Методическая статья

Разработка органоидов из мышиного гипофиза в качестве модели in vitro для изучения биологии стволовых клеток гипофиза

DOI:

10.3791/63431

⸱

25 февраля 2022 г.

 ,  , 
1Laboratory of Tissue Plasticity in Health and Disease, Cluster of Stem Cell and Developmental Biology, Department of Development and Regeneration, Leuven Stem Cell Institute, KU Leuven (University of Leuven)

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гипофиз является ключевым регулятором эндокринной системы организма. В этой статье описывается развитие органоидов из гипофиза мыши как новой 3D-модели in vitro для изучения популяции стволовых клеток железы, биология и функция которой остаются плохо изученными.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гипофиз является главной эндокринной железой, регулирующей ключевые физиологические процессы, включая рост тела, обмен веществ, половое созревание, размножение и реакцию на стресс. Более десяти лет назад стволовые клетки были идентифицированы в гипофизе. Однако, несмотря на применение трансгенных подходов in vivo , их фенотип, биология и роль остаются неясными. Чтобы справиться с этой загадкой, разработана новая и инновационная органоидная модель in vitro , чтобы глубоко разгадать биологию стволовых клеток гипофиза. Органоиды представляют собой 3D-клеточные структуры, которые при определенных условиях культивирования самостоятельно развиваются из стволовых клеток ткани (эпителия) и повторяют множественные признаки этих стволовых клеток и их ткани. Здесь показано, что органоиды, полученные из гипофиза мыши, развиваются из стволовых клеток железы и точно повторяют их фенотипические и функциональные характеристики in vivo . Среди прочего, они воспроизводят состояние активации стволовых клеток in vivo, происходящее в ответ на трансгенно нанесенное местное повреждение. Органоиды являются долгосрочными расширяемыми, сохраняя при этом свой фенотип ствола. Новая исследовательская модель очень ценна для расшифровки фенотипа и поведения стволовых клеток во время ключевых условий ремоделирования гипофиза, начиная от созревания новорожденных до связанного со старением увядания, и от здоровых до больных желез. Здесь представлен подробный протокол для установления органоидов, полученных из гипофиза мыши, которые обеспечивают мощный инструмент для погружения в еще загадочный мир стволовых клеток гипофиза.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гипофиз представляет собой крошечную эндокринную железу, расположенную у основания мозга, где она связана с гипоталамусом. Железа интегрирует периферические и центральные (гипоталамические) входы для генерации настроенного и скоординированного высвобождения гормонов, тем самым регулируя последующие эндокринные органы-мишени (такие как надпочечники и гонады) для производства соответствующих гормонов в нужное время. Гипофиз является ключевым регулятором эндокринной системы и поэтому по праву называется главной железой1.

Гипофиз мыши состоит из трех долей (рисунок 1), ....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эксперименты на животных для этого исследования были одобрены Этическим комитетом KU Leuven по экспериментам на животных (P153/2018). Все мыши были размещены в университетском животноводческом учреждении в стандартизированных условиях (постоянная температура 23 ± 1,5 ° C, относительная влажность 40%-60% и цикл день / ночь 12 ч), с доступом к воде и пище ad libitum.

1. Мыши

  1. Используйте коммерчески доступные штаммы мышей, такие как мыши C57BL/ 6J, молодого взрослого возраста (8-12 недель). В целом, 2-3 мыши обеспечивают достаточное количество AL-клеток для протокола.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

