Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Резюме

Настоящий протокол описывает одну мутацию M213L в Gja1, которая сохраняет полноразмерную генерацию Connexin43, но предотвращает трансляцию меньшей изоформы GJA1-20k с внутренней трансляцией.

Abstract

Система редактирования генов CRISPR-Cas9, основанная на механизмах восстановления генома, позволяет быстрее и проще генерировать генно-модифицированные мышиные модели по сравнению с традиционной гомологичной рекомбинацией. Система CRISPR-Cas9 особенно привлекательна, когда требуется одноточечная мутация. Белок щелевого перехода, Connexin 43 (Cx43), кодируется геном Gja1, который имеет один кодирующий экзон и не может быть сращен. Тем не менее, Gja1 производит не только полноразмерный белок Cx43, но и до шести усеченных изоформ N-конца с помощью процесса, известного как внутренняя трансляция, в результате инициации рибосомной трансляции на внутренних начальных участках AUG (метионин). GJA1-20k является наиболее часто генерируемой усеченной изоформой Cx43, инициируемой в кодоне AUG в позиции 213 мРНК Gja1. Поскольку остаток 213 встречается в конце последнего трансмембранного домена Cx43, GJA1-20k фактически является 20 кДа C-концевым хвостом Cx43 в качестве независимого белка. Предыдущие исследователи определили в клетках, что критическая роль GJA1-20k заключается в облегчении транспортировки полноразмерных гемиханнелей Cx43 с плазматической мембраной. Чтобы исследовать это явление in vivo, была сгенерирована мышь-мутант с точечной мутацией Gja1, которая заменяет ATG (метионин) в остатке 213 TTA (мутация Leucine, M213L). Результатом M213L является то, что мРНК Gja1 и полноразмерная Cx43 все еще генерируются, но трансляция Gja1-20k значительно снижается. В этом отчете основное внимание уделяется выбору сайта фермента рестрикции для разработки мышиной модели с одной аминокислотой мутированной (Gja1^{M213L / M213L}). Этот протокол описывает генетически модифицированных мышей с помощью системы CRISPR-Cas9 и быстрого генотипирования путем комбинирования ПЦР и рестрикционных ферментов.

Introduction

Полноразмерный коннексин 43 (Cx43) и N-конечная усеченная изоформа GJA1-20k, кодируемые одной и той же мРНК GJA1, но использующие разные стартовые кодоны¹ для инициирования трансляции. Трансляция Cx43 происходит при первом кодоне запуска AUG, тогда как трансляция GJA1-20k инициируется в AUG при остатке 213. Ранее было обнаружено, что GJA1-20k играет важную роль в полноразмерном трафике Cx43, стабилизации актина и регуляции митохондриальной морфологии in vitro ^1,2,3.

Чтобы понять роль GJA1-20k in vivo, была сгенерирована «нокаутирующая» модель мыши GJA1-20k, которая сохранила способность создавать полноразмерный Cx43. Подход заключался в использовании системы CRISPR-Cas9 для замены одиночного остатка при 213 с метионина (M) на лейцин (L) (Gja1^{M213L / M213L}) ⁴. Внутренняя мутация от M до L резко снижает вероятность внутренней трансляции, но сохраняет трансляцию и функцию полноразмерного белка⁴. Поскольку дикий тип (WT) и мутировавший аллель имеют одинаковые размеры и почти идентичные продукты мРНК, существует значительная трудность в подтверждении генотипа у мышей. Секвенирование ДНК может идентифицировать мутацию, но слишком дорого и отнимает много времени для рутинного использования. В целом, было установлено несколько методов быстрого генотипирования, таких как полимеразная цепная реакция в реальном времени (ОТ-ПЦР), минисеквенирование-лигирование, анализ плавления с высоким разрешением и тетра-праймерная амплификационная тугобачная мутационная система ПЦР (ARMS-PCR)5,6,7,8. Тем не менее, эти альтернативные методы требуют нескольких шагов, уникальных ресурсов и / или нескольких конкретных наборов праймеров, которые могут индуцировать неспецифические продукты ПЦР.

Этот протокол вводит подробный подход к нацеливанию и редактированию генов CRISPR-Cas9 для создания одной аминокислотной мутации, и для подтверждения мутации представлено быстрое генотипирование. Идентификация генотипа включает в себя творческое использование ферментов рестрикции, использующих только один набор праймеров для идентификации гена-мишени. Читатели ссылаются на Ссылку⁴ , чтобы наблюдать глубокий электрофизиологический эффект внезапной сердечной смерти, вызванной мутацией замещения одного остатка Gja1^{M213L / M213L} , которая все еще генерирует полноразмерный белок, но не может генерировать меньшую внутренне переведенную изоформу усечения. Этот протокол поможет другим моделям мышей использовать точечную мутацию для уменьшения внутренней трансляции интересующей изоформы при сохранении экспрессии эндогенного полноразмерного белка.

протокол

«Все протоколы ухода за животными и их изучения были одобрены институциональными комитетами по уходу за животными и их использованию Медицинского центра Cedars-Sinai и Университета штата Юта. Для экспериментов использовали самок мышей C57BL/6J, полученных из коммерческих источников в возрасте 8-9 недель (см. Таблицу материалов). 1. Подготовка к генному таргетированию Выберите направляющую целевую последовательность вокруг целевого сайта мутации, кодирующего M213, с помощью веб-алгоритма CRISPOR 4,9,10 (см. Таблицу материалов).ПРИМЕЧАНИЕ: Была выбрана 20-базовая направляющая последовательность (ATTCAGAGCGAGAGACACCA), в противоположной цепи от кодирующей последовательности GJA1, с оценкой MIT11 из 62, в которой потенциальный участок расщепления расположен после 16 оснований ниже по течению кодона, подлежащего мутации (ATG) (рисунок 1; вся последовательность crRNA показана в таблице 1). Синтезируют крРНК и тракрРНК, которые взаимодействуют с Cas9 в качестве направляющей РНК12.ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя оценка MIT направляющей РНК составляет 62, существует только одна потенциальная нецелевая мутация с четырьмя несоответствиями более чем в 12 основаниях от PAM. Поэтому данная направляющая РНК считается безопасной. Разработать донорское олиго, комплементарное к направляющей последовательности, для введения одной аминокислотной замены (ATG в TTA; M213L) с 60 и 48 основаниями гомологических рычагов в 5′- и 3′-х сторонах соответственно.ПРИМЕЧАНИЕ: Это донорское олиго включает точечную мутацию для нарушения PAM (от AGG до ACG) путем введения тихой мутации (TCC к TCG; S217S), чтобы избежать повторного редактирования после восстановления, направленного на гомологию CRISPR (HDR)13 для введения предполагаемых мутаций (рисунок 1 и таблица 1). Используйте NaCl (конечная концентрация 200 мМ) для осаждения 10 мкг олиго, чтобы свести к минимуму перенос соли в пронуклеарный буфер микроинъекции (10 мМ Tris-HCl, рН 7,5; 0,1 мМ ЭДТА и 100 мМ NaCl без спермина и спермидина14).ПРИМЕЧАНИЕ: Не промывайте гранулу ДНК 70% этанолом, так как гранула может быть растворена в растворе. Смешайте 50 нг/мкл донорского олиго, 60 нг/мкл смеси крРНК/тракрРНК (молярное соотношение 1:1) (со стадии 1.2) и 50 нг/мкл белка eSpCas9 (см. Таблицу материалов), чтобы получить смесь CRISPR в конечном объеме 20 мкл (Таблица 2). Снижают концентрацию донорского олиго, если наблюдается высокая токсичность (например, 25 нг/мкл). 2. Индукция суперовуляции, сбор яйцеклеток, пронуклеарная микроинъекция смеси CRISPR и скрининг бластоцисты ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура следует ранее опубликованному общемупротоколу 14. Вводят 5 МЕ PMSG (сывороточного гонадотропина беременной кобылы) (см. Таблицу материалов) в 100 мкл стерильной воды 5-10 мышам в возрасте 8 недель путем внутрибрюшинного подхода примерно в 3:00 п.m. (день 1). Вводят 5 МЕ ХГЧ (хорионического гонадотропина человека) (см. Таблицу материалов) в 100 мкл стерильной воды донорам яйцеклеток внутрибрюшинным подходом через 46-48 ч после инъекции ПМСГ (3 день). Наладите разведение 1:1 с племенными самцами. Соберите оплодотворенные яйцеклетки в среде М2 с гиалуронидазой, промыть три раза в 100 мкл среды М2 около 10:00 а.m., затем держать в среде мВтМ15 или KSOM16 (день 4) (см. Таблицу материалов). Вводят смесь CRISPR (стадия 1.3) в эмбрионы 1-клеточной стадии, собранные у мышей пронуклеарной микроинъекцией14 в 100 мкл М2, покрытые парафиновым маслом, в пластиковой посуде на перевернутом микроскопе с контрастной оптикой в начале и конце дня (Видео 1).ПРИМЕЧАНИЕ: Пронуклеарную микроинъекцию смеси CRISPR проводили на эмбрионах 1-клеточной стадии через 14-16 ч после койта (стр.c.). Введенные эмбрионы культивировали в инкубаторе 5% CO2 в течение нескольких часов и хирургически переносили через 18-20 ч p.c. мышам-реципиентам ICR, у которых в то же утро была совокупляющая пробка. Перенесите 20-30 2-клеточных эмбрионов в каждого реципиента для получения рекомбинантных животных.ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте общему протоколу14 или культивируйте эти эмбрионы в среде mWM или KSOM в течение 4 дней для проверки эффективности и изучения токсичности. Токсичность смеси CRISPR приемлема, когда по меньшей мере одна треть введенных эмбрионов рано достигает полностью расширенной стадии бластоцисты с несколькими рекомбинантами среди них. При этом более 90% необработанных эмбрионов достигают той же стадии бластоцисты в параллельной культуре. Следуйте шагам 2.6-2.9 для скрининга бластцисты, который не является необходимым, но может быть выполнен, если это предпочтительно, для количественной оценки успешности HDR. Индивидуально подбирать ранние и полностью расширенные бластоцисты с 2 мкл питательной среды с помощью закупоренного тонкого наконечника пипетки с микропипеттером в одиночные пробирки ПЦР (день 8; Видео 2). Лизовые бластоцисты в 8 мкл смеси для сбраживания (то же, что и стадия 3.2; см. Таблицу материалов) и обрабатывают при 75 °C в течение 10 мин, 95 °C в течение 5 мин, затем охлаждают до 4 °C для хранения. Используйте 2 мкл лизата в качестве шаблона для ПЦР в общей сложности 15 мкл ПЦР-смеси (этап 3). Изучить эффективность HDR с помощью электрофореза агарозного геля17 образцов ПЦР после рестрикционного пищеварения с помощью NlaIII (стадия 3-5). Подтвердить состояние целевой рекомбинации путем секвенирования ампликона17 668 bp у основателей и последующего потомства для подтверждения целостности мутации. 3. Извлечение ДНК ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши на 10-й послеродовой день были использованы для этого эксперимента из-за внезапной смерти нокаутирующей мыши GJA1-20k примерно через 2-4 недели после рождения4. Более общий протокол также может быть применен после ранее опубликованного отчета18. Отрежьте 1-3 мм кончика пальца ноги или хвоста чистыми ножницами и переложите его в 8-полосную ПЦР-трубку объемом 0,2 мл. Чтобы избежать загрязнения среди образцов пальцев ног или хвоста, используйте предварительно очищенные ножницы или одно лезвие на мышь или очистите перед каждым образцом, используя 70% этанола или 10% отбеливателя. Если хвост кровоточит после отбора проб, примените кратковременное давление марлей, чтобы остановить кровотечение. Храните образцы хвоста при -20 °C до экстракции в течение примерно недели. Добавьте раствор лизиса тканей (см. Таблицу материалов) в пробирке объемом 100 мкл/пробирку и хорошо перемешайте, а затем открутите с помощью настольной мини-центрифуги (2 200 х г в течение 10 с при комнатной температуре). Убедитесь, что образцы хвоста погружены в раствор. Установите трубки на термоциклер, установленный по следующей программе; 75 °C в течение 10 мин (лизис тканей), 95 °C в течение 5 мин (инактивация) и 4 °C (выдержка). Храните тканевый лизат при 4 °C в течение недели, если ПЦР не может быть выполнена немедленно. 4. Амплификация ДНК методом ПЦР В новую ПЦР-пробирку готовят раствор ПЦР, содержащий 5 мкл без нуклеазH2O, 0,75 мкл прямых и обратных праймеров 10 мкМ и 7,5 мкл мастер-смеси ПЦР (см. Таблицу материалов) на образец (см. Таблицу 1 для последовательностей праймеров). Если образцов несколько, масштабируйте содержимое до аликвоты 14 мкл на пробирку. Добавьте 1 мкл тканевого лизата к раствору ПЦР, приготовленному на стадии 3.1. Будьте осторожны, чтобы не коснуться хвоста. Хорошо перемешайте и открутите с помощью настольной мини-центрифуги (2 200 х г в течение 10 с при комнатной температуре). Установите трубки на термоциклер, установленный по нижеуказанной программе. Хранить продукты ПЦР при 4 °C в течение 1-2 месяцев или ~1 года при -20 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: 95 °C в течение 3 мин (стадия 1, начальная денатурация), 95 °C в течение 15 с (стадия 2, денатурация), 60 °C в течение 15 с (стадия 2, отжиг), 72 °C в течение 45 с (стадия 2, удлинение), повторите стадию 2 в течение 35 циклов, 72 °C в течение 10 мин (стадия 3, окончательное расширение) и 4 °C (стадия 4, выдержка). 5. Инкубация с ферментом рестрикции Готовят ферментный раствор, содержащий 7 мкл не содержащего нуклеазыH2O, 2 мкл 10x буфера CutSmart и 1 мкл фермента рестрикции NlaIII (см. Таблицу материалов). Если образцов несколько, умножьте каждое содержимое, чтобы получить смесь и аликвоту 10 мкл на пробирку. Добавляют 10 мкл продукта ПЦР, полученного на стадии 3, в раствор фермента на пробирку. Хорошо перемешайте и открутите с помощью настольной мини-центрифуги (2 200 х г в течение 10 с при комнатной температуре). Установите трубки на термоциклер или тепловой блок, установленный по нижеуказанной программе. Хранить продукт после инкубации при 4 °C в течение 1-2 месяцев или ~1 года при -20 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: 37°С в течение 16 ч (не менее 2 ч; короткое время инкубации может привести к недостаточному расщеплению) и 4°С для выдержки. 6. Обнаружение полосы ДНК Для электрофореза приготовьте 1,5% агарозный гель, содержащий пятно ДНК-геля. Добавьте 0,75 г агарозы в 50 мл 1x TAE буфера, затем перемешайте и нагрейте в микроволновой печи до полного растворения агарозы. После остывания добавьте 5 мкл пятна ДНК и аккуратно перемешайте. Вылейте в гелевую форму (25 мл на форму) и дайте гелю затвердеть. Для получения лучшего разрешения и разделения увеличивают концентрацию агарозы до 2,5%-4% по мере необходимости. Загрузите в скважину 10 мкл переваренного продукта ПЦР. При необходимости смешайте 6-кратный буфер загрузки. Запустите гель со 100 В в течение 35 мин.ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры могут нуждаться в оптимизации. Изображение под ультрафиолетовым светом (длина волны 302 нм).

Representative Results

Система редактирования генов CRISPR/Cas9 производит мутацию ATG to TTA и тихую мутацию TCC to TCG при 56 264 279 до 56 264 281 и от 56 264 291 до 56 264 293 на хромосоме мыши 10 или при 869 до 871 и 881 до 883 на мРНК Gja1 соответственно. Эта мутация приводит к мутации метионина 213 к лейцину (M213L) на белке GJA1, а мутация TTC к TTG нарушает ?…

Discussion

Генно-модифицированная модель мыши является распространенным подходом к пониманию функции генов. Однако, поскольку внутренне транслируемая изоформа GJA1-20k транслируется из той же мРНК Gja1 , что и полноразмерная Cx43, была разработана творческая стратегия для сохранения полноразмерн?…

Materials

0.2 mL 8-Strip PCR tube	Thomas Scientific	1148A28
0.5 M EDTA pH 8.0	Invitrogen	15575-038	For pronuclear micorinjection buffer
10x CutSmart buffer	New England Biolabs	B7204S	Digestion buffer for NlaIII
1 M Tris-HCl pH 7.5	Invitrogen	15567-027	For pronuclear micorinjection buffer
50x TAE Buffer	Invitrogen	24710-030
96-well Thermal cycler	Applied Biosystems	Model # 9902
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
C57BL/6J	The Jackson Laboratory	664	mouse strain
Chemidoc MP imaging system	Bio-rad		To take gel image by 302 nm UV light
eSpCas9 protein	MilliporeSigma	ESPCAS9PRO-50UG
Gel Lading Dye Purple (6x)	New England Biolabs	B7024S	Loading buffer for electrophoresis
Gloves
hCG (human chorionic gonadotropin)	MilliporeSigma	23-073-425G
Hyaluronidase	MilliporeSigma	H3884-100MG
Image Lab software	Bio-rad		To analyze gel image
Inverted stereo microscope whit plasDIC	Zeiss	Axiovert A1
KAPA Mouse Genotyping Kits	Roche Diagnostics	KK7352	For tissue or cell lysis, DNA extraction, and PCR master mix
KSOM	LifeGlobal	ZEKS-050	embryo culture medium
Lab coart
M2 medium	MilliporeSigma	MR015D
NlaIII	New England Biolabs	R0125S	To digest PCR product
Nuclease-Free Water	Ambion	AM9937	To dilute reagents
Paraffin oil	Nacalai USA	2613785
Plugged 20 μL fine pipette tip	FisherScientific	02-707-171	To pick up blastocytes
PMSG (pregnant mare’s serum gonadotropin)	ProSpec-Tany	HOR-272
Sodium Chloride	Invitrogen	AM9760G	For pronuclear micorinjection buffer
SYBR safe DNA Gel Stain	Invitrogen	S33102	To detect bands in gel
tracrRNA	Dharmacon	U-002000-120	Guid RNA