Разработка органоидов из мышиного гипофиза в качестве модели in vitro для изучения биологии стволовых клеток гипофиза

Гипофиз представляет собой крошечную эндокринную железу, расположенную у основания мозга, где она связана с гипоталамусом. Железа интегрирует периферические и центральные (гипоталамические) входы для генерации настроенного и скоординированного высвобождения гормонов, тем самым регулируя последующие эндокринные органы-мишени (такие как надпочечники и гонады) для производства соответствующих гормонов в нужное время. Гипофиз является ключевым регулятором эндокринной системы и поэтому по праву называется главной железой¹.

Гипофиз мыши состоит из трех долей (рисунок 1), то есть передней доли (AL), промежуточной доли (IL) и задней доли (PL). Основная эндокринная AL содержит пять типов гормональных клеток, включая соматотропы, которые производят гормон роста (ГР); лактотропы, генерирующие пролактин (ПРЛ); кортикотропы, секретирующие адренокортикотропный гормон (АКТГ); тиреотропы, отвечающие за выработку тиреотропного гормона (ТТГ); и гонадотропы, вырабатывающие лютеинизирующий гормон (ЛГ) и фолликулостимулирующий гормон (ФСГ). PL состоит из аксональных проекций из гипоталамуса, в которых хранятся гормоны окситоцин и вазопрессин (антидиуретический гормон). IL расположен между AL и PL и содержит меланотропы, которые производят меланоцитостимулирующий гормон (MSH). В гипофизе человека IL регрессирует во время развития, и меланотропы распространяются в пределах AL¹. Помимо эндокринных клеток, гипофиз также содержит пул стволовых клеток, по существу отмеченных транскрипционным фактором SOX2 2,3,4,5,6. Эти клетки SOX2⁺ расположены в маргинальной зоне (MZ), эпителиальной выстилке расщелины (эмбриональный остаточный просвет между AL и IL), или распространяются в виде кластеров по всей паренхиме AL, тем самым предлагая две ниши стволовых клеток в железе (рисунок 1)2,3,4,5,6.

Учитывая незаменимый характер гипофиза, нарушение работы железы связано с серьезной заболеваемостью. Гиперпитуитаризм (характеризующийся чрезмерной секрецией одного или нескольких гормонов) и гипопитуитаризм (дефектная или отсутствующая выработка одного или нескольких гормонов) могут быть вызваны нейроэндокринными опухолями гипофиза (PitNETs; например, опухоли, продуцирующие АКТГ, приводящие к болезни Кушинга) или генетическими дефектами (например, дефицит ГР, приводящий к карликовости)⁷. Кроме того, хирургия гипофиза (например, для удаления опухолей), инфекции (например, туберкулез гипоталамо-гипофиза или инфекции, следующие за бактериальным менингитом или энцефалитом), синдром Шихана (некроз из-за недостаточного кровотока из-за сильной кровопотери при родах), апоплексия гипофиза и черепно-мозговая травма являются другими важными причинами гипофайнкции гипофиза⁸ . Показано, что гипофиз мыши обладает регенеративной способностью, будучи способным восстанавливать локальные повреждения, внесенные трансгенной абляцией эндокринных клеток ^9,10. Стволовые клетки SOX2⁺ остро реагируют на нанесенное повреждение, демонстрируя активированный фенотип, отмеченный усиленной пролиферацией (что приводит к расширению стволовых клеток) и повышенной экспрессией факторов и путей, связанных со стволовой (например, WNT / NOTCH). Более того, стволовые клетки начинают экспрессировать абляционный гормон, что в конечном итоге приводит к существенному восстановлению истощенной клеточной популяции в течение следующих (от 5 до 6) месяцев ^9,10. Кроме того, во время фазы неонатального созревания железы (первые 3 недели после рождения) стволовые клетки гипофиза процветают в активированном состоянии ^6,11,12,13, тогда как старение организма связано со снижением функциональности стволовых клеток in situ из-за увеличения воспалительной (микро-) среды при старении (или «воспалении»)^10,14 . Кроме того, опухолевый генез в железе также связан с активацией стволовых клеток ^7,15. Хотя активация стволовых клеток была обнаружена в нескольких ситуациях ремоделирования гипофиза (рассмотренных в ^7,16), основные механизмы остаются неясными. Поскольку подходы in vivo (такие как отслеживание родословной у трансгенных мышей) не дают четкой или всеобъемлющей картины стволовых клеток гипофиза, разработка надежных моделей in vitro для изучения биологии стволовых клеток в нормальном и больном гипофизе имеет важное значение. Стандартная культура in vitro первичных стволовых клеток гипофиза остается неадекватной из-за очень ограниченной способности к росту и нефизиологических (2D) условий с быстрой потерей фенотипа (для более подробного обзора см.¹⁶). 3D-сферные культуры (питуисферы) были созданы из стволовых клеток гипофиза, идентифицированных по боковой популяции и фенотипу^{SOX2+ 2,3,4}. Питуисферы клонально растут из стволовых клеток, экспрессируют маркеры стволовости и демонстрируют дифференцировочную способность в эндокринные типы клеток. Однако они существенно не расширяются, показывая лишь ограниченную проходимость (2-3 прохода)^3,4. Сфероподобные структуры также были получены из недиссоциированных кластеров стволовых клеток гипофиза при культивировании в 50% разбавленном Матригеле в течение 1 недели, но расширяемость не была показана¹⁷. Подход питуисферы в основном используется в качестве инструмента считывания числа стволовых клеток, но дальнейшие применения ограничены более низкой расширительной способностью¹⁶.

Чтобы устранить и преодолеть эти недостатки, недавно была создана новая 3D-модель, то есть органоиды, начиная с основного эндокринного AL мышей, содержащих MZ и паренхиматозные стволовые клетки. Было показано, что органоиды действительно получены из стволовых клеток гипофиза и точно повторяют их фенотип¹⁸. Кроме того, органоиды являются долгосрочными расширяемыми, при этом надежно сохраняя свою стеблевую природу. Поэтому они обеспечивают надежный метод расширения первичных стволовых клеток гипофиза для глубокого исследования. Такое исследование недостижимо при ограниченном количестве стволовых клеток, которые могут быть выделены из гипофиза, которые также не могут быть расширены в 2D-условиях¹⁶. Было показано, что органоиды являются ценными и надежными инструментами для выявления новых особенностей стволовых клеток гипофиза (переводимых в in vivo)^14,18. Важно отметить, что органоидная модель точно отражает статус активации стволовых клеток гипофиза, возникающий во время локального повреждения тканей и созревания новорожденных, демонстрируя повышенную эффективность формирования и репликацию регулируемых молекулярных путей^14,18. Следовательно, органоидная модель, полученная из гипофиза, является инновационной и мощной исследовательской моделью биологии стволовых клеток гипофиза, а также инструментом считывания активации стволовых клеток.

Этот протокол подробно описывает создание органоидов, полученных из гипофиза мыши. С этой целью AL выделяют и диссоциируют на отдельные клетки, которые встроены во внеклеточный матрикс, имитирующий Matrigel (далее называемый ECM). Затем клеточно-ECM-сборку культивируют в определенной среде, по существу содержащей факторы роста стволовых клеток и гипофизарные эмбриональные регуляторы (далее называемые «гипофизарной органоидной средой» (PitOM)¹⁸; Таблица 1). Как только органоиды полностью развиты (через 10-14 дней), они могут быть дополнительно расширены путем последовательного прохождения и подвергнуты обширному последующему исследованию (например, иммунофлуоресценция, RT-qPCR и объемная или одноклеточная транскриптомика; Рисунок 1). В долгосрочной перспективе ожидается, что органоиды стволовых клеток гипофиза проложат путь к подходам к восстановлению тканей и регенеративной медицине.

Эксперименты на животных для этого исследования были одобрены Этическим комитетом KU Leuven по экспериментам на животных (P153/2018). Все мыши были размещены в университетском животноводческом учреждении в стандартизированных условиях (постоянная температура 23 ± 1,5 ° C, относительная влажность 40%-60% и цикл день / ночь 12 ч), с доступом к воде и пище ad libitum.

1. Мыши

1. Используйте коммерчески доступные штаммы мышей, такие как мыши C57BL/ 6J, молодого взрослого возраста (8-12 недель). В целом, 2-3 мыши обеспечивают достаточное количество AL-клеток для протокола.