После выделения и диссоциации АЛ полученные одиночные клетки засевают в ECM и выращивают в PitOM (рисунок 1, таблица 1). На рисунке 3А показана клеточная культура и плотность при посеве (день 0). Некоторые мелкие обломки могут присутствовать (рисунок 3А, белые наконечники стрел), но исчезнут при прохождении. Через четырнадцать дней после посева органоиды, полученные из AL, полностью развиты (рис.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Органоиды, полученные из AL, как описано здесь, представляют собой мощную исследовательскую модель для изучения стволовых клеток гипофиза in vitro. В настоящее время этот органоидный подход является единственным доступным инструментом для надежного и надежного выращивания и расширения первичных стволовых клеток гипофиза. Ранее сообщалось о модели органоидов гипофиза, полученных из эмбриональных стволовых клеток (ESC) или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC), которая точно повторяет эмбриональны.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами Исследовательского фонда KU Leuven и Фонда научных исследований (FWO) - Фландрия. E.L. (11A3320N) и C.N. (1S14218N) поддерживаются докторской стипендией от FWO / FWO-SB.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-МеркаптоэтанолSigma-AldrichM6250
48-луночные планшеты, обработанные TC, индивидуально упакованныеCostar734-1607
A83-01Sigma-AldrichSML0788
Advanced DMEM/F12Gibco12634010
Альбумин бычий (класс клеточной культуры)Serva47330
B-27 Supplement ( 50X), минус витамин АGibco12587010
Базовые формыVWR720-1918
Буфер RLTQiagen79216
Кассеты, Q Path MicrotwinVWR720-2191
Клеточный фильтр, 40 & микро; м меш, одноразовыйFalcon352340
Токсин холеры от Vibrio choleraeSigma-AldrichC8052
Дезоксирибонуклеаза I из поджелудочной железы крупного рогатого скотаSigma-AldrichD5025
D-глюкозаMerck108342
диметилсульфоксид (ДМСО)Sigma-AldrichD2650
DMEM, порошок, пробиркиGibco52100039
Eppendorf Safe-Lock, 1,5 млEppendorf30120086
Адгезионные слайды Epredia SuperFrost PlusThermo Fisher ScientificJ1800AMNZ
Epredia HistoStar Embedding Workstation, от 220 до 240 В переменного токаThermo Fisher Scientific12587976
абсолютный этанол 99,8+%ThermoFisher Scientific
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Sigma-AldrichF7524
GlutaMAX ДобавкаGibco35050061
HEPESSigma-AldrichH4034
HEPES Буферный растворGibco15630056
InSolution Y-27632Sigma-Aldrich688001
L-глутамином (200 мМ)Gibco25030081
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR), контейнерCorning15505739
Mr. FrostyThermo Fisher Scientific5100-0001
N-2 Supplement (100X)Thermo Fisher Scientific17502048
N-ацетил-L-цистеинSigma-AldrichA7250
Nunc Biobanking and Cell Culture Криогенные пробиркиThermo Fisher Scientific375353
Параформальдегид для синтеза (PFA)Merck818715
PBS, pH 7,4Gibco10010023
пенициллин G натриевая сольSigma-AldrichP3032
Пенициллин-стрептомицин (10 000 Ед/мл)Gibco15140122
Феноловый красныйMerck107241
хлорид калия (KCl)Merck104936
рекомбинантный человеческий белок EGF, CFR& D systems236-EG
Рекомбинантный человеческий FGF базовый/FGF2/bFGF (157 aa) БелокR& D системы234-FSE
Рекомбинантный Человек FGF-10Пепротех100-26
Рекомбинантный Человек IGF-1Пепротех100-11
Рекомбинантный Человек ИЛ-6Пепротех200-06
Рекомбинантный Человек НоггинПепротех120-10C
Рекомбинантный Человек R-Спондин-1Пепротех120-38
Рекомбинантный человек/мышь FGF-8bPeprotech100-25
Рекомбинантная мышь Sonic Hedgehog/shh (C25II) N-TerminusR& D systems464-SH
RNeasy micro kitQiagen74004
SB202190Sigma-AldrichS7067
SeaKem LE AgaroseLonza50004
Sodium Chloride (NaCl)BDH102415K
Sodium di-Hydrogen Phosphate 1-hydratePanReac-AppliChemA1047
Sodium Гидрокарбонат (NaHCO3)Merck106329
натрий-пируват (C3H3NaO3)Sigma-AldrichP5280
Stericup-GP, 0,22 &; mMilliporeSCGPU02RE
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0,22 шт.; mMilliporeSCGP00525
Стерильная водаFreseniusB230531
Соль сульфата стрептомицинаSigma-AldrichS6501
Thermo Scientific Excelsior ES Тканевый процессорThermo Scientific12505356
Titriplex IIIMerck108418
TrypL Express Enzyme (1X), фенол красныйThermo Fisher Scientific12605028
Ингибитор трипсина из глицина max (соевые бобы)Sigma-AldrichT9003
раствор трипсина 2,5 %Thermo Fisher Scientific15090046
10342652 Матрица базальной мембраны для заморозки без LDEV

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Melmed, S. The pituitary. 3rd ed. , Elsevier/Academic Press. Cambridge. 1(2011).
  2. Chen, J., et al. The adult pituitary contains a cell population displaying stem/progenitor cell and early-embryonic characteristics. Endocrinology. 146 (9), 3985-3998 (2005).
  3. Chen,....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи