Методическая статья

Разработка органоидов из мышиного гипофиза в качестве модели in vitro для изучения биологии стволовых клеток гипофиза

DOI:

10.3791/63431

⸱

25 февраля 2022 г.

 ,  , 
1Laboratory of Tissue Plasticity in Health and Disease, Cluster of Stem Cell and Developmental Biology, Department of Development and Regeneration, Leuven Stem Cell Institute, KU Leuven (University of Leuven)

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гипофиз является ключевым регулятором эндокринной системы организма. В этой статье описывается развитие органоидов из гипофиза мыши как новой 3D-модели in vitro для изучения популяции стволовых клеток железы, биология и функция которой остаются плохо изученными.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гипофиз является главной эндокринной железой, регулирующей ключевые физиологические процессы, включая рост тела, обмен веществ, половое созревание, размножение и реакцию на стресс. Более десяти лет назад стволовые клетки были идентифицированы в гипофизе. Однако, несмотря на применение трансгенных подходов in vivo , их фенотип, биология и роль остаются неясными. Чтобы справиться с этой загадкой, разработана новая и инновационная органоидная модель in vitro , чтобы глубоко разгадать биологию стволовых клеток гипофиза. Органоиды представляют собой 3D-клеточные структуры, которые при определенных условиях культивирования самостоятельно развиваются из стволовых клеток ткани (эпителия) и повторяют множественные признаки этих стволовых клеток и их ткани. Здесь показано, что органоиды, полученные из гипофиза мыши, развиваются из стволовых клеток железы и точно повторяют их фенотипические и функциональные характеристики in vivo . Среди прочего, они воспроизводят состояние активации стволовых клеток in vivo, происходящее в ответ на трансгенно нанесенное местное повреждение. Органоиды являются долгосрочными расширяемыми, сохраняя при этом свой фенотип ствола. Новая исследовательская модель очень ценна для расшифровки фенотипа и поведения стволовых клеток во время ключевых условий ремоделирования гипофиза, начиная от созревания новорожденных до связанного со старением увядания, и от здоровых до больных желез. Здесь представлен подробный протокол для установления органоидов, полученных из гипофиза мыши, которые обеспечивают мощный инструмент для погружения в еще загадочный мир стволовых клеток гипофиза.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гипофиз представляет собой крошечную эндокринную железу, расположенную у основания мозга, где она связана с гипоталамусом. Железа интегрирует периферические и центральные (гипоталамические) входы для генерации настроенного и скоординированного высвобождения гормонов, тем самым регулируя последующие эндокринные органы-мишени (такие как надпочечники и гонады) для производства соответствующих гормонов в нужное время. Гипофиз является ключевым регулятором эндокринной системы и поэтому по праву называется главной железой1.

Гипофиз мыши состоит из трех долей (рисунок 1), то есть передней доли (AL), промежуточной доли (IL) и задней доли (PL). Основная эндокринная AL содержит пять типов гормональных клеток, включая соматотропы, которые производят гормон роста (ГР); лактотропы, генерирующие пролактин (ПРЛ); кортикотропы, секретирующие адренокортикотропный гормон (АКТГ); тиреотропы, отвечающие за выработку тиреотропного гормона (ТТГ); и гонадотропы, вырабатывающие лютеинизирующий гормон (ЛГ) и фолликулостимулирующий гормон (ФСГ). PL состоит из аксональных проекций из гипоталамуса, в которых хранятся гормоны окситоцин и вазопрессин (антидиуретический гормон). IL расположен между AL и PL и содержит меланотропы, которые производят меланоцитостимулирующий гормон (MSH). В гипофизе человека IL регрессирует во время развития, и меланотропы распространяются в пределах AL1. Помимо эндокринных клеток, гипофиз также содержит пул стволовых клеток, по существу отмеченных транскрипционным фактором SOX2 2,3,4,5,6. Эти клетки SOX2+ расположены в маргинальной зоне (MZ), эпителиальной выстилке расщелины (эмбриональный остаточный просвет между AL и IL), или распространяются в виде кластеров по всей паренхиме AL, тем самым предлагая две ниши стволовых клеток в железе (рисунок 1)2,3,4,5,6.

