Метод двойного окрашивания для обнаружения пектина во взаимодействии растений и грибков

Краткое содержание

Этот протокол описывает микроскопический метод обнаружения пектина во взаимодействии кофе-гриба.

Аннотация

Растительные клетки используют различные структурные механизмы, конститутивные или индуцируемые, чтобы защитить себя от грибковой инфекции. Инкапсуляция является эффективным индуцируемым механизмом для выделения грибковой хаустории из протопласта растительных клеток. И наоборот, пектин, один из полимерных компонентов клеточной стенки, является мишенью нескольких пектолитических ферментов в некротрофных взаимодействиях. Здесь представлен протокол обнаружения пектина и грибковых гиф с помощью оптической микроскопии. Исследована богатая пектином инкапсуляция в клетках кофейных листьев, зараженных ржавчинным грибом Hemileia vastatrix , и модификация клеточной стенки мезофилла, индуцированная Cercospora coffeicola . Поврежденные образцы листьев фиксировали раствором Карновского, обезвоживали и внедряли в метакрилат гликоля в течение 2-4 дней. Все этапы сопровождались вакуумной накачкой для удаления воздуха в межклеточных пространствах и улучшения процесса встраивания. Встроенные блоки были разделены на участки толщиной 5-7 мкм, которые осаждались на стеклянной горке, покрытой водой, и впоследствии нагревались при 40 °C в течение 30 мин. Затем слайды были дважды окрашены 5% хлопкового синего цвета в лактофеноле для обнаружения грибка и 0,05% рутения красного в воде для обнаружения пектина (кислотные группы полиуроновых кислот пектина). Было обнаружено, что грибы Hemileia vastatrix инкапсулированы пектином. При кофейном церкоспориозе клетки мезофилла проявляли растворение клеточных стенок, наблюдались межклеточные гифы и конидиофоры. Метод, представленный здесь, эффективен для обнаружения пектин-ассоциированного ответа во взаимодействии растений и грибов.

Введение

Защитные механизмы клеточной стенки в растениях имеют решающее значение для сдерживания грибковой инфекции. Исследования сообщали об изменениях в толщине и составе клеточной стенки с^19-го века ^1,2. Эти изменения могут быть вызваны грибковым патогеном, который стимулирует образование сосочки, который предотвращает попадание грибов в клетку, или может быть использован для инкапсуляции гиф, чтобы изолировать протопласт клетки-хозяина от грибковой хаустории. Производство динамического барьера клеточной стенки (т.е. сосочков и полностью заключенного хаусториума) важно для повышения устойчивости растений<....

Протокол

1. Приготовление буферного раствора и реагентов

1. Приготовьте 2 М какодилатного буфера, добавив 4,28 г какодилата натрия к 100 мл дистиллированной воды и отрегулируйте рН до 7,25 с 0,2 N HCl.
2. Готовят 100 мл карновского фиксаторного раствора путем смешивания 10 мл 25% водного глутарового альдегида, 10 мл 10% водного формальдегида, 25 мл 2 М какодилатного буфера и 0,5 мл 0,5 мл 0,5 М CaCl₂²⁶. Восполнить объем до 100 мл дистиллированной водой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор можно хранить в холодильнике в течение 6 месяцев.
   ВНИМАНИЕ: Буферный раствор какодилата токсичен; поэтому обрабатывайте фиксирующий рас....

Результаты

Окрашивание лактофенола хлопкового синего цвета на секции, встроенной в GMA, выявило наличие нескольких грибковых структур между клетками кофейного мезофилла и внутри них как в биотрофных, так и в некротрофных грибковых взаимодействиях.

В биотрофической патосистеме при окрашивании методом двойного окрашивания гифы Hemileia vastatrix, содержащие клеточные стенки и плотное содержание протопласта, появляются темно-синим цветом как в губчатой, так и в частоколовой паренхиме (

Обсуждение

Настоящая работа вводит альтернативный гистохимический тест двойного окрашивания для исследования пектинового состава клеточных стенок, который инкапсулирует гаусторию в биотрофическую патосистему. Целью также является демонстрация эффективности метода обнаружения некротрофного грибка и вызванных им изменений клеточной стенки. Здесь пектин клеточных стенок кофейной паренхимы может инкапсулировать как шейку, так и хаусториум ржавого гриба Hemileia vastatrix. Silva et al. также описали инкапсуляцию целлюлозой и ка.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Лезвия DB80 HS	Leica	14035838383	Секционирование
Какодилатный буфер	EMS	# 11652	Фиксация
Ватный синий лактофенол	Metaquí слюда	70SOLSIG024629	Окрашивание
формальдегида	EMS	#15712	Фиксация
глутаральдегида	EMS#	16216
Фиксация Гистерин Набор	Техновит /EMS#	14653	Гисторзин для встраивания
Горячая пластина	Dubesser	SSCD25X30-110V	Окрашивание
Микроскопия	Zeiss	#490040-0030-000	Захват изображения
Микротом (Leica RM 2540)	Leica	149BIO000C1 14050238005	Секционирование
Пластиковый поддон для формовочных чашек	EMS	10176-30	Окрашивание
рутениево-красный	LABHouse	#006004	окрашивания
Axion Vision	Zeiss	#410130-0909-000	Захват изображений
Вакуумный насос	Prismatec	131 TIPO 2 V.C.	фиксация

Программное обеспечение для