевое значение⁵. Для этого необходимы высокоточные и высокопроизводительные методы обнаружения сопротивления. В настоящее время наиболее распространенными инструментами эпиднадзора за устойчивостью комаров к инсектицидам являются тест⁶ в трубке ВОЗ и биоанализ из бутылок CDC⁷. Для плодовых мушек метод остаточного контактного применения (аналогичный биоанализу бутылки CDC) представляет собой широко используемый биоанализ инсектицидов ^8,9,10. Тем не менее, вариабельность данных этих методов, как правило, высока, причем измерения одного и того же лабораторного штамма комаров варьируются от ~ 20-70% смертности в анализах бутылок CDC и 0-50% в пробных тестах ВОЗ при воздействии сублетальных доз¹¹. Такая вариация удивительна, поскольку ожидается, что ограниченная генетическая изменчивость большинства лабораторных штаммов приведет к ограниченной изменчивости восприимчивости к инсектицидам в популяции. Тем не менее, по-прежнему наблюдается высокий уровень вариаций в результатах биоанализа.

Потенциальные источники этой изменчивости могут быть результатом гетерогенного воздействия инсектицидов между образцами в рамках биоанализа из-за косвенного воздействия инсектицидов через поверхность, гетерогенного воздействия окружающей среды, нормальной биологической изменчивости между особями одного и того же генотипа и изменения массы образцов одной и той же популяции^12. . Редко используемым методом с более высокой воспроизводимостью является топический прикладной биоанализ. В этом анализе инсектицид наносится непосредственно на каждое насекомое^13,14, устраняя фактор гетерогенного воздействия различных образцов в пределах одного и того же анализа. Однако из-за медленной пропускной способности этого метода он обычно не используется в качестве инструмента наблюдения за восприимчивостью к инсектицидам для популяций комаров. В данной работе представлен модифицированный протокол для местного применения биоанализа, который позволяет проводить воздействия с более высокой пропускной способностью, а также корректирует изменение массы насекомых, параметр, который коррелирует с изменениями восприимчивости к инсектицидам¹². Снижение уровня шума и связанных с массой колебаний данных о смертности в результате переменного воздействия инсектицидов позволило бы обеспечить более точный технический эпиднадзор за устойчивостью ^11,15. Такие данные могут быть использованы для более точного связывания фенотипической резистентности с генетическими маркерами, параметрами приспособленности и/или векторной компетентностью. Кроме того, мы демонстрируем, как этот анализ может быть легко адаптирован к другим видам насекомых, используя биоанализ местного применения на плодовых мухах, видах насекомых с меньшим телом.

Основным ограничением вышеупомянутых применений остаточного контакта является то, что воздействие инсектицидов может варьироваться от образца к образцу в пределах одного и того же анализа. В случае биоанализов в бутылках CDC и контактного метода воздействие инсектицидов может варьироваться между репликами одного и того же анализа. Насекомые подвергаются воздействию инсектицида, который либо распределяется на внутренней стороне стеклянной бутылки (метод биоанализа и контакта с бутылками CDC), либо на пропитанной бумаге (тест пробирки ВОЗ). Концентрация инсектицида на обеих поверхностях (стеклянной и бумажной) известна и предопределена путем скрининга различных видов известных генотипов. Однако количество, потенциально поглощаемое насекомым, может сильно варьироваться в зависимости от используемой поверхности, компонентов смеси инсектицидов и того, насколько однородно инсектицид распределен по поверхностному материалу^16,17. В биоанализе бутылки CDC инсектицидное покрытие на внутренней стороне бутылки зависит от процедур, используемых каждой лабораторией и пользователем. В пробирке ВОЗ обработанные инсектицидами бумаги производятся централизованно и, таким образом, скорее всего, довольно однородны в разных лабораториях. Однако в пробке ВОЗ экспозиционная трубка позволяет образцам приземляться и опираться на металлическую сетку, не подвергающуюся воздействию инсектицидов, что приводит к потенциальному воздействию гетерогенных инсектицидов среди образцов в рамках каждого теста. Фактическое количество инсектицида, собранного и поглощенного образцами с помощью каждого метода, еще предстоит изучить¹⁸.