Учитывая незаменимый характер гипофиза, нарушение работы железы связано с серьезной заболеваемостью. Гиперпитуитаризм (характеризующийся чрезмерной секрецией одного или нескольких гормонов) и гипопитуитаризм (дефектная или отсутствующая выработка одного или нескольких гормонов) могут быть вызваны нейроэндокринными опухолями гипофиза (PitNETs; например, опухоли, продуцирующие АКТГ, приводящие к болезни Кушинга) или генетическими дефектами (например, дефицит ГР, приводящий к карликовости)7. Кроме того, хирургия гипофиза (например, для удаления опухолей), инфекции (например, туберкулез гипоталамо-гипофиза или инфекции, следующие за бактериальным менингитом или энцефалитом), синдром Шихана (некроз из-за недостаточного кровотока из-за сильной кровопотери при родах), апоплексия гипофиза и черепно-мозговая травма являются другими важными причинами гипофайнкции гипофиза8 . Показано, что гипофиз мыши обладает регенеративной способностью, будучи способным восстанавливать локальные повреждения, внесенные трансгенной абляцией эндокринных клеток 9,10. Стволовые клетки SOX2+ остро реагируют на нанесенное повреждение, демонстрируя активированный фенотип, отмеченный усиленной пролиферацией (что приводит к расширению стволовых клеток) и повышенной экспрессией факторов и путей, связанных со стволовой (например, WNT / NOTCH). Более того, стволовые клетки начинают экспрессировать абляционный гормон, что в конечном итоге приводит к существенному восстановлению истощенной клеточной популяции в течение следующих (от 5 до 6) месяцев 9,10. Кроме того, во время фазы неонатального созревания железы (первые 3 недели после рождения) стволовые клетки гипофиза процветают в активированном состоянии 6,11,12,13, тогда как старение организма связано со снижением функциональности стволовых клеток in situ из-за увеличения воспалительной (микро-) среды при старении (или «воспалении»)10,14 . Кроме того, опухолевый генез в железе также связан с активацией стволовых клеток 7,15. Хотя активация стволовых клеток была обнаружена в нескольких ситуациях ремоделирования гипофиза (рассмотренных в 7,16), основные механизмы остаются неясными. Поскольку подходы in vivo (такие как отслеживание родословной у трансгенных мышей) не дают четкой или всеобъемлющей картины стволовых клеток гипофиза, разработка надежных моделей in vitro для изучения биологии стволовых клеток в нормальном и больном гипофизе имеет важное значение. Стандартная культура in vitro первичных стволовых клеток гипофиза остается неадекватной из-за очень ограниченной способности к росту и нефизиологических (2D) условий с быстрой потерей фенотипа (для более подробного обзора см.16). 3D-сферные культуры (питуисферы) были созданы из стволовых клеток гипофиза, идентифицированных по боковой популяции и фенотипуSOX2+ 2,3,4. Питуисферы клонально растут из стволовых клеток, экспрессируют маркеры стволовости и демонстрируют дифференцировочную способность в эндокринные типы клеток. Однако они существенно не расширяются, показывая лишь ограниченную проходимость (2-3 прохода)3,4. Сфероподобные структуры также были получены из недиссоциированных кластеров стволовых клеток гипофиза при культивировании в 50% разбавленном Матригеле в течение 1 недели, но расширяемость не была показана17. Подход питуисферы в основном используется в качестве инструмента считывания числа стволовых клеток, но дальнейшие применения ограничены более низкой расширительной способностью16.

Чтобы устранить и преодолеть эти недостатки, недавно была создана новая 3D-модель, то есть органоиды, начиная с основного эндокринного AL мышей, содержащих MZ и паренхиматозные стволовые клетки. Было показано, что органоиды действительно получены из стволовых клеток гипофиза и точно повторяют их фенотип18. Кроме того, органоиды являются долгосрочными расширяемыми, при этом надежно сохраняя свою стеблевую природу. Поэтому они обеспечивают надежный метод расширения первичных стволовых клеток гипофиза для глубокого исследования. Такое исследование недостижимо при ограниченном количестве стволовых клеток, которые могут быть выделены из гипофиза, которые также не могут быть расширены в 2D-условиях16. Было показано, что органоиды являются ценными и надежными инструментами для выявления новых особенностей стволовых клеток гипофиза (переводимых в in vivo)14,18. Важно отметить, что органоидная модель точно отражает статус активации стволовых клеток гипофиза, возникающий во время локального повреждения тканей и созревания новорожденных, демонстрируя повышенную эффективность формирования и репликацию регулируемых молекулярных путей14,18. Следовательно, органоидная модель, полученная из гипофиза, является инновационной и мощной исследовательской моделью биологии стволовых клеток гипофиза, а также инструментом считывания активации стволовых клеток.