2. Изоляция и диссоциация мышиного AL

ПРИМЕЧАНИЕ: Среды А, В и С готовятся заранее ^19,20. Составы приведены в таблице 2.

1. Изоляция мыши AL
   1. Усыпление мышей путем удушья_CO2 с последующим обезглавливанием (рисунок 2A). Промывайте головы мышей деионизированной водой для удаления крови и опрыскивайте их 70% EtOH для создания стерильной среды.
   2. Используя стерильные хирургические инструменты, удалите кожу головы между ушами (рисунок 2B).
   3. Откройте череп и удалите мозг.
      1. Сломать «переносицу» (т.е. переднюю часть лобной кости; Рисунок 2B) стерильными ножницами.
      2. Откройте череп дальше ножницами, начиная от сломанной переносицы к ушам, с обеих сторон (рисунок 2С).
      3. Удаляют череп и мозг стерильным пинцетом, не касаясь гипофиза (рисунок 2D).
   4. Удалить диафрагму селлаем тупым пинцетом, не повреждая гипофиз. Отбросьте PL и IL из AL под стереомикроскопом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: PL и IL связаны и, таким образом, удаляются одновременно. Эти части выглядят как белая ткань, по сравнению с розовым ЦВЕТОМ AL (рисунок 2D).
   5. Тщательно изолируют AL тупым пинцетом и собирают его в колбу Эрленмейера объемом 10 мл, заполненную 3 мл среды А (см. таблицу 2). Поместите колбу на лед до дальнейшей обработки.
2. Диссоциация мышиной AL
   1. Удалите супернатантную (SN) среду A из колбы Эрленмейера, содержащей выделенный AL. Добавьте 2 мл предварительно расплавленного (37 °C) 2,5% раствора трипсина и инкубируйте при 37 °C в течение 15 мин.
   2. Не удаляя раствор трипсина, добавляют 2 мл предварительно расплавленного (37 °C) раствора ДНКазы (2 мкг/мл в среде А; стерильно фильтруют через сетку 0,22 мкм) и закручивают колбу Эрленмейера 10 раз. Дайте гипофизу опуститься на дно (~1 мин) и удалите SN.
   3. Добавить 2 мл предварительного (37 °C) раствора ингибитора трипсина (0,1 мг/мл в среде А; стерильно-фильтрованного через сетку 0,22 мкм) и инкубировать при 37 °C в течение 10 мин. Дайте гипофизу отстой на дно и удалите SN.
   4. Добавить 2 мл предварительно расплавленной (37 °C) среды B (см. таблицу 2) и инкубировать при 37 °C в течение 5 мин. Не удаляя SN, добавляют 2 мл предварительно расплавленной (37 °C) среды C (см. таблицу 2) и инкубируют при 37 °C в течение 15 мин.
   5. Дайте гипофизу опуститься на дно и удалите SN. Промыть гипофиз три раза с предварительной (37 °C) средой C.
   6. Диссоциируют гипофиз на отдельные клетки.
      1. Добавьте 2 мл предварительной (37 °C) среды C. Аспирируйте и изгоните гипофиз стерильной, отполированной пламенем пипеткой Пастера несколько раз, пока фрагменты больше не будут видны.
      2. Переложите суспензию в пробирку объемом 15 мл с 4,5 мл предварительно расплавленного (37 °C) раствора ДНКазы (2 мкг/мл в среде А; стерильно отфильтрованную через сетку 0,22 мкм). Промыть Эрленмейер три раза 2 мл предварительно расплавленной (37 °C) среды С и перенести суспензию в трубку объемом 15 мл.
   7. Смешайте собранную клеточную суспензию и отфильтруйте ее через клеточный сетчатый фильтр 40 мкм в трубку объемом 30 мл. Промыть трубку объемом 15 мл и клеточный ситечко три раза 2 мл среды С и перенести суспензию в трубку объемом 30 мл.
   8. Расположите кончик стеклянной пипетки Пастера, заполненной 2 мл 3% раствора бычьего сывороточного альбумина (BSA) (в среде А; стерильно отфильтрованной через сетку 0,22 мкм), на дне трубки и осторожно выделите пипетку, чтобы сформировать слой видимой плотности. Центрифуга при 190 х г в течение 10 мин при 4 °C.
   9. Удалите SN, перевернув трубку одним плавным движением, и удалите оставшиеся капли SN с помощью наконечника P1000. Повторно суспендируйте ячейку гранулы в 1 мл ледяного Advanced DMEM/F12 (Adv DMEM/F12) и количественно оцените ячейки с помощью счетчика клеток.

3. Создание и культивирование органоидов, полученных из AL

ПРИМЕЧАНИЕ: Заранее разморозьте ECM на льду (2-3 ч на 1 мл) и держите его на льду в течение всего срока действия протокола.

1. Посев и культивирование органоидов
   1. Центрифугируйте суспензию ячейки AL при 190 х г в течение 10 мин при 4 °C и удалите SN. Повторное суспендирование клеточной гранулы в Adv DMEM/F12 с использованием удельного объема, рассчитанного для достижения плотности ячейки 1,1 x 10⁶ клеток/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, если клеточная суспензия содержит 500 000 клеток/мл, необходимо повторно суспендировать гранулу ячейки в 454,54 мкл Adv DMEM/F12 для достижения желаемой плотности 1,1 x 10⁶ клеток/мл.
   2. Извлеките объем клеточной суспензии, необходимый для покрытия (в соответствии с желаемым количеством лунок для посева для разработки органоидов) и добавьте ECM в соотношении 30:70 (30% клеточная суспензия (в Adv DMEM/F12) и 70% ECM). Хорошо перемешайте, пипеткой вверх и вниз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, для одной капли объемом 30 мкл (см. этап 3.1.3) следует (осторожно) смешать 9 мкл клеточной суспензии (содержащей ~10 000 клеток при взятии из суспензии 1,1 х 10⁶ клеток/мл) с 21 мкл ECM.
   3. На каждую скважину нанесите 30 мкл капли клеточной суспензии/ECM-смеси (см. этап 3.1.2) на предварительно нагретую (37 °C) 48-луночную пластину. Переверните пластину вверх дном и дайте ECM затвердеть при 37 °C в течение 20 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно нагревайте тарелки для культивирования в течение не менее 24 ч при 37 °C.
   4. Верните пластину в правильную ориентацию и осторожно добавьте 250 мкл предварительно разогретого (37 °C) ПитОМ (см. Таблицу 1), дополненного ингибитором породы 10 мкМ (Y-27632).
   5. Продолжайте культивировать органоиды, изменяя среду (лишенную Y-27632) каждые 2-3 дня, пока органоиды не будут полностью выращены, что занимает от 10 до 14 дней (рисунок 3A). Затем проходим органоиды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При аспирации среды убедитесь, что вы не нарушаете работу купола ECM. Слегка наклоните культуральную пластину и снимите среду с нижнего края колодца. Свежую (предварительно разогретую при 37 °C) среду следует аккуратно добавлять в боковую часть лунки. Если капли геля разъединяются, соберите органоиды и повторно суспендируйте и снова культивируйте их в новой капле ECM.
2. Пассаж органоидов
   1. Осторожно аспирируйте среду и добавьте 400 мкл ледяного Adv DMEM/F12 для разрушения ECM и сбора органоидов в микроцентрифужную трубку. Промыть один раз 400 мкл ледяного Adv DMEM/F12 EM. Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин при 4 °C.
   2. Осторожно удалите SN и добавьте 400 мкл предварительного (37 °C) фермента TrypLE Express (1X). Перемешайте, перевернув пробирку несколько раз, и инкубируйте при 37 °C в течение 5 мин.
   3. Добавьте 400 мкл ледяного Adv DMEM/F12 и центрифугу при 200 х г в течение 5 мин при 4 °C. Удалите SN.
   4. Повторно суспендировать гранулу 100 мкл ледяного Adv DMEM/F12 и впоследствии разбить органоиды, энергично пипетируя вверх и вниз суженным наконечником P200 (т.е. прижимая пустой наконечник к дну трубки микроцентрифуги, чтобы уменьшить диаметр ее открытия) до получения фрагментов органоидов (диаметром около 50 мкм) (рисунок 3B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диссоциационная смесь должна содержать преимущественно органоидные фрагменты и только несколько одиночных клеток. Резкая диссоциация органоидов на отдельные клетки негативно влияет на повторный рост органоидов.
   5. Добавьте 800 мкл Adv DMEM/F12 и центрифугу при 190 х г в течение 10 мин при 4 °C. Удалите SN.
   6. Прохождение органоидов в соотношении от 1:2 до 1:4. Повторно суспендируйте гранулу в достаточном объеме Adv DMEM/F12 по мере необходимости для покрытия и добавьте ECM в соотношении 30:70 (30% клеточная суспензия и 70% ECM). Хорошо перемешайте, пипеткой вверх и вниз.
   7. Семена и культивирование органоидов, как описано выше на этапах 3.1.3-3.1.5.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В среднем, 20 органоидов развиваются на лунку из 10 000 посеянных цельных AL-клеток (0,2%). Эти органоиды пассажа 0 могут быть разделены в соотношении 1:2, в результате чего органоиды >50 развиваются в лунке (проход 1). Затем органоиды могут быть разделены в соотношении 1:2 к 1:4 во время последующих проходов. Повторный рост органоидов замедляется после ~10 проходов (соответствующих 3 месяцам культивирования), конкретизируется в постепенно меньшем количестве и уменьшении органоидов.

4. Криоконсервация органоидов, полученных из AL, и оттаивание

1. Криоконсервация органоидов
   1. Следуйте протоколу пропускания с шага 3.2.1 до шага 3.2.5.
   2. Повторно суспендировать органоидную гранулу (содержащую фрагменты и клетки) 1 мл криоконсервационной среды (табл. 3). Перенесите суспензию в криовиальную и поместите ее на лед.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды (т.е. результирующие фрагменты и клетки) из четырех скважин 48-луночной пластины могут быть объединены в одну криовиальную.
   3. Поместите криовиалы в морозильную емкость и перенесите их при -80 °C.
   4. Через 24 ч переложите образцы в криобокс и храните их в жидком азоте (-196 °C) для длительного хранения.
2. Размораживание криоконсервированных органоидов
   1. Извлеките криовиаль из резервуара с жидким азотом и поместите его на лед. Немедленно приступайте к протоколу оттаивания.
   2. Разморозить раствор криоконсервированными фрагментами органоидов и одиночными клетками при 37 °C (водяная баня).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не держите раствор более 2 мин при температуре 37 °C, чтобы избежать клеточной токсичности ДМСО.
   3. Перенесите содержимое в пробирку объемом 15 мл, содержащую 10 мл ледяного Adv DMEM/F12 с 30% фетальной бычьей сывороткой (FBS). Промыть криовиал 1 мл Adv DMEM/F12 с 30% FBS.
   4. Центрифуга при 190 х г в течение 10 мин при 4 °C. Повторно суспендировать гранулу 1 мл ледяного Adv DMEM/F12 и перенести суспензию в микроцентрифужную трубку.
   5. Центрифуга при 190 х г в течение 10 мин при 4 °C. Повторно суспендируйте гранулы в достаточном объеме Adv DMEM/F12 по мере необходимости для нанесения покрытия и добавьте ECM в соотношении 30:70. Хорошо перемешайте, пипеткой вверх и вниз.
   6. Семена и культивирование органоидов, как описано выше на этапах 3.1.3-3.1.5.

5. Валидация органоидов, полученных из AL

1. Сбор и лизис органоидов для выделения РНК
   1. Соберите и центрифугируйте органоиды, как описано выше (этап 3.2.1).
   2. Удалите SN и добавьте 350 мкл буфера лизиса с 1% 2-меркапто-этанолом. Вихрь в течение 30 с и хранят при -80 °C или немедленно приступают к выделению РНК.
      ВНИМАНИЕ: Остерегайтесь, что 2-меркапто-этанол является токсичным соединением. Вся работа должна выполняться в химическом вытяжном капюшоне в нитриловых перчатках, пылевой маске и защитных очках. 2-меркапто-этанол может нанести необратимый ущерб глазам и коже.
2. Фиксация и встраивание органоидов для иммуногистохимии/флуоресцентного окрашивания
   1. Соберите и центрифугируйте органоиды, как описано выше (этап 3.2.1).
   2. Удалите SN, добавьте 1 мл 4% параформальдегида (PFA) и инкубируйте в течение 30 мин при комнатной температуре (RT) на орбитальном шейкере (100 об/мин).
      ВНИМАНИЕ: PFA является известным канцерогеном для человека, который может вызвать необратимое повреждение роговицы. Все работы должны выполняться в химическом вытяжном шкафу. Нитриловые перчатки и защитные очки необходимо всегда носить.
   3. Центрифугу при 200 х г в течение 5 мин и удаляют SN. Добавьте 1 мл PBS, инкубируйте 10 мин при RT на орбитальном шейкере (100 об/мин) и центрифугу при 90 x g в течение 3 мин при 4 °C. Повторите этап стирки дважды. Хранить в PBS при температуре 4 °C.
   4. Для обработки тканей и обезвоживания удалите SN и добавьте 150 мкл 2% агарозного геля (в PBS) к органоидной грануле с использованием предварительно расплавленного расширенного наконечника p200 (сделанного путем разрезания небольшого кусочка наконечника). Немедленно поднимите весь объем вверх и выбросьте в крышку трубки микроцентрифуги.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно работать быстро, так как гель, содержащий органоиды, быстро затвердеет.
   5. Дайте гелю прочно затвердеть в течение 30 минут и переместите гелевой диск на гистологическую кассету. Погружайте и храните в 50% EtOH, до обезвоживания в тканевом процессоре.
   6. Для встраивания парафина поместите гель-диск (с помощью щипцов) во встраиваемую форму и заполните теплым парафином (60 °C). Поместите формы при температуре 4 °C до тех пор, пока парафин не станет твердым (приблизительно 45 мин). Эти образцы могут либо храниться при температуре 4 °C, либо могут быть немедленно подвергнуты секционированию.
   7. Микротомы парафиновых блоков, содержащих органоиды толщиной 5 мкм, и собирают образцы на стеклянных слайдах. Добавьте одну каплю деионизированной воды под каждую секцию, чтобы обеспечить правильное растяжение секции, и поместите слайды на плоскую нагревательную пластину при 37 °C в течение ночи. Храните слайды с секциями при 4 °C или непосредственно продолжайте иммуногистохимическое или иммунофлуоресцентное окрашивание.

После выделения и диссоциации АЛ полученные одиночные клетки засевают в ECM и выращивают в PitOM (рисунок 1, таблица 1). На рисунке 3А показана клеточная культура и плотность при посеве (день 0). Некоторые мелкие обломки могут присутствовать (рисунок 3А, белые наконечники стрел), но исчезнут при прохождении. Через четырнадцать дней после посева органоиды, полученные из AL, полностью развиты (рисунок 3A). Органоиды демонстрируют кистозную морфологию с эпителиальным слоем, который заключает в себе просвет. На этом этапе органоиды достигают диаметра 500 мкм и должны быть пройдены. На фиг.3В показана AL-полученная органоидная культура после прохождения в указанное время после повторного посева диссоциированных органоидных фрагментов.

Иногда в органоидной культуре может появляться одна или несколько плотных структур (рисунок 3А, неблагоприятный). При пассаже плотные органоиды, как правило, берут верх, попадая в культуры только с плотными структурами после пары проходов (рисунок 3B, Неблагоприятный). Поэтому рекомендуется не приступать к колодцам, содержащим плотные органоиды (пассаж 0). В качестве альтернативы, плотные органоиды могут быть отброшены путем осаждения, которое оставляет кистозные органоиды для продолжения. Происхождение этих плотных органоидов в настоящее время неясно, но они показывают менее выраженную гипофизарную природу18. Если органоиды этого не делают или менее эффективно восстанавливаются после прохождения, процедуры диссоциации должны быть оптимизированы. В частности, нужно обращать внимание на то, чтобы не диссоциировать слишком резко; органоиды должны быть разделены на фрагменты, а не на отдельные клетки (рисунок 3B, день 0, вставка).

Иммунофлуоресцентный анализ окрашивания подтверждает эпителиальный характер органоидов, полученных из AL, так как они экспрессируют эпителиальные маркеры E-кадгерин (E-Cad) и цитокератин 8/18 (CK8/18; Фиг.3С), которые, кроме того, были описаны как маркеры стволовых клеток в гипофизе18. Стволовая природа органоидов дополнительно демонстрируется экспрессией SOX2 и TROP2, оба из которых также были идентифицированы как маркеры стволовых клеток гипофиза (рисунок 3C)14,18. LHX3, транскрипционный фактор, специфически выраженный в (рано развивающемся) гипофизе, подтверждает фенотип гипофиза органоидов (рисунок 3C). Некоторые из органоидных клеток находятся в пролиферативном состоянии, экспрессируя маркер пролиферации Ki67 (рисунок 3C).

Дальнейшее исследование и валидация фенотипа гипофиза (стволовости) органоидов, полученных из AL, проводится с помощью обратной транскрипции-количественной ПЦР (RT-qPCR). Высокая экспрессия стволовых маркеров Sox2, Cdh1 (кодирующая E-Cad), Krt8, Krt18 и Trop2 присутствует в органоидах, явно выше, чем в первичном AL, что указывает на то, что органоиды обогащают стволовые клетки и, таким образом, представляют собой компартмент стволовых клеток AL, как описано ранее (рисунок 3D)18. Примечательно, что факторы транскрипции развития Pitx1 и Pitx2 остаются выраженными после развития в нескольких типах гормональных клеток в AL и, следовательно, их высокая экспрессия в AL. Культуры надежно сохраняют свой фенотип стволовости, о чем свидетельствует устойчивая (высокая) экспрессия этих маркеров после нескольких проходов (рисунок 3D).

Рисунок 1: Обзор создания, поддержания, характеристики и потенциала применения органоидов из здорового и больного гипофиза. AL, передняя доля; IL, промежуточная доля; ПЛ, задняя доля; МЗ, маргинальная зона; PitOM, органоидная среда гипофиза (создается с помощью BioRender.com). Ниши стволовых клеток в AL обозначены фиолетовым цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Выделение гипофиза у взрослой усыпленной мыши. Репрезентативные изображения, последовательно сделанные после (А) обезглавливания, (В) удаления кожи головы (переносица окружена), (В) открытия черепа и (D) удаления мозга, обнажающего гипофиз (окруженный). Стрелка указывает на PL, который отбрасывается (вместе с соответствующим IL), оставляя AL для изоляции и диссоциации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Установление и валидация органоидов, полученных из AL. (A) Посев клеток AL и развитие органоидов в PitOM в указанные дни (пассаж 0). Верхний ряд показывает благоприятный рост органоидов, развиваются только кистозные структуры. Нижний ряд показывает неблагоприятный рост с появлением большой плотной структуры (коробчатой). Белые наконечники стрелок указывают на мусор, черные наконечники стрел обозначают одиночные ячейки (увеличенные во вставке). (B) Органоидные фрагменты (увеличенные во вставке), посеянные при прохождении (день 0) и росте органоидов, как это наблюдалось через 7 дней. Верхний ряд показывает благоприятный органоидный рост, при этом растут только кистозные структуры. Нижний ряд показывает неблагоприятный отрастание с плотными органоидами, захватывающими культуру. (C) Иммунофлуоресцентное окрашивание E-Cad, SOX2, TROP2 (все красные), CK8/18, LHX3 и Ki67 (все зеленые) в органоидах, полученных из AL. Ядра помечены маркировкой Hoechst33342 (синий). Наконечники стрелок обозначают ячейки Ki67+. Указаны шкалы. (D) Анализ экспрессии генов маркеров стволовости (Sox2, Cdh1, Krt8, Krt18, Trop2) и факторов транскрипции развития (Pitx1, Pitx2) в первичных органоидах, полученных из AL и AL (Пассаж 0 означает 14 дней после посева клеток), определяемых с помощью RT-qPCR (среднее ± SEM). Точки данных представляют собой биологические реплики. Показаны значения порога дельта-цикла (dCT), рассчитанные по формуле: CT(ген интереса) - CT(родовой ген Actb). Чем позитивнее значение dCT (которое представлено на оси Y ниже нулевой оси X), тем ниже уровень экспрессии интересующего гена. Чем ниже (или более отрицательно) значение dCT, тем выше уровень выражения 14,18,21,22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1. Состав ПитОМ. PitOM фильтруют через сетчатый фильтр 0,22 мкм и хранят при 4 °C в течение максимум 2 недель.

Таблица 2. Состав среды А, В и С. Все материалы фильтруются через сетчатый фильтр 0,22 мкм и хранятся при 4 °C в течение максимум 4 месяцев. рН среды А и С должен быть скорректирован до 7,3.

Таблица 3. Состав криоконсервационной среды.

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.