Кроме того, биоанализ бутылки CDC, тест ВОЗ в пробирке и контактный метод чаще всего используются в качестве пороговых анализов, проверяющих только одну заранее определенную концентрацию инсектицида. Этот подход может точно обнаружить наличие резистентности и полезен для наблюдения за устойчивостью (особенно когда устойчивость распространяется). Тем не менее, пороговые анализы не могут количественно оценить силу сопротивления, что может быть более прогностическим для эффективности инструментов вмешательства. Если с этими методами используются множественные концентрации инсектицидов, то они могут быть использованы в качестве анализов интенсивности. Анализ интенсивности для биоанализа в бутылке CDC и теста ВОЗ в пробирке был введен путем тестирования в 5 и 10 раз больше предопределенных дискриминирующих дозировок для устранения этого разрыва в эпиднадзоре ^6,19. Обеспечивая большую способность дифференцировать резистентные популяции, 3-5 (предопределенные) дозы обеспечивают ограниченное разрешение для расчета летальных концентраций. Кроме того, в таких анализах используются комары различных размеров. Тем не менее, массу важно измерить, поскольку более крупным образцам может потребоваться более высокая доза для уничтожения, поскольку эффективная доза на единицу массы будет намного ниже, чем у меньшего организма¹². Расчет релятивизированной массы смертельной дозы (количество инсектицида на массу насекомого) был бы более полезным показателем, чем более распространенная смертельная концентрация (например, количество инсектицида на площадь поверхности), поскольку он учитывает различия массы насекомых между полами, популяциями и генотипами. Такие данные помогут заполнить пробел между генотипической и фенотипической устойчивостью в лаборатории и на местах, а также могут обеспечить простой способ расчета необходимой концентрации для обработки популяции насекомых известной средней массы.

Использование массово-релятивизированных смертельных доз, которые убивают 50% образцов (LD₅₀), также включает в себя несколько других преимуществ. Оценка токсичности конкретного соединения в мг/кг (= нг/мг) является стандартной в токсикологии человека и ветеринарии¹⁴, а значения LD₅₀ указаны в паспортах безопасности материалов. Смертельные дозы также позволяют напрямую сравнивать токсичность различных химических веществ по отношению к определенному виду или одного и того же химического вещества к различным видам²⁰, а также высококачественную оценку новых инсектицидов и химических веществ¹³. Кроме того, LD₅₀ может обеспечить более значимые и точные соотношения резистентности, чем те, которые получены из результатов смертности от диагностических доз, что может привести к переоценке уровня резистентности, присутствующего в популяции. Таким образом, этот анализ будет подходить для рутинных программ эпиднадзора, обеспечивая более строгий мониторинг резистентности на основе массовых релятивизированных смертельных доз, полученных из большего количества образцов, чем рекомендовано для других биоанализов²¹.

Метод местного применения был использован в эпиднадзоре за восприимчивостью к инсектицидам у комаров и мух в качестве альтернативы стандартным биоанализам на восприимчивость к инсектицидам, когда устойчивость уже известна или подозревается^22,23, а также для наблюдения за некоторыми насекомыми-вредителями²⁴ для более точной оценки профилей устойчивости и внутренней токсичности инсектицидов²¹ . При местном применении биоанализа инсектицид наносится на каждый организм, что приводит к минимальным изменениям в воздействии инсектицидов. В настоящем документе представлен слегка адаптированный и улучшенный метод, который позволяет применять инсектицидное воздействие на большое количество насекомых в течение короткого периода времени, а также контролировать массу насекомых²². Этот высокопроизводительный метод с хорошими уровнями воспроизводимости может стать полезным дополнительным инструментом для рутинного эпиднадзора за восприимчивостью к инсектицидам.

ПРИМЕЧАНИЕ: Инсектициды могут вызывать опасность для человека, животных и окружающей среды²⁵. Осторожность, обучение и средства индивидуальной защиты настоятельно рекомендуются. Обязательно следуйте паспортам безопасности материалов для всех используемых инсектицидов и растворителей.

1. Задние образцы

1. Задние 3-5-дневные взрослые комары.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В приведенном ниже протоколе отражены условия выращивания Aedes aegypti в строгом соответствии с руководящими принципами²⁶ Продовольственной и сельскохозяйственной организации Объединенных Наций.
   1. Задние комары всех стадий жизни при 27 ± 1 °C и 75 ± 5% относительной влажности при 12:12 ч при светлом и темном круговороте.
   2. Вылупляйте яйца комаров, погружая их в деионизированную воду и добавляя дрожжи²⁶, или поместите погруженные яйца в вакуумную камеру на 30 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оба метода уменьшают содержание кислорода в воде и увеличивают вылупление²⁷.
   3. Кормите только что вылупившихся личинок рыбной пищей (или эквивалентной диетой, такой как земляной кошачий киббл) в лотках и поддерживайте плотность личинок как можно более одинаковой между лотками, поскольку плотность личинок влияет на развитие¹² (например, 200-250 личинок на лоток, содержащий в общей сложности 1,5 л воды).
   4. Кормите личинок через день до тех пор, пока они не достигнут стадии куколки (примерно 7-10 дней), увеличивая количество пищи по мере необходимости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Когда их кормят слишком мало, рост личинок будет замедлен, и личинки могут есть друг друга. При слишком большом кормлении личинки могут погибнуть, в результате чего вода загрязнится.
   5. Как только куколки разовьются, ежедневно переносите их в миску для воды во взрослых клетках от комаров и введите 10% раствор сахарозы ad libitum.
   6. Запишите первый день появления взрослых особей. Удалите оставшихся куколок из клетки через 2 дня после начала всходов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Самцы комаров появляются быстрее. Обратите внимание на появление самцов и самок отдельно и убедитесь, что для каждого теста доступно достаточное количество самцов и самок.
   7. Подождите 3 дня после удаления куколок, чтобы достичь 3-5-дневных комаров для тестирования.
2. Задние плодовые мухи (свободно следуя протоколам Цюрихского университета²⁸).
   1. Задние штаммы дрозофилы в стандартных бутылках при 23 ± 1 ° C и 60 ± относительной влажности 5% при светлом и темном цикле 12:12 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Бутылки с запасами дрозофилы должны содержать 75 мл стандартной мучной среды, которую сначала выливают в виде жидкости на дно бутылок, а затем дают затвердеть в течение ночи.
   2. Перемещайте колонии в новые бутылки со свежими продуктами каждые две недели, чтобы предотвратить перенаселение и рост плесени. Для этого сбивайте мух с помощью ручного дозатора углекислого газа (CO₂), перекладывайте обезболенных мух в бумагу для взвешивания на пакете со льдом или охлаждающем столе и смачивайте мух в свежую бутылку с бульоном, используя кисть с мелким наконечником. Обязательно держите бутылки на боках во время этого процесса, чтобы мухи не упали в пищу и не утонули.

2. Подготовка составов инсектицидов с использованием гравиметрического подхода

1. Сделайте первый запасной раствор в соответствии с гравиметрическим подходом, используя аналитическую шкалу с точностью 0,1 мг внутри вытяжного шкафа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гравиметрический подход использует массу для измерения количества добавленных инсектицидов и растворителей. Стандартная практика (объемный подход) потребует аналитической шкалы для измерения количества (твердого) инсектицида, добавляемого при приготовлении первого запасного раствора; однако количество добавленного растворителя и все последующие разбавления измеряются только по объему. Гравиметрический подход имеет более высокий уровень точности и поэтому является предпочтительным.
   1. Определите целевую концентрацию инсектицида и целевой объем (максимум 10 мл рекомендуется при использовании конических трубок 15 мл для предотвращения разлива при хранении в морозильной камере) для первого запасного раствора и рассчитайте, сколько инсектицидного активного ингредиента (AI) добавить с помощью Eq (1):
        (1)
   2. Подготовьте трубку для хранения (коническая трубка 15 мл рекомендуется для больших объемов, 1,5 мл микроцентрифуги для винтовых колпачковых трубок рекомендуется для объемов 1 мл или менее) и этикетку с названием инсектицида и растворителя, целевой концентрацией и датой приготовления. Поместите трубку и крышку на весы в стойку или держатель и нанесите на весы.
   3. Взвесьте желаемое количество твердого или жидкого инсектицида AI, определенное из шага 2.1.1. (например, дельтаметрин, используемый для репрезентативных данных) в трубку и записывают массу.
   4. Нанесите накипь и добавьте желаемый объем растворителя (эквивалентный целевому объему) в трубку, немедленно закройте крышку и запишите массу. Закройте крышку трубки сразу после добавления растворителя (здесь используется ацетон), чтобы избежать испарения, и перемешайте раствор.
   5. Запишите температуру в помещении. Некоторые растворители, такие как ацетон, могут иметь значительные изменения в объеме (и, следовательно, плотности) в зависимости от температуры.
   6. При немедленном хранении заверните крышку трубки в парапленку (чтобы уменьшить испарение), поместите ее в стойку / держатель для трубок (чтобы сохранить в вертикальном положении и предотвратить утечку), накройте фольгой (чтобы предотвратить воздействие ультрафиолета), поместите ее в запечатываемый пластиковый пакет (чтобы уменьшить испарение) и поместите пакет в морозильную камеру при температуре -20 ° C. Если крышка не хранится немедленно, убедитесь, что крышка закреплена и покрыта фольгой или легким контейнером.
   7. Рассчитайте фактическую концентрацию исходного раствора (мг/мл) путем деления массы инсектицида AI, добавленного на объем добавленного растворителя (и объем инсектицида, добавленного в жидкой форме). Чтобы рассчитать объем добавленного растворителя (или жидкого инсектицида), разделите добавленную массу на известную плотность, соответствующую зарегистрированной температуре.
   8. Рассчитать плотность (г/мл) исходного раствора путем деления общей добавленной массы (инсектицида и растворителя) на общий добавленный объем (растворитель и инсектицид, если он находится в жидкой форме). См. шаг 2.1.7 для преобразования массы жидкости в объем.
2. Последовательно разбавляйте исходный раствор стоковым путем 10% разведения. При необходимости используйте эти последовательные разведения для создания начальной кривой доза-реакция для определения целевого диапазона концентраций инсектицидов для биоанализа.
   1. Рассчитать объем раствора инсектицида и растворителя, добавляемого в каждую пробирку (например, 1 мл раствора инсектицида, разведенного в 9 мл растворителя для разбавления 10 мл на 10% от предыдущей концентрации).
   2. Вихрь стокового раствора в течение 10 с. Нанесите на весы предварительно маркированную первую разбавляющую трубку. Добавьте необходимый объем бульонного раствора в первую разбавляющую трубку с помощью пипетки. Немедленно закройте крышку обеих трубок и запишите массу в первую разбавляющую трубку.
   3. Снова проделайте первую разбавляющую трубку и добавьте необходимый объем растворителя. Немедленно закройте крышку, запишите массу добавленного растворителя и вихрь первого разбавления в течение 10 с.
   4. Повторите шаги 2.2.2 и 2.2.3 для остальных разбавлений.
   5. Хранить все разбавления, как описано выше на этапе 2.1.6.
   6. Рассчитать фактические концентрации разбавлений, выполнив этап 2.1.7.
   7. Рассчитать плотность каждого разбавления инсектицида, разделив общую добавленную массу (раствор инсектицида и растворитель) на общий добавленный объем (раствор инсектицида и растворитель). Для каждого последовательного разбавления используйте плотность предыдущего разбавления запасов инсектицидов для расчета плотности нового разбавления в соответствии с Eq (2):
      (2)
3. Необязательно: Создание инсектицидных разведений с меньшими приращениями путем последовательного разбавления.
   1. Выберите концентрации и объемы каждого нового раствора для получения с помощью кривой доза-реакция начальных серийных разведений, предыдущих испытаний или опубликованной литературы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выбранные концентрации должны приводить к диапазону смертности 0-100%, с минимум тремя концентрациями из этого диапазона, чтобы можно было провести анализ Пробита.
   2. Используйте серийные разбавления в качестве растворов для приготовления каждого нового разбавления и следуйте шагу 2.2 для создания новых разбавлений между 10-кратными разведениями.
4. Необязательно: Аликвот раствор инсектицида. Если производятся большие объемы растворов инсектицидов, распределите растворы в трубки с винтовой крышкой 1,5 мл, чтобы избежать загрязнения, испарения и деградации исходных растворов от частого обращения и воздействия света.
   1. Aliquot растворы, начиная с самой низкой концентрации и работая в направлении самой высокой концентрации, чтобы уменьшить потенциальное загрязнение. Смешайте каждый раствор бульона, вихря в течение 10 с перед открытием и пипеткой нужного объема (например, 0,5 мл) в предварительно маркированную трубку с винтовой крышкой.
   2. Храните аликвоты в светостойком контейнере в морозильной камере при температуре -20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется регулярно (ежемесячно) заменять аликвоты небольшими новыми аликвотами, взятыми непосредственно из исходных разведений пестицидов. Это ограничит возможность переноса загрязнения на другие эксперименты или изменения из-за испарения или УФ-деградации во время использования образцов на стенде. Протокол может быть приостановлен здесь и перезапущен даже спустя годы, если растворы инсектицидов хранятся должным образом (см. шаг 2.1.6) и хранятся в морозильной камере -20 °C.
5. Используйте постоянную маркерную ручку, чтобы пометить мениск перед хранением, чтобы контролировать испарение растворителя. При удалении раствора инсектицида для получения аликвот отмечают мениск каждый раз, когда раствор удаляется.

3. Подготовьте рабочее пространство для тематического применения биоанализа

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется работать в настольной палатке для обработки насекомых для облегчения отлова убегающих комаров или мух. Смотрите дополнительный рисунок S1 для изображений палатки для обработки насекомых.

1. Извлеките необходимые растворы инсектицидов из морозильной камеры, немедленно вихрь и поместите их в светостойкий контейнер при комнатной температуре, чтобы инсектициды нагрелись до комнатной температуры перед использованием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инсектицидные ИИ могут отделяться от растворителя при более низких температурах. Кроме того, объем ацетона изменяется с температурой, что может изменить применяемую дозу инсектицида. Смешивание растворов и предоставление им тепла до комнатной температуры помогает обеспечить консистенцию при использовании растворов инсектицидов.
2. Изложите все необходимые инструменты и материалы для местного анализа применения в палатке для обработки насекомых, как указано в Таблице материалов.
3. Очистите ствол шприца и иглу ацетоном аналитического класса, выполнив 5 промывок на ацетон аликвоту. Дополните это 5 отдельными аликвотами в общей сложности 25 стирок. См. дополнительный рисунок S2 для деталей шприца и ретранслятора.
   1. Установите 5 микроцентрифужных пробирок с 0,5 мл ацетона каждая.
   2. Наполните бочку шприца 0,025 мл ацетона из первой трубки, а затем выбросьте ацетон в контейнер для отходов, быстро надавливая на поршень. Повторите еще четыре раза, чтобы завершить в общей сложности пять промывок ацетона из той же ацетоновой аликвоты. Затем заполните ствол шприца полностью воздухом и выбросьте воздух и потенциальные остатки ацетона в контейнер для отходов. Повторите еще два раза, чтобы завершить три «промывки» воздухом.
   3. Повторите шаг 3.3.2 для оставшихся 4 пробирок с ацетоном.
   4. Создайте воздушный карман внутри ствола между шприцевым поршенем и верхней частью иглы, немного подтянув плунжер в ствол (~5 мм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот воздушный карман защищает плунжер от контакта с растворами инсектицидов и уменьшает перенос инсектицидов.
   5. Отложите шприц в сторону до готовности к использованию для местного применения.
4. Создайте ключ, содержащий применяемые дозы, и назначьте случайные идентификаторы после генераторов случайных чисел или букв (см. Дополнительный файл 1).
5. Пометьте пластиковые стаканчики случайным идентификатором для оценки смертности слепых.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости протокол может быть приостановлен здесь и перезапущен позже. Если во время паузы проходит более нескольких часов, рекомендуется повторить шаг 3.3, чтобы убедиться, что шприц чист, и поместить растворы инсектицидов обратно в морозильную камеру примерно за час до дозирования насекомых, а затем повторить шаг 3.1.

4. Подготовьте образцы для местного биоанализа. Процедурный обзор см. на рисунке 1

1. Сортировка и взвешивание комаров
   1. Используя аспиратор, приводимый в действие всасыванием от вдыхания, аспирируйте желаемое количество 3-5-дневных взрослых комаров, необходимых для анализа, включая избыток для учета поврежденных особей. Перенесите комаров в коническую трубку (до 100 комаров на трубку), поместив кончик аспиратора в трубку с хлопком, обернутым вокруг кончика, и осторожно выдохните и постучите по аспиратору. Используйте хлопок, чтобы заткнуть трубку, когда наконечник аспиратора удален, а затем крышка с крышкой. Избегайте заполнения аспиратора и трубок слишком большим количеством комаров одновременно, так как это добавляет дополнительную нагрузку на комаров и может привести к смерти.
   2. Ненадолго сбивайте комаров в трубках, помещая их минимум на 10 минут при 4 °C или закапывая подо льдом в лоток для льда.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Комары могут удерживаться при 2 °C в течение нескольких часов с минимальной смертностью²⁹; однако лучше всего свести к минимуму продолжительность пребывания комаров на льду, чтобы уменьшить потенциальные негативные последствия.
   3. Переложите сбитых комаров в палатку для обработки насекомых и осторожно выложите комаров на пластиковый лоток (например, чашку Петри), размещенный на льду. Налейте только около 50 комаров за раз, чтобы убедиться, что каждый из них касается прохладного лотка под ним и остается сбитым с ног.
   4. Сортируйте комаров по полу, осторожно подбирая их за ногу (ноги) (или крылья) щипцами и помещайте каждый пол в отдельную чашку. Подсчитайте количество комаров каждого пола во время сортировки и остановитесь, когда будет достигнуто нужное количество. Во время сортировки удалите всех комаров, которые травмированы (например, отсутствующие ноги) или являются очень большими (например, аномально увеличенное брюшко) или маленькими (легко различимыми невооруженным глазом как меньшие, чем средний размер комаров этой популяции).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обращение с комарами с помощью придатков уменьшает структурные повреждения их мягких первичных тел (например, брюшной полости).
   5. Запишите вес каждой чашки комаров с помощью аналитической шкалы с точностью 0,1 мг.
      1. Поместите пустую чашку с чашкой Петри в качестве крышки на весы и нанесите на весы тару. Вылейте комаров в контейнер, поместите крышку сверху и поместите контейнер на весы.
      2. Запишите совокупный вес и количество образцов в оценочном листе (см. Дополнительный файл 2). Немедленно поместите чашку образцов обратно на лед, чтобы держать их обездвиженными.
      3. Повторяйте этапы 4.1.5.1-4.1.5.2 до тех пор, пока не будут взвешены все чашки образцов.
   6. Разделите подготовленных комаров на группы по 20-25 особей в отдельных стаканчиках, помещенных на лед со случайными идентификаторами. При переносе комаров стремитесь уменьшить стресс и физический ущерб, вызванный щипцами. В идеале, подбирайте комаров с помощью щипцов только 1-2 раза: один раз для сортировки / взвешивания и потенциальный второй раз для переноса в экспериментальные чашки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальное количество комаров на чашку составляет 20-25, что достаточно для репликации, разумно для оценки смертности и не должно приводить к стрессу / смерти в чашке, вызванной плотностью.
2. Сортировка и взвешивание плодовых мушек
   1. Обезболивайте мух с помощью CO₂ в течение 7 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если мухи подвергаются воздействию CO₂ более 7 с, у них могут возникнуть проблемы с ползанием и полетом, когда они просыпаются^{в 30 лет}.
   2. Вылейте мух на пакет со льдом, завернутый в бумагу для скамейки, и используйте кисть с мелким наконечником, чтобы отделить и подсчитать самцов и самок.
   3. Используйте кисть, чтобы аккуратно подобрать выбранных мух и поместить их в чистую, пустую бутылку. Выберите равное количество самцов и самок плодовых мушек (например, 15 самцов и 15 самок) и пометьте бутылки с названием штамма и общим количеством плодовых мух (например, Canton-S, 30 мух).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно иметь равное количество самок и самцов плодовых мушек, потому что самцы плодовых мушек могут испытывать повышенную агрессию по отношению друг к другу после удаления из присутствия самок³¹. Поэтому, чтобы избежать неинсектицидной смертности или травм, лучше всего иметь равное количество самцов и самок (или полностью опустить самцов плодовых мушек).
   4. Запишите вес каждой бутылки плодовых мушек с помощью аналитической шкалы.
      1. Поместите пустой флакон (помеченный случайным идентификатором, см. шаг 3.4) с чашкой Петри в качестве крышки на шкале и нанесите на весы тару.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Стеклянные флаконы рекомендуются для использования с плодовыми мухами, так как они значительно уменьшают статичность.
      2. Обезболить бутылку плодовых мушек, соответствующую случайной идентификации флакона, используя CO₂ в течение 7 с.
      3. Вылейте плодовых мушек на бумагу для взвешивания и используйте бумагу в качестве воронки, чтобы ввести мух во флакон. Поместите крышку чашки Петри поверх флакона плодовых мушек и поместите его на весы.
      4. Запишите общий вес и количество образцов на оценочном листе, а затем немедленно поместите флакон плодовых мушек в лоток со льдом, крышкой все еще сверху, чтобы мухи не могли убежать.
      5. Повторите шаги 4.2.4.1-4.2.4.4 для каждой бутылки плодовых мушек.
3. Когда описанные выше шаги будут выполнены, немедленно перейдите к следующему разделу.

5. Образцы доз

1. Загрузите шприц с правильной концентрацией инсектицидов. Начните с наименее концентрированной дозы и работайте в направлении наиболее концентрированной дозы с каждой группой организмов. Чтобы предотвратить отходы, загружайте шприц только необходимым объемом инсектицида плюс рекомендуемые дополнительные 2 мкл.
2. Опрокидывайте образцы на весовую бумагу (бумаги), помещенную поверх лотка на льду. Отделите образцы, которые находятся близко друг к другу, используя чистую, не содержащую инсектицидов кисть или ватный тампон, чтобы обеспечить легкий доступ к каждому образцу для дозирования. Для комаров используйте кисть также, чтобы убедиться, что каждый образец лежит на их спинке, а их вентральная поверхность обращена вверх.
3. Используя шприц, нанесите одну каплю раствора инсектицида (или ацетона для контроля) на вентральную грудную клетку и область брюшка для комаров и спинку для плодовых мушек. Примените каплю 0,2 мкл (для чего требуется шприц 10 мкл) для насекомых меньшего размера, таких как плодовые мухи, и каплю 0,5 мкл (для чего требуется шприц 25 мкл) для комаров.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чувствительность к инсектицидам существенно не различается между первичными частями тела (такими как голова, грудная клетка и брюшко) по сравнению с придатками (такими как крылья, ноги или хоботок)³². Поэтому место применения не обязательно должно быть точным до тех пор, пока капля дозы наносится на первичный орган. Вентральная грудная клетка и область брюшка выбраны для комаров, потому что они часто лежат на спинной стороне при сбитии, тогда как спинная часть выбирается для плодовых мушек, потому что они часто лежат на своей вентральной стороне при сбитии. Снижение специфичности сайта приложения помогает увеличить пропускную способность этого метода.
4. Немедленно перелейте образцы обратно в маркированный пластиковый стаканчик и накройте его сеткой и резинкой. Поместите чашку в лоток для хранения и отметьте на чашке любые образцы, которые были убиты, повреждены или спасены в этом процессе (чтобы исключить их при окончательном подсчете образцов в этой чашке). Для первой чашки запишите время, когда дозировка завершена.
5. Заменить бумагу (бумаги) для взвешивания, на которую помещены образцы, чтобы избежать загрязнения инсектицидами между дозами.
6. Повторяйте дозирование для каждой чашки до тех пор, пока все образцы не будут дозированы с надлежащими концентрациями инсектицидов, и запишите время окончания, когда все образцы были дозированы.
7. Введите 10% раствор сахарозы в каждую чашку с помощью смоченного ватный тампон и отложите чашки в сторону до тех пор, пока на следующий день не будет оценена смертность. Хранить комаров при температуре 27 ± 1 °C при относительной влажности 75 ± 5%⁵ , а плодовых мушек при температуре 23 ± 1 °C при относительной влажности 60 ± 5%.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны при сжатии ватных шариков, чтобы избежать перенасыщения или недоедания. Ватные шарики должны быть влажными, но не капающими. Капание сахарной воды в чашку может привести к гибели образцов и, таким образом, повлиять на оценку смертности инсектицида.

6. Оценка смертности

1. Рекордная смертность образца через 24 ч после начала воздействия инсектицидов. Классифицировать комаров как живых, если они могут летать и держать себя в вертикальном положении; как мертвые, если они неподвижны или атаксические (не могут стоять или взлетать для полета), как описано в ВОЗ⁶. Следуйте той же оценке смертности плодовых мушек ^8,33.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки отсроченной смертности смертность может быть дополнительно оценена через 48 и 72 ч с ежедневной заменой сахарной воды.
2. После регистрации смертности поместите все чашки образцов в содержащийся в нем пакет в морозильную камеру на срок не менее 1 ч, чтобы убедиться, что все образцы мертвы перед удалением или последующим использованием (например, молекулярный или химический анализ).

7. Выполнение реплик

1. Повторите шаги 3-6 на новом наборе образцов, заботясь о том, чтобы выполнять реплики в одно и то же время каждый день, так как восприимчивость к инсектицидам может меняться в зависимости от времени^34-го дня.
2. Обеспечьте минимум 3 реплики для каждой концентрации для точной оценки смертельной дозы, которая убивает 50% образцов (LD₅₀). Включите больше реплик, если наблюдается высокий уровень изменчивости.
3. Завершите анализ после сбора всех данных.

8. Проанализируйте результаты

1. Запишите данные в программу для работы с электронными таблицами и используйте случайный идентификационный ключ для снятия маскировки данных (см. шаг 3.4). Сохраните данные в виде текстового файла (см. пример данных в дополнительном файле 3) для анализа в статистической программе R³⁵ (см. пример кода R в дополнительном файле 4) или другом программном обеспечении выбора³⁶.
2. В программном обеспечении выполните следующий анализ. Пример кода R см. в дополнительном файле 4 .
   1. Рассчитайте дозу инсектицида (нг) на массу образца (мг) в соответствии с Eq (3) ниже:
      (3)
   2. Рассчитайте смертность и примените формулу³⁷ Эбботта для коррекции смертности относительно смертности, наблюдаемой в каждой контрольной^{группе 37}. В качестве альтернативы используйте формулу Шнайдера-Орелли (1947) для коррекции смертности³⁸. С помощью любой формулы применяйте коррекцию ко всем данным независимо от смертности в каждом контроле, как описано ранее³⁷ и реализовано³⁹, если только контрольные данные не являются необычно высокими (см. обсуждение ниже).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Формула Эбботта и эквивалентные альтернативы, такие как формула Шнайдера-Орелли, корректируют значения смертности пропорционально степени смертности, не наблюдаемой в контрольной группе, и не вызовут снижения смертности для чашек, которые имели 100% смертность. Дополнительные сведения см. в приведенных ссылках на эти формулы.
   3. Преобразовать скорректированные данные о смертности в значения пробита (единицы вероятности)⁴⁰ и выполнить линейную регрессию между дозой инсектицида и преобразованными данными о смертности. Используйте тест хи-квадрат для оценки соответствия линейной модели (моделей).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Значения смертности 0 (0% смертности) или 1 (100% смертности) удаляются из данных до завершения преобразования пробита. Это необходимо из-за природы преобразования пробита. Таким образом, графические данные не будут включать положительный или отрицательный контроль или любые другие данные, которые привели к 0% или 100% смертности (после того, как была применена коррекция Эбботта).
   4. Рассчитайте доверительные интервалы LD₅₀ и 95% (CI) на штамм образца, популяцию и/или пол в соответствии с ранее опубликованными методами 39,41,42.
   5. ПРИМЕЧАНИЕ: Если 95% КИ двух штаммов не перекрываются, штаммы имеют значительно разные дозовые реакции.
   6. Если применимо, рассчитайте коэффициенты сопротивления (РР) путем деления LD₅₀ интересующей деформации на LD₅₀ контрольной/контрольной деформации.

Рисунок 1: Схема протокола тематического анализа приложений. Протокол тематического применения начинается с (А) сортировки образцов на льду, за которыми следует (В) взвешивание образцов на аналитических весах, (В) дозирование образцов раствором (растворами) инсектицида и (D) 24-часовой период ожидания после воздействия инсектицида с доступом к 10% раствору сахарозы ad libitum (через пропитанный ватный тампон), с последующей оценкой смертности. Красными стрелками обозначено целевое место применения инсектицидов для комаров (слева) и плодовых мушек (справа). Обратите внимание, что изображение не масштабируется. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Эти репрезентативные результаты показывают два различных штамма Ae. aegypti, Rockefeller (ROCK) и изолированный полевой штамм из Флориды с известными мутациями нокдаун-резистентности F1534C и V1016I (генотип IICC). Кроме того, представлена Drosophila melanogaster (кантон: штамм S).

Рисунки 2 и 3 иллюстрируют дозовую реакцию каждого организма по штаммам и полу, протестированным в соответствии с вышеуказанным протоколом. Поскольку не наблюдалось различий между кривыми «доза-реакция» самцов и самок комаров в пределах каждого штамма (t = 1,70, p = 0,098 для ROCK и t = 0,64, p = 0,527 для IICC), данные от обоих полов в пределах каждого штамма комаров были объединены. Массовая релятивизированнаяLD 50 для ROCK и IICC составляет 0,008 нг/мг (95% ДИ: 0-0,104) и 0,336 нг/мг (95% ДИ: 0,235-0,438), соответственно. 95% QI этих значений не перекрываются, что указывает на значительно отличающиеся дозовые реакции штаммов. ОР штамма IICC (относительно штамма ROCK) составляет 41,7, что по данным ВОЗ, считается высокоустойчивым5. Для плодовых мушек Кантон-S массовая релятивизированная LD50 составляет 0,213 нг/мг (95% ДИ: 0-0,490).

Рисунок 2: Репрезентативные данные о комарах с использованием биоанализа местного применения. Репрезентативные данные о дозе-ответе от местного применения биоанализа в соответствии с вышеуказанным протоколом с использованием дельтаметрина и комаров: (A) женские штаммы Ae. aegypti ROCK (n = 880) и IICC (n = 550), (B) мужские штаммы Ae. aegypti ROCK (n = 880) и IICC (n = 569). Концентрации тестирования дельтаметрина варьировались от 0,00075 нг/мкл до 9,68705 нг/мкл, а доза примененного дельтаметрина (нг) на среднюю массу комара (мг) отражается на оси х. Смертность показана в пропорции по оси Y. Черная линия, проходящая через каждый кластер точек данных, представляет собой линейную регрессию, специфичную для деформации и пола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Репрезентативные данные плодовых мушек с использованием местного применения биоанализа. Репрезентативные данные о дозе-ответе от местного применения биоанализа в соответствии с вышеуказанным протоколом с использованием дельтаметрина и плодовых мушек: штамм D. melanogaster Canton-S (n = 1014). Концентрации в ходе испытаний дельтаметрина варьировались от 0,00499 до 5,02876 нг/мкл, а доза примененного дельтаметрина (нг) на среднюю массу плодовой мухи (мг) отражается на оси X. Смертность показана в пропорции по оси Y. Черная линия представляет линейную регрессию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок S1: Настольная палатка для обработки насекомых. Настольная палатка для обработки насекомых используется для более легкого отлова убегающих комаров или мух во время местного анализа применения. Структура закрыта в А и открыта в В. Эта конструкция была построена из трубы ПВХ и тонкоячеистой ткани. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S2: Аппликатор шприца и ретранслятора. Шприц и ретранслятор аппликатора используются для дозирования насекомых. Основные части включают в себя 1) иглу, 2) шприц-ствол, 3) плунжер, 4) ретранслятор и 5) кнопку ретранслятора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 1: Скрипт рандомизации: Скрипт рандомизации для создания непредвзятых меток для всех чашек каждого эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Оценочный лист смертности: Оценочный лист смертности для облегчения оценки смертности. Лист также включает в себя места для записи всей другой важной информации для записи, как указано в протоколе, такой как время начала и окончания применения инсектицидов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 3: Пример данных о смертности: Пример файла данных, использованного для создания рисунок 2. Описания заголовков столбцов являются следующими: "id" = идентификационный код каждой точки данных; "вид" = видовое название (например, Aedes aegypti); "инсектицид" = наименование инсектицида, применяемого местно (например, дельтаметрин); "штамм" = название штамма комаров (например, ROCK); "date" = дата начала актуальной заявки; "пол" = пол комаров; «возраст» = возраст комаров (детеныш = 3-5-дневный; старый = 4 недели); "total.mosq" = общее количество комаров, взвешенных партиями; "вес" = вес (мг) всех комаров в партии; "концентрация" = концентрация инсектицида (мкг/мл); "шприц" = объем капель (мл) шприца; "доза" = количество инсектицидного активного ингредиента, применяемого к каждому комару (нг); "всего" = количество комаров в каждой чашке; "dead" = количество мертвых комаров в каждой чашке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 4: Код анализа R: Пример кода R, который можно использовать для завершения анализа Probit (как описано в шаге 8 протокола). Репрезентативные результаты (доступные через дополнительный файл данных примера) могут быть использованы с этим кодом R. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.