Этот протокол подробно описывает создание органоидов, полученных из гипофиза мыши. С этой целью AL выделяют и диссоциируют на отдельные клетки, которые встроены во внеклеточный матрикс, имитирующий Matrigel (далее называемый ECM). Затем клеточно-ECM-сборку культивируют в определенной среде, по существу содержащей факторы роста стволовых клеток и гипофизарные эмбриональные регуляторы (далее называемые «гипофизарной органоидной средой» (PitOM)18; Таблица 1). Как только органоиды полностью развиты (через 10-14 дней), они могут быть дополнительно расширены путем последовательного прохождения и подвергнуты обширному последующему исследованию (например, иммунофлуоресценция, RT-qPCR и объемная или одноклеточная транскриптомика; Рисунок 1). В долгосрочной перспективе ожидается, что органоиды стволовых клеток гипофиза проложат путь к подходам к восстановлению тканей и регенеративной медицине.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эксперименты на животных для этого исследования были одобрены Этическим комитетом KU Leuven по экспериментам на животных (P153/2018). Все мыши были размещены в университетском животноводческом учреждении в стандартизированных условиях (постоянная температура 23 ± 1,5 ° C, относительная влажность 40%-60% и цикл день / ночь 12 ч), с доступом к воде и пище ad libitum.

1. Мыши

  1. Используйте коммерчески доступные штаммы мышей, такие как мыши C57BL/ 6J, молодого взрослого возраста (8-12 недель). В целом, 2-3 мыши обеспечивают достаточное количество AL-клеток для протокола.

2. Изоляция и диссоциация мышиного AL

ПРИМЕЧАНИЕ: Среды А, В и С готовятся заранее 19,20. Составы приведены в таблице 2.

  1. Изоляция мыши AL
    1. Усыпление мышей путем удушьяCO2 с последующим обезглавливанием (рисунок 2A). Промывайте головы мышей деионизированной водой для удаления крови и опрыскивайте их 70% EtOH для создания стерильной среды.
    2. Используя стерильные хирургические инструменты, удалите кожу головы между ушами (рисунок 2B).
    3. Откройте череп и удалите мозг.
      1. Сломать «переносицу» (т.е. переднюю часть лобной кости; Рисунок 2B) стерильными ножницами.
      2. Откройте череп дальше ножницами, начиная от сломанной переносицы к ушам, с обеих сторон (рисунок 2С).
      3. Удаляют череп и мозг стерильным пинцетом, не касаясь гипофиза (рисунок 2D).
    4. Удалить диафрагму селлаем тупым пинцетом, не повреждая гипофиз. Отбросьте PL и IL из AL под стереомикроскопом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: PL и IL связаны и, таким образом, удаляются одновременно. Эти части выглядят как белая ткань, по сравнению с розовым ЦВЕТОМ AL (рисунок 2D).
    5. Тщательно изолируют AL тупым пинцетом и собирают его в колбу Эрленмейера объемом 10 мл, заполненную 3 мл среды А (см. таблицу 2). Поместите колбу на лед до дальнейшей обработки.
  2. Диссоциация мышиной AL
    1. Удалите супернатантную (SN) среду A из колбы Эрленмейера, содержащей выделенный AL. Добавьте 2 мл предварительно расплавленного (37 °C) 2,5% раствора трипсина и инкубируйте при 37 °C в течение 15 мин.
    2. Не удаляя раствор трипсина, добавляют 2 мл предварительно расплавленного (37 °C) раствора ДНКазы (2 мкг/мл в среде А; стерильно фильтруют через сетку 0,22 мкм) и закручивают колбу Эрленмейера 10 раз. Дайте гипофизу опуститься на дно (~1 мин) и удалите SN.
    3. Добавить 2 мл предварительного (37 °C) раствора ингибитора трипсина (0,1 мг/мл в среде А; стерильно-фильтрованного через сетку 0,22 мкм) и инкубировать при 37 °C в течение 10 мин. Дайте гипофизу отстой на дно и удалите SN.
    4. Добавить 2 мл предварительно расплавленной (37 °C) среды B (см. таблицу 2) и инкубировать при 37 °C в течение 5 мин. Не удаляя SN, добавляют 2 мл предварительно расплавленной (37 °C) среды C (см. таблицу 2) и инкубируют при 37 °C в течение 15 мин.
    5. Дайте гипофизу опуститься на дно и удалите SN. Промыть гипофиз три раза с предварительной (37 °C) средой C.
    6. Диссоциируют гипофиз на отдельные клетки.
      1. Добавьте 2 мл предварительной (37 °C) среды C. Аспирируйте и изгоните гипофиз стерильной, отполированной пламенем пипеткой Пастера несколько раз, пока фрагменты больше не будут видны.
      2. Переложите суспензию в пробирку объемом 15 мл с 4,5 мл предварительно расплавленного (37 °C) раствора ДНКазы (2 мкг/мл в среде А; стерильно отфильтрованную через сетку 0,22 мкм). Промыть Эрленмейер три раза 2 мл предварительно расплавленной (37 °C) среды С и перенести суспензию в трубку объемом 15 мл.
    7. Смешайте собранную клеточную суспензию и отфильтруйте ее через клеточный сетчатый фильтр 40 мкм в трубку объемом 30 мл. Промыть трубку объемом 15 мл и клеточный ситечко три раза 2 мл среды С и перенести суспензию в трубку объемом 30 мл.
    8. Расположите кончик стеклянной пипетки Пастера, заполненной 2 мл 3% раствора бычьего сывороточного альбумина (BSA) (в среде А; стерильно отфильтрованной через сетку 0,22 мкм), на дне трубки и осторожно выделите пипетку, чтобы сформировать слой видимой плотности. Центрифуга при 190 х г в течение 10 мин при 4 °C.
    9. Удалите SN, перевернув трубку одним плавным движением, и удалите оставшиеся капли SN с помощью наконечника P1000. Повторно суспендируйте ячейку гранулы в 1 мл ледяного Advanced DMEM/F12 (Adv DMEM/F12) и количественно оцените ячейки с помощью счетчика клеток.

3. Создание и культивирование органоидов, полученных из AL

ПРИМЕЧАНИЕ: Заранее разморозьте ECM на льду (2-3 ч на 1 мл) и держите его на льду в течение всего срока действия протокола.

  1. Посев и культивирование органоидов
    1. Центрифугируйте суспензию ячейки AL при 190 х г в течение 10 мин при 4 °C и удалите SN. Повторное суспендирование клеточной гранулы в Adv DMEM/F12 с использованием удельного объема, рассчитанного для достижения плотности ячейки 1,1 x 106 клеток/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, если клеточная суспензия содержит 500 000 клеток/мл, необходимо повторно суспендировать гранулу ячейки в 454,54 мкл Adv DMEM/F12 для достижения желаемой плотности 1,1 x 106 клеток/мл.
    2. Извлеките объем клеточной суспензии, необходимый для покрытия (в соответствии с желаемым количеством лунок для посева для разработки органоидов) и добавьте ECM в соотношении 30:70 (30% клеточная суспензия (в Adv DMEM/F12) и 70% ECM). Хорошо перемешайте, пипеткой вверх и вниз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, для одной капли объемом 30 мкл (см. этап 3.1.3) следует (осторожно) смешать 9 мкл клеточной суспензии (содержащей ~10 000 клеток при взятии из суспензии 1,1 х 106 клеток/мл) с 21 мкл ECM.
    3. На каждую скважину нанесите 30 мкл капли клеточной суспензии/ECM-смеси (см. этап 3.1.2) на предварительно нагретую (37 °C) 48-луночную пластину. Переверните пластину вверх дном и дайте ECM затвердеть при 37 °C в течение 20 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно нагревайте тарелки для культивирования в течение не менее 24 ч при 37 °C.
    4. Верните пластину в правильную ориентацию и осторожно добавьте 250 мкл предварительно разогретого (37 °C) ПитОМ (см. Таблицу 1), дополненного ингибитором породы 10 мкМ (Y-27632).
    5. Продолжайте культивировать органоиды, изменяя среду (лишенную Y-27632) каждые 2-3 дня, пока органоиды не будут полностью выращены, что занимает от 10 до 14 дней (рисунок 3A). Затем проходим органоиды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При аспирации среды убедитесь, что вы не нарушаете работу купола ECM. Слегка наклоните культуральную пластину и снимите среду с нижнего края колодца. Свежую (предварительно разогретую при 37 °C) среду следует аккуратно добавлять в боковую часть лунки. Если капли геля разъединяются, соберите органоиды и повторно суспендируйте и снова культивируйте их в новой капле ECM.
  2. Пассаж органоидов
    1. Осторожно аспирируйте среду и добавьте 400 мкл ледяного Adv DMEM/F12 для разрушения ECM и сбора органоидов в микроцентрифужную трубку. Промыть один раз 400 мкл ледяного Adv DMEM/F12 EM. Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин при 4 °C.
    2. Осторожно удалите SN и добавьте 400 мкл предварительного (37 °C) фермента TrypLE Express (1X). Перемешайте, перевернув пробирку несколько раз, и инкубируйте при 37 °C в течение 5 мин.
    3. Добавьте 400 мкл ледяного Adv DMEM/F12 и центрифугу при 200 х г в течение 5 мин при 4 °C. Удалите SN.
    4. Повторно суспендировать гранулу 100 мкл ледяного Adv DMEM/F12 и впоследствии разбить органоиды, энергично пипетируя вверх и вниз суженным наконечником P200 (т.е. прижимая пустой наконечник к дну трубки микроцентрифуги, чтобы уменьшить диаметр ее открытия) до получения фрагментов органоидов (диаметром около 50 мкм) (рисунок 3B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диссоциационная смесь должна содержать преимущественно органоидные фрагменты и только несколько одиночных клеток. Резкая диссоциация органоидов на отдельные клетки негативно влияет на повторный рост органоидов.
    5. Добавьте 800 мкл Adv DMEM/F12 и центрифугу при 190 х г в течение 10 мин при 4 °C. Удалите SN.
    6. Прохождение органоидов в соотношении от 1:2 до 1:4. Повторно суспендируйте гранулу в достаточном объеме Adv DMEM/F12 по мере необходимости для покрытия и добавьте ECM в соотношении 30:70 (30% клеточная суспензия и 70% ECM). Хорошо перемешайте, пипеткой вверх и вниз.
    7. Семена и культивирование органоидов, как описано выше на этапах 3.1.3-3.1.5.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В среднем, 20 органоидов развиваются на лунку из 10 000 посеянных цельных AL-клеток (0,2%). Эти органоиды пассажа 0 могут быть разделены в соотношении 1:2, в результате чего органоиды >50 развиваются в лунке (проход 1). Затем органоиды могут быть разделены в соотношении 1:2 к 1:4 во время последующих проходов. Повторный рост органоидов замедляется после ~10 проходов (соответствующих 3 месяцам культивирования), конкретизируется в постепенно меньшем количестве и уменьшении органоидов.

4. Криоконсервация органоидов, полученных из AL, и оттаивание

  1. Криоконсервация органоидов
    1. Следуйте протоколу пропускания с шага 3.2.1 до шага 3.2.5.
    2. Повторно суспендировать органоидную гранулу (содержащую фрагменты и клетки) 1 мл криоконсервационной среды (табл. 3). Перенесите суспензию в криовиальную и поместите ее на лед.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды (т.е. результирующие фрагменты и клетки) из четырех скважин 48-луночной пластины могут быть объединены в одну криовиальную.
    3. Поместите криовиалы в морозильную емкость и перенесите их при -80 °C.
    4. Через 24 ч переложите образцы в криобокс и храните их в жидком азоте (-196 °C) для длительного хранения.
  2. Размораживание криоконсервированных органоидов
    1. Извлеките криовиаль из резервуара с жидким азотом и поместите его на лед. Немедленно приступайте к протоколу оттаивания.
    2. Разморозить раствор криоконсервированными фрагментами органоидов и одиночными клетками при 37 °C (водяная баня).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не держите раствор более 2 мин при температуре 37 °C, чтобы избежать клеточной токсичности ДМСО.
    3. Перенесите содержимое в пробирку объемом 15 мл, содержащую 10 мл ледяного Adv DMEM/F12 с 30% фетальной бычьей сывороткой (FBS). Промыть криовиал 1 мл Adv DMEM/F12 с 30% FBS.
    4. Центрифуга при 190 х г в течение 10 мин при 4 °C. Повторно суспендировать гранулу 1 мл ледяного Adv DMEM/F12 и перенести суспензию в микроцентрифужную трубку.
    5. Центрифуга при 190 х г в течение 10 мин при 4 °C. Повторно суспендируйте гранулы в достаточном объеме Adv DMEM/F12 по мере необходимости для нанесения покрытия и добавьте ECM в соотношении 30:70. Хорошо перемешайте, пипеткой вверх и вниз.
    6. Семена и культивирование органоидов, как описано выше на этапах 3.1.3-3.1.5.

5. Валидация органоидов, полученных из AL

  1. Сбор и лизис органоидов для выделения РНК
    1. Соберите и центрифугируйте органоиды, как описано выше (этап 3.2.1).
    2. Удалите SN и добавьте 350 мкл буфера лизиса с 1% 2-меркапто-этанолом. Вихрь в течение 30 с и хранят при -80 °C или немедленно приступают к выделению РНК.
      ВНИМАНИЕ: Остерегайтесь, что 2-меркапто-этанол является токсичным соединением. Вся работа должна выполняться в химическом вытяжном капюшоне в нитриловых перчатках, пылевой маске и защитных очках. 2-меркапто-этанол может нанести необратимый ущерб глазам и коже.
  2. Фиксация и встраивание органоидов для иммуногистохимии/флуоресцентного окрашивания
    1. Соберите и центрифугируйте органоиды, как описано выше (этап 3.2.1).
    2. Удалите SN, добавьте 1 мл 4% параформальдегида (PFA) и инкубируйте в течение 30 мин при комнатной температуре (RT) на орбитальном шейкере (100 об/мин).
      ВНИМАНИЕ: PFA является известным канцерогеном для человека, который может вызвать необратимое повреждение роговицы. Все работы должны выполняться в химическом вытяжном шкафу. Нитриловые перчатки и защитные очки необходимо всегда носить.
    3. Центрифугу при 200 х г в течение 5 мин и удаляют SN. Добавьте 1 мл PBS, инкубируйте 10 мин при RT на орбитальном шейкере (100 об/мин) и центрифугу при 90 x g в течение 3 мин при 4 °C. Повторите этап стирки дважды. Хранить в PBS при температуре 4 °C.
    4. Для обработки тканей и обезвоживания удалите SN и добавьте 150 мкл 2% агарозного геля (в PBS) к органоидной грануле с использованием предварительно расплавленного расширенного наконечника p200 (сделанного путем разрезания небольшого кусочка наконечника). Немедленно поднимите весь объем вверх и выбросьте в крышку трубки микроцентрифуги.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно работать быстро, так как гель, содержащий органоиды, быстро затвердеет.
    5. Дайте гелю прочно затвердеть в течение 30 минут и переместите гелевой диск на гистологическую кассету. Погружайте и храните в 50% EtOH, до обезвоживания в тканевом процессоре.
    6. Для встраивания парафина поместите гель-диск (с помощью щипцов) во встраиваемую форму и заполните теплым парафином (60 °C). Поместите формы при температуре 4 °C до тех пор, пока парафин не станет твердым (приблизительно 45 мин). Эти образцы могут либо храниться при температуре 4 °C, либо могут быть немедленно подвергнуты секционированию.
    7. Микротомы парафиновых блоков, содержащих органоиды толщиной 5 мкм, и собирают образцы на стеклянных слайдах. Добавьте одну каплю деионизированной воды под каждую секцию, чтобы обеспечить правильное растяжение секции, и поместите слайды на плоскую нагревательную пластину при 37 °C в течение ночи. Храните слайды с секциями при 4 °C или непосредственно продолжайте иммуногистохимическое или иммунофлуоресцентное окрашивание.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

После выделения и диссоциации АЛ полученные одиночные клетки засевают в ECM и выращивают в PitOM (рисунок 1, таблица 1). На рисунке 3А показана клеточная культура и плотность при посеве (день 0). Некоторые мелкие обломки могут присутствовать (рисунок 3А, белые наконечники стрел), но исчезнут при прохождении. Через четырнадцать дней после посева органоиды, полученные из AL, полностью развиты (рис...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Органоиды, полученные из AL, как описано здесь, представляют собой мощную исследовательскую модель для изучения стволовых клеток гипофиза in vitro. В настоящее время этот органоидный подход является единственным доступным инструментом для надежного и надежного выращивания и расширения первичных стволовых клеток гипофиза. Ранее сообщалось о модели органоидов гипофиза, полученных из эмбриональных стволовых клеток (ESC) или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC), которая точно повторяет эмбриональны...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами Исследовательского фонда KU Leuven и Фонда научных исследований (FWO) - Фландрия. E.L. (11A3320N) и C.N. (1S14218N) поддерживаются докторской стипендией от FWO / FWO-SB.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-МеркаптоэтанолSigma-AldrichM6250
48-луночные планшеты, обработанные TC, индивидуально упакованныеCostar734-1607
A83-01Sigma-AldrichSML0788
Advanced DMEM/F12Gibco12634010
Альбумин бычий (класс клеточной культуры)Serva47330
B-27 Supplement ( 50X), минус витамин АGibco12587010
Базовые формыVWR720-1918
Буфер RLTQiagen79216
Кассеты, Q Path MicrotwinVWR720-2191
Клеточный фильтр, 40 & микро; м меш, одноразовыйFalcon352340
Токсин холеры от Vibrio choleraeSigma-AldrichC8052
Дезоксирибонуклеаза I из поджелудочной железы крупного рогатого скотаSigma-AldrichD5025
D-глюкозаMerck108342
диметилсульфоксид (ДМСО)Sigma-AldrichD2650
DMEM, порошок, пробиркиGibco52100039
Eppendorf Safe-Lock, 1,5 млEppendorf30120086
Адгезионные слайды Epredia SuperFrost PlusThermo Fisher ScientificJ1800AMNZ
Epredia HistoStar Embedding Workstation, от 220 до 240 В переменного токаThermo Fisher Scientific12587976
абсолютный этанол 99,8+%ThermoFisher Scientific
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Sigma-AldrichF7524
GlutaMAX ДобавкаGibco35050061
HEPESSigma-AldrichH4034
HEPES Буферный растворGibco15630056
InSolution Y-27632Sigma-Aldrich688001
L-глутамином (200 мМ)Gibco25030081
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR), контейнерCorning15505739
Mr. FrostyThermo Fisher Scientific5100-0001
N-2 Supplement (100X)Thermo Fisher Scientific17502048
N-ацетил-L-цистеинSigma-AldrichA7250
Nunc Biobanking and Cell Culture Криогенные пробиркиThermo Fisher Scientific375353
Параформальдегид для синтеза (PFA)Merck818715
PBS, pH 7,4Gibco10010023
пенициллин G натриевая сольSigma-AldrichP3032
Пенициллин-стрептомицин (10 000 Ед/мл)Gibco15140122
Феноловый красныйMerck107241
хлорид калия (KCl)Merck104936
рекомбинантный человеческий белок EGF, CFR& D systems236-EG
Рекомбинантный человеческий FGF базовый/FGF2/bFGF (157 aa) БелокR& D системы234-FSE
Рекомбинантный Человек FGF-10Пепротех100-26
Рекомбинантный Человек IGF-1Пепротех100-11
Рекомбинантный Человек ИЛ-6Пепротех200-06
Рекомбинантный Человек НоггинПепротех120-10C
Рекомбинантный Человек R-Спондин-1Пепротех120-38
Рекомбинантный человек/мышь FGF-8bPeprotech100-25
Рекомбинантная мышь Sonic Hedgehog/shh (C25II) N-TerminusR& D systems464-SH
RNeasy micro kitQiagen74004
SB202190Sigma-AldrichS7067
SeaKem LE AgaroseLonza50004
Sodium Chloride (NaCl)BDH102415K
Sodium di-Hydrogen Phosphate 1-hydratePanReac-AppliChemA1047
Sodium Гидрокарбонат (NaHCO3)Merck106329
натрий-пируват (C3H3NaO3)Sigma-AldrichP5280
Stericup-GP, 0,22 &; mMilliporeSCGPU02RE
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0,22 шт.; mMilliporeSCGP00525
Стерильная водаFreseniusB230531
Соль сульфата стрептомицинаSigma-AldrichS6501
Thermo Scientific Excelsior ES Тканевый процессорThermo Scientific12505356
Titriplex IIIMerck108418
TrypL Express Enzyme (1X), фенол красныйThermo Fisher Scientific12605028
Ингибитор трипсина из глицина max (соевые бобы)Sigma-AldrichT9003
раствор трипсина 2,5 %Thermo Fisher Scientific15090046
10342652 Матрица базальной мембраны для заморозки без LDEV

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Melmed, S. The pituitary. 3rd ed. , Elsevier/Academic Press. Cambridge. 1(2011).
  2. Chen, J., et al. The adult pituitary contains a cell population displaying stem/progenitor cell and early-embryonic characteristics. Endocrinology. 146 (9), 3985-3998 (2005).
  3. Chen, J., et al. Pituitary progenitor cells tracked down by side population dissection. Stem Cells. 27 (5), 1182-1195 (2009).
  4. Fauquier, T., Rizzoti, K., Dattani, M., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C. A. F. SOX2-expressing progenitor cells generate all of the major cell types in the adult mouse pituitary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2907-2912 (2008).
  5. Rizzoti, K., Akiyama, H., Lovell-Badge, R. Mobilized adult pituitary stem cells contribute to endocrine regeneration in response to physiological demand. Cell Stem Cell. 13 (4), 419-432 (2013).
  6. Andoniadou, C. L., et al. Sox2+ stem/progenitor cells in the adult mouse pituitary support organ homeostasis and have tumor-inducing potential. Cell Stem Cell. 13 (4), 433-445 (2013).
  7. Nys, C., Vankelecom, H. Pituitary disease and recovery: How are stem cells involved. Molecular and Cellular Endocrinology. 525 (4), 111176(2021).
  8. Schneider, H. J., Aimaretti, G., Kreitschmann-Andermahr, I., Stalla, G. K., Ghigo, E. Hypopituitarism. Lancet. 369 (9571), 1461-1470 (2007).
  9. Fu, Q., et al. The adult pituitary shows stem/progenitor cell activation in response to injury and is capable of regeneration. Endocrinology. 153 (7), 3224-3235 (2012).
  10. Willems, C., et al. Regeneration in the pituitary after cell-ablation injury: time-related aspects and molecular analysis. Endocrinology. 157 (2), 705-721 (2016).
  11. Gremeaux, L., Fu, Q., Chen, J., Vankelecom, H. Activated phenotype of the pituitary stem/progenitor cell compartment during the early-postnatal maturation phase of the gland. Stem Cells and Development. 21 (5), 801-813 (2012).
  12. Zhu, X., Tollkuhn, J., Taylor, H., Rosenfeld, M. G. Notch-dependent pituitary SOX2+ stem cells exhibit a timed functional extinction in regulation of the postnatal gland. Stem Cell Reports. 5 (6), 1196-1209 (2015).
  13. Russell, J. P., et al. Pituitary stem cells produce paracrine WNT signals to control the expansion of their descendant progenitor cells. eLife. 10 (1), 59142(2021).
  14. Vennekens, A., et al. Interleukin-6 is an activator of pituitary stem cells upon local damage, a competence quenched in the aging gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (25), 2100052118(2021).
  15. Mertens, F., et al. Pituitary tumors contain a side population with tumor stem cell-associated characteristics. Endocrine-Related Cancer. 22 (4), 481-504 (2015).
  16. Laporte, E., Vennekens, A., Vankelecom, H. Pituitary remodeling throughout life: are resident stem cells involved. Frontiers in Endocrinology. 11 (1), 604519(2021).
  17. Yoshida, S., et al. Isolation of adult pituitary stem/progenitor cell clusters located in the parenchyma of the rat anterior lobe. Stem Cell Research. 17 (2), 318-329 (2016).
  18. Cox, B., et al. Organoids from pituitary as novel research model to study pituitary stem cell biology. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
  19. Denef, C., Hautekeete, E., De Wolf, A., Vanderschueren, B. Pituitary basophils from immature male and female rats: distribution of gonadotrophs and thyrotrophs as studied by unit gravity sedimentation. Endocrinology. 130 (3), 724-735 (1978).
  20. Vander Schueren, B., Denef, C., Cassiman, J. J. Ultrastructural and functional characteristics of rat pituitary cell aggregates. Endocrinology. 110 (2), 513-523 (1982).
  21. Claes, C., et al. Human stem cell-derived monocytes and microglia-like cells reveal impaired amyloid plaque clearance upon heterozygous or homozygous loss of TREM2. Alzheimer's and Dementia. 15 (3), 453-464 (2019).
  22. Trompeter, H. -I., et al. MicroRNAs miR-26a, miR-26b, and miR-29b accelerate osteogenic differentiation of unrestricted somatic stem cells from human cord blood. BMC Genomics. 14, 111(2013).
  23. Suga, H., et al. Self-formation of functional adenohypophysis in three-dimensional culture. Nature. 480 (7375), 57-62 (2011).
  24. Matsumoto, R., et al. Congenital pituitary hypoplasia model demonstrates hypothalamic OTX2 regulation of pituitary progenitor cells. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 641-654 (2019).
  25. Kanie, K., et al. Pathogenesis of anti-PIT-1 antibody syndrome: PIT-1 presentation by HLA class I on anterior pituitary cells. Journal of the Endocrine Society. 3 (11), 1969-1978 (2019).
  26. Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
  27. Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
  28. Nolan, L. A., Kavanagh, E., Lightman, S. L., Levy, A. Anterior pituitary cell population control: basal cell turnover and the effects of adrenalectomy and dexamethasone treatment. Journal of Neuroendocrinology. 10 (3), 207-215 (1998).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи