Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Картирование резонансного переноса энергии Фёрстера: новая методология для выяснения глобальных структурных особенностей

1.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63433

⸱

16 марта 2022 г.

 ,  , 
1Molecular Biology and Biochemistry Department, Wesleyan University, 2Molecular Biophysics Program, Wesleyan University

В этой статье

Краткое содержание

В исследовании подробно описывается методология картирования FRET, включая выбор мест маркировки, выбор красителей, сбор и анализ данных. Эта методология эффективна при определении сайтов связывания, конформационных изменений и динамических движений в белковых системах и наиболее полезна, если выполняется в сочетании с существующей 3-D структурной информацией.

Аннотация

Резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) является признанным методом на основе флуоресценции, используемым для успешного измерения расстояний внутри и между биомолекулами in vitro , а также внутри клеток. В FRET эффективность передачи энергии, измеряемая изменениями интенсивности флуоресценции или времени жизни, относится к расстоянию между двумя флуоресцентными молекулами или метками. Определение динамики и конформационных изменений с расстояний является лишь некоторыми примерами применения этого метода к биологическим системам. При определенных условиях эта методология может дополнять и улучшать существующие рентгеновские кристаллические структуры, предоставляя информацию о динамике, гибкости и адаптации к связывающим поверхностям. Мы описываем использование FRET и связанных с ним определений расстояний для выяснения структурных свойств путем идентификации сайта связывания или ориентации субъединиц димера. Благодаря разумному выбору сайтов маркировки и часто использованию нескольких стратегий маркировки, мы успешно применили эти методы картирования для определения глобальных структурных свойств в комплексе белок-ДНК и системе транслокации белка SecA-SecYEG. В системе SecA-SecYEG мы использовали методы картирования FRET для идентификации сайта препротеин-связывания и определения локальной конформации области связанной последовательности сигналов. В этом исследовании описываются этапы выполнения картографических исследований FRET, включая идентификацию соответствующих мест маркировки, обсуждение возможных этикеток, включая ненативные аминокислотные остатки, процедуры маркировки, как выполнять измерения и интерпретацию данных.

Введение

Для белков выяснение динамики наряду с 3-мерными (3-D) структурными знаниями приводит к лучшему пониманию структурно-функциональных отношений биомолекулярных систем. Структурные методы, такие как рентгеновская кристаллография и криогенная электронная микроскопия, захватывают статическую структуру и часто требуют определения нескольких структур для выяснения аспектов связывания биомолекул и динамики1. В этой статье обсуждается основанный на решении метод отображения глобальных структурных элементов, таких как сайты связывания или взаимодействия привязки, которые потенциально более преходящи и менее легко захватываются статическими методами. Сильными системами-кандидатами для этой методологии являются те, в которых 3D-структура была ранее определена рентгеновской кристаллографией, ЯМР-спектроскопией или другими структурными методами. В этом случае мы используем рентгеновскую кристаллическую структуру комплекса SecA-SecYEG, центрального игрока в общем секреторном пути белка, для отображения местоположения сайта связывания сигнального пептида с использованием резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET) до переноса препротеина через мембрану2. Манипулирование биологической системой с помощью генетических модификаций в сочетании с нашими знаниями о 3D-структуре позволило определить конформацию сигнальной последовательности и ранней зрелой области непосредственно перед введением в канал 3.

FRET включает в себя безрадиационную передачу энергии от одной молекулы (донора) к другой (акцептору) в зависимости от расстояния, то есть через пространство 4,5. Эффективность этого переноса контролируется либо через уменьшение донора, либо через увеличение интенсивности акцепторной флуоресценции. Эффективность передачи энергии можно охарактеризовать как

E = R06/(R06 + R6)

в котором значение R0 — это расстояние, на котором передача эффективна на 50%6. Методика ранее была описана как молекулярная линейка и эффективна при определении расстояний в диапазоне 2,5-12 нм в зависимости от идентичности донор-акцепторных красителей 4,7,8,9. Интенсивность и срок службы донорской флуоресценции с акцептором или без него позволяют определить эффективность переноса и, следовательно, расстояния 5,8. Благодаря доступности технологии, чувствительности метода и простоте использования, FRET также нашел широкое применение в таких областях, как одномолекулярная флуоресцентная спектроскопия и конфокальная микроскопия6. Появление флуоресцентных белков, таких как зеленый флуоресцентный белок, сделало наблюдение за внутриклеточной динамикой и визуализацией живых клеток относительно легким10,11. Многие приложения FRET, подобные этим, подробно обсуждаются в этом виртуальном выпуске.

В этом исследовании мы уделяем особое внимание использованию измерений FRET для получения значений расстояния для определения структурных деталей. Ранее измерения FRET эффективно использовались для определения конформации молекул ДНК при связывании с белком 12,13,14, внутренней динамики белков и белковосвязывающих взаимодействий 15,16,17. Преимущества этого метода заключаются в возможности определения гибких и динамичных конструктивных элементов в растворе с относительно небольшим количеством материала. Примечательно, что этот метод особенно эффективен при использовании в сочетании с существующей структурной информацией и не может быть использован в качестве средства определения 3D-структуры. Метод обеспечивает наилучшее понимание и уточнение структуры, если работа основывается на существующей структурной информации, часто в сочетании с вычислительным моделированием18,19. Здесь описано использование расстояний, полученных из стационарных и разрешенных по времени измерений FRET, для картирования сайта связывания, местоположение которого не было известно, на существующей кристаллографической структуре комплекса SecA-SecYEG основных белков в общем секреторном пути3.

Общий секреторный путь, высококонсервативная система от прокариот до эукариот и архей, опосредует транспорт белков либо через мембрану, либо в мембрану к их функциональному расположению в клетке. Для грамотрицательных бактерий, таких как E. coli, организма, используемого в нашем исследовании, белки вставляются или перемещаются через внутреннюю мембрану в периплазму. Бактериальный комплекс каналов SecY (называемый транслоконом) координируется с другими белками для перемещения вновь синтезированного белка, который направляется к его правильному расположению в клетке через сигнальную последовательность, обычно расположенную на N-конце20,21. Для белков, связанных с периплазмой, белок АТФазы SecA связывается с выходным туннелем рибосомы и с препротеином после того, как приблизительно 100 остатков были переведены22. Наряду с белком шаперона SecB он поддерживает препротеин в развернутом состоянии. SecA связывается с транслоконом SecYEG и через многие циклы гидролиза АТФ облегчает транспорт белка через мембрану23,24.

SecA представляет собой многодоменный белок, который существует в цитозольной и мембраносвязанной формах. Гомодимерный белок в цитозоле, SecA состоит из препротеин-связывающего или сшивающего домена25, двух нуклеотид-связывающих доменов, спирального домена крыла, спирального каркасного домена и двух спиральных пальцев (THF)26,27,28,29 (Рисунок 1). В предыдущих кристаллографических исследованиях комплекса SecA-SecYEG расположение ТГФ предполагало, что он активно участвовал в транслокации белка, а последующие эксперименты по сшиванию с сигнальным пептидом дополнительно установили значение этой области в транслокации белка 30,31. Предыдущие исследования с использованием методологии картирования FRET показали, что экзогенные сигнальные пептиды связываются с этой областью SecA 2,32. Чтобы полностью понять конформацию и местоположение сигнальной последовательности и ранней зрелой области препротеина до вставки в канал SecYEG, была создана белковая химера, в которой сигнальная последовательность и остатки ранней зрелой области были прикреплены к SecA через линкер Ser-Gly (рисунок 1). Используя эту биологически жизнеспособную конструкцию, было дополнительно продемонстрировано, что сигнальная последовательность и ранняя зрелая область препротеина связываются с ТГФ параллельным образом2. Впоследствии методология картирования FRET была использована для выяснения конформации и местоположения последовательности сигналов и ранней зрелой области в присутствии SecYEG, как описано ниже3.

Знание 3-D структуры комплекса SecA-SecYEG 33,34,35 и возможного местоположения места связывания позволило нам разумно разместить донорско-акцепторные этикетки в местах, где пересечение отдельных расстояний FRET определяет местоположение места связывания. Эти измерения картирования FRET показали, что последовательность сигналов и ранняя зрелая область препротеина образуют шпильку с наконечником, расположенным в устье канала SecYEG, демонстрируя, что структура шпильки шаблонизируется до вставки канала.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подбор сайтов маркировки

  1. Определите по меньшей мере три потенциальных участка маркировки для триангуляции предполагаемого сайта связывания на существующих белковых структурах. В этом случае были идентифицированы SecA, SecYEG и препротеин, присоединенный к SecA посредством генетического слияния2.
    1. Выберите сайты маркировки в пределах 25-75 Å от предполагаемого сайта связывания и в относительно статических областях белка расстояние будет определять конкретную пару красителей FRET, которая будет использоваться36. Расположите сайты маркировки в белковых областях, которые относительно отличаются друг от друга, поэтому сайты описывают вершины треугольника с предполагаемым сайтом связывания, расположенным в центре (рисунок 1A-D).
    2. Вводить или идентифицировать остатки цистеина (Cys) в местах маркировки, представляющих интерес в белке, который не имеет других остатков Cys, для повышения эффективности маркировки конкретного участка37,38.
    3. Вводят ненатуральные аминокислоты, например,-азидофенилаланин для маркировки с помощью щелочной химии, чтобы эффективно маркировать один белок в двух различных положениях с разными красителями39,40.
    4. Протестируйте мутантов Cys на потерю функции. Проверьте активность мутанта без Cys и неестественного аминокислотного мутанта с помощью соответствующего анализа активности. В этом случае активность была проверена с помощью анализа роста, за которым последовал анализ in vitro малахитовой зеленой АТФазы 32,41,42

2. Маркировка белка

  1. Очистите интересующий белок или белки не менее 95% чистоты для точной маркировки. Очищайте белки SecA и SecYEG в соответствии с протоколами, описанными в ссылке3. Убедитесь, что у вас есть по крайней мере 5 мкг очищенного белка для этого этапа, так как часть белка будет потеряна в процессе маркировки.
  2. Выберите два красителя для измерений FRET в зависимости от их значения R0 и прогнозируемых расстояний между маркированными участками. Оцените значения R0 и наблюдайте за перекрытием выбросов доноров и абсорбции акцепторов, используя информацию из базы данных флуоресцентных белков, которая также дает спектры для часто используемых красителей (https://www.fpbase.org/spectra/)36.
    ПРИМЕЧАНИЕ: R0 определяется как расстояние, на котором эффективность передачи составляет 50% для данной пары красителей. Для картографических экспериментов прогнозируемые расстояния должны быть близки к значению R0 пары красителей, чтобы обеспечить точное измерение расстояний.
  3. Обозначьте позиции, указанные на этапе 1.1.1. с парой донор-акцептор краситель.
    1. Маркируют белок в соответствии с инструкциями производителя с особым вниманием к таким параметрам, как оптимальная концентрация белка, температура, рН, продолжительность времени и буфер для конкретных используемых красителей43,44.
    2. Готовят белок в концентрации 1-2 мг/мл или приблизительно 10 мкМ в буфере 25 мМ Tris-HCl (рН 7,5), 25 мМ KCl, 1 мМ ЭДТА (TKE). Растворить краситель в диметилформамиде (ДМФ) или диметилсульфоксиде (ДМСО) до конечной концентрации 1 мМ. Добавьте краситель по каплям в раствор во время перемешивания, чтобы достичь красителя: молярного соотношения белка 5:1 (краситель 50 мкМ: белок 10 мкМ).
    3. Дайте реакции продолжаться в течение 4 ч при комнатной температуре (RT) в стеклянном флаконе с мягким раскачиванием или на ночь при 4 °C. Остановите реакцию, добавив β-меркаптоэтанол.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если белок не совместим с буфером Tris, можно использовать фосфатные или HEPES буферы. Поддерживать pH в диапазоне 7,0-7,5. Если белок имеет дисульфидные связи, добавьте восстановитель, такой как DTT или TCEP, перед маркировкой. Удалите DTT путем диализа или гелевой фильтрации перед добавлением красителя.
  4. Для точных измерений FRET удалите свободный краситель с помощью центробежного концентратора с соответствующей отсечкой молекулярной массы (MWCO), чтобы позволить свободному красителю протекать, сохраняя при этом меченый белок.
    1. Подготовьте мембрану концентратора, поместив ~ 1 мл воды в верхнюю часть концентратора объемом 3 мл, а затем центрифугируйте воду через мембрану (не менее 10 мин при 4 300 х г).
    2. Удаляют свободный краситель путем центрифугирования меченого образца в концентраторе (20 мин при 4 300 х г). Повторите 3-4 раза и утилизируйте поток.
    3. Проверьте эффективность маркировки меченого белка с помощью абсорбционной спектроскопии UV-Vis.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Измерения FRET требуют эффективности маркировки 50% или выше. Более низкая эффективность маркировки снижает сигнал FRET и может привести к неточностям в измерении.
    4. Получают UV-Vis спектр меченого белка с диапазоном от 250-700 нм для наблюдения как за полосой поглощения белка, так и за полосой максимального поглощения красителя. Измеряют абсорбцию на пике поглощения красителя и при 280 нм для белка.
    5. Определите концентрацию белка и скорректируйте любые вклады красителя, используя поправочный коэффициент CF и следующие уравнения45,46:
      figure-protocol-1
      где C - концентрация белка (M), A280 - абсорбция образца при 280 нм, Amax - абсорбция на максимуме поглощения красителя, ε белок - коэффициент вымирания для белка при 280 нм, а CF - поправочный коэффициент, A'280/A'max, где A'280 - абсорбция при 280 нм, а A'max - абсорбция на пиковом максимуме только для красителя.
    6. Определите эффективность маркировки с помощью следующего уравнения:
      figure-protocol-2
      где εкраситель - коэффициент молярного вымирания красителя, С - концентрация белка, определенная на этапе 2.4.5, а Е - эффективность маркировки. Повторяйте шаг 2.4.2 до тех пор, пока значение эффективности маркировки не стабилизируется и не составит менее 100%.

3. Определите значения R 0

  1. Измерьте значения R0 in situ. Подготовьте два образца белка в той же концентрации общего белка, 4 мкМ, один с белком, помеченным только донорским красителем, и один с белком, помеченным только акцепторным красителем. Для SecA концентрация белка 4 мкМ мономера SecA хорошо работает для этих измерений.
    1. Подготовьте объем образца 2,5 мл для кюветы 1 см x 1 см, 600 мкл для кюветы 5 мм x 5 мм или 200 мкл для кюветы 3 мм x 3 мм.
  2. Включите флуорометр и откройте программу спектрального сбора и анализа в флуоресцентном программном обеспечении при использовании спектрофлуфлюорометра. Нажмите на красный M , чтобы подключить компьютер к прибору (рисунок 2A) и выберите Спектры излучения.
    1. Введите параметры сканирования, такие как длина волны возбуждения, диапазон сканирования излучения, температура и положение устройства смены образцов с помощью пункта меню Collect Experiment (рисунок 2B).
    2. Нажмите на RTC и оптимизируйте настройки прибора (например, спектральные щели) путем мониторинга флуоресцентного излучения на пике с использованием длины волны возбуждения, установленной на максимуме поглощения красителя. Для SecA установите следующие настройки: полоса пропускания равна 1 нм; отверстия возбуждения и излучения составляют 1 и 1,5 мм соответственно, с температурой 25 °C и скоростью перемешивания при 250 об/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте количество секунд (cps) производительности прибора (обычно 2 x 106 cps).
  3. Поместите помеченный донором образец белка в держатель образца и нажмите кнопку Выполнить , чтобы создать сканирование выбросов белка, помеченного только донорским красителем (только донорский белок), возбуждая образец на максимуме поглощения красителя (например, 488 нм для AF488) и сканируя пик выбросов (505-750 нм для донорского белка SecA, помеченного AF488).
  4. Установите базовый уровень для сканирования, расширив сканирование на 25-50 нм после конца пика. Измерьте квантовый выход донорского белка, выполнив измерения абсорбции и флуоресценции на образцах различных концентраций, как описано47. Поддерживайте те же настройки щели для этих измерений.
    1. Используйте свободный донорский краситель в качестве эталона для квантового выхода. Получите по меньшей мере четыре измерения только донорского белка и свободного красителя в разных концентрациях для точного определения.
    2. График интенсивности флуоресценции или интегрированной области по сравнению с абсорбцией для белка, предназначенного только для донора, и свободного красителя или эталона. Определите склоны для донорского белка (SlopeD) и эталонного (SlopeR).
    3. Квантовый выход (Φ) рассчитывается по следующему уравнению:
      figure-protocol-3
      здесь ΦD - квантовый выход только донорского белка, ΦR - квантовый выход свободного красителя (это обычно можно получить у производителя), SlopeD и SlopeR - наклоны, определенные на шаге 3.4.2 для донорского только белка и эталона, соответственно и ηD и ηR представляют собой показатель преломления донорского белка и нереференсных растворов красителей, соответственно 47.
  5. Получите спектр поглощения вашего акцепторного белка, используя клетку длиной 1 см. Сгенерируйте спектр коэффициента вымирания вашего белка, предназначенного только для акцептора, разделив спектр поглощения на концентрацию красителя.
  6. Сгенерируйте интеграл спектрального перекрытия, J (λ) с помощью программы графического анализа. Для этого процесса также может использоваться стандартная программа для работы с рабочими листами (например, электронная таблица).
    1. Умножьте спектр флуоресцентного излучения донорского белка (этап 3.4) на спектр коэффициента вымирания белка только акцептора, чтобы получить спектр перекрытия.
    2. Умножьте результирующий спектр перекрытия на λ4.
    3. Определите площадь под кривой путем интеграции области перекрытия. Область перекрытия определяется как область, где спектр донорского излучения, умноженный на спектр коэффициента вымирания акцептора, дает положительные значения. Интеграл спектрального перекрытия определяется как:
      figure-protocol-4
      где FD (λ) - спектр излучения только донорского белка (полученного на стадии 3.4), а εA(λ) - спектр коэффициента вымирания белка, содержащего только акцептор, и имеет единицы M-1 см-1 (полученные на стадии 3.5). Полученный интеграл спектрального перекрытия должен иметь единицы М-1 см-1нм4.
    4. Нормализуйте интеграл спектрального перекрытия. Разделите интеграл перекрытия на интегрированную область спектра только донорского белка в том же спектральном диапазоне:
      figure-protocol-5
    5. Вычислите значение R0 в Å, используя следующее уравнение:
      figure-protocol-6
      где κ2 - коэффициент ориентации, обычно принимаемый как 2/3 для свободно вращающихся красителей, η - показатель преломления и может быть аппроксимирован как 1,33 для разбавленных водных растворов, QD - квантовый выход донора (шаг 3.4) и J(λ) - спектральный интеграл перекрытия, как определено в шаге 3.6.35. ПРИМЕЧАНИЕ: Если красители не вращаются свободно, могут быть введены поправки, описанные Ивановым 48 и реализованные Оклером49 иЧжаном 2,3.

4. Выполнение спектральных измерений FRET

  1. Подготовка образцов только донорского белка, только акцепторного белка и донорско-акцепторного белка в одной и той же концентрации; рекомендуется концентрация 4 мкМ. Используйте 200 мкл раствора, если используется кювета 3 мм x 3 мм, 600 мкл, если используется кювета 5 мм x 5 мм, или 2,5 мл, если используется кювета 1 см x 1 см.
    1. Подготовьте образец донорско-акцепторного белка, используя равные молярные количества только донора и только акцепторного белка.
    2. Поддерживать одинаковое количество меченого образца только в контрольных донорских и только акцепторных образцах белка путем введения немаркированного белка в равном молярном количестве либо в донорские, либо только акцепторные образцы. Например, для растворов одинаковой концентрации каждый образец FRET, предназначенный только для донора, будет содержать 100 мкл донорского белка и 100 мкл немаркированного белка на объем 200 мкл.
  2. Генерация флуоресцентных спектров излучения только донора, только акцептора и донора-акцептора образцов. Оптимизируйте сигнал, как описано в шаге 3.2. После оптимизации поддерживайте одинаковые настройки для всех образцов.
    1. Получите сканирование только для доноров, как описано в шаге 3.3. Возбуждайте раствор на максимуме поглощения донорского красителя и сканируйте над донором и (ожидаемым) пиком излучения акцептора.
    2. Либо замените образец на белок, поддерживающий только акцептор, либо измените положение устройства смены образца на кювету, содержащую белок, содержащий только акцепторный белок.
    3. Получите сканирование излучения белка, меченого только акцепторным красителем (только акцепторным белком), используя те же настройки, что и на этапе 4.2.1. Возбуждайте образец на длине волны возбуждения донора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот спектр обеспечивает коррекцию количества акцептора, возбуждаемого на длине волны донора (FA на шаге 5.1.2)
    4. Замените образец на образец донорско-акцепторного белка или измените положение сменщика образца на кювету, содержащую меченый донор-акцептор белка.
    5. Получить сканирование излучения образца донорно-акцепторного белка с использованием тех же настроек, что и на этапах 4.2.1 и 4.2.3.
    6. Для всех спектров исправьте фоновую флуоресценцию, вычитая количество фона, измеренное в конце сканирования.
  3. Измерьте срок службы донора только донора и образцы донора-акцептора, подготовленные в соответствии с описанием, описанным в шаге 4.1.2. Используйте коррелированный по времени флуоресцентный прибор для подсчета одиночных фотонов, способный измерять и разрешать флуоресцентные распады в наносекундном (10-9 с) временном диапазоне.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для пар красителей FRET сопоставьте источник света возбуждения с максимальным поглощением донорского красителя.
    1. Включите прибор. Откройте программное обеспечение для сбора, используйте программное обеспечение управления прибором для сбора данных с помощью флуоресцентного спектрометра.
    2. Для получения выберите TCSPC Decay с временным диапазоном 55 нс, коэффициентом усиления 1 и 4096 каналов.
    3. Получите функцию отклика прибора (IRF) с помощью раствора немолочного сливочного или коммерческого раствора для рассеяния и контролируйте рассеяние при 490 нм. Отрегулируйте настройку щели и используйте фильтры нейтральной плотности по мере необходимости для поддержания достаточно низкой скорости подсчета, чтобы избежать нагромождения импульсов5. Нажмите кнопку Принять , а затем Запустить. Это положит начало приобретению.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальная скорость подсчета 4000 cps используется для частоты повторения 180 кГц.
    4. Собирайте IRF при 490 нм до тех пор, пока пиковый канал не достигнет максимум 20 000 отсчетов. Соберите IRF до и после измерения каждого флуоресцентного распада.
    5. Получение флуоресцентных распадов только донорских и донор-акцепторных образцов путем мониторинга флуоресцентного излучения на длине волны донорского излучения, 520 нм.
    6. Настройте параметры щели для максимальной скорости подсчета 4000 cps или меньше. Настройки щелей обычно составляют полосу пропускания 15-20 нм для образцов белка. Собирайте распад до тех пор, пока в пиковом канале не будет получено 20 000 отсчетов.
  4. Анализ распада или интенсивности флуоресценции (I) в зависимости от времени (t) для времени жизни флуоресценции (τ). Приведите распад к сумме экспоненциалов со следующим уравнением:
    figure-protocol-7
    где αI — преэкспоненциальный множитель i-й компонента, а τI — время жизни. Припадок повторно конвуируется с IRF, чтобы соответствовать флуоресцентному распаду. Судите о качестве посадки по сниженным параметрам Χ2.

5. Анализ данных FRET

  1. Рассчитать эффективность FRET исходя из снижения донорской интенсивности донорско-акцепторной выборки относительно донора только с помощью следующего уравнения.
    figure-protocol-8
    где FDA - интенсивность флуоресценции образца донора-акцептора, а FD - интенсивность флуоресценции образца только донора на пике донорской флуоресценции. Используйте интегрированные области пиков, если данные зашумлены.
    1. Корректируйте любые различия в маркировке между образцами только донора и образцами донора-акцептора. Рассчитайте корректировки на основе донорской степени маркировки следующим образом.
      figure-protocol-9
      где fDA - эффективность маркировки доноров в образце донора-акцептора, а fD - эффективность маркировки в образце, предназначенном только для донора.
    2. С поправкой на любые вклады акцепторной флуоресценции в донор-возбужденный спектр путем вычитания только акцепторного белкового спектра (шаг 4.2) из донорско-акцепторного белкового спектра.
      figure-protocol-10
    3. С поправкой на различия в эффективности маркировки акцепторного только белка относительно образца донор-акцепторного белка получается следующее уравнение для расчета эффективности:
      figure-protocol-11
      где fA обозначает дробное количество маркировки акцептора. Это уравнение включает в себя все поправки, обусловленные маркировкой красителя и акцепторной флуоресценцией.
    4. Рассчитайте расстояния FRET от эффективности, используя следующее уравнение:
      figure-protocol-12
      используя значение R0 , полученное на шаге 3.6.5.
    5. Расчет эффективности FRET с использованием сроков флуоресценции только донорских и донорско-акцепторных образцов, измеренных на этапе 4.3.3-4.3.5:
      figure-protocol-13
    6. Используйте амплитудно-взвешенный срок службы для расчета эффективности FRET и сравнения с стационарными результатами5.
      figure-protocol-14
    7. Рассчитайте расстояние, как показано на шаге 5.1.4, от эффективности, определяемой временем жизни флуоресценции. Сравните стационарные и разрешенные по времени значения эффективности и расстояний FRET и убедитесь, что они находятся в пределах погрешности друг друга.

6. Отображение расстояний

  1. Используйте вычисляемые расстояния для отображения сайта привязки на трехмерную структуру. Рассчитайте расстояния и погрешности для всех исследованных пар красителей и местоположений с использованием уравнения, приведенного на шаге 5.1.4, и значений R0 , полученных на этапе 3.6.5 для каждой пары FRET.
    1. Используйте 3D-графическую программу просмотра, такую как PyMOL50 , чтобы сопоставить расстояния со структурой (скрипт, приведенный в дополнительном файле). Команды из скрипта могут быть непосредственно введены в командное окно с соответствующей информацией о расстоянии.
    2. Сгенерируйте оболочку для каждого измеренного расстояния и связанной с ним погрешности (рисунок 3, рисунок 4, дополнительные рисунки 1-3).
    3. Нанесите на карту положение через пересечение различных раковин (дополнительные рисунки 1-3). Сайт связывания сигнального пептида был нанесен на карту через три различных места на SecA и SecYEG и четыре разных места на сигнальном пептиде (рисунок 1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Это исследование было сосредоточено на определении местоположения сайта связывания препротеинов на SecA до введения препротеина в канал SecYEG. Чтобы отобразить место связывания, эксперименты FRET проводились между различными областями препротеина и тремя различными местами на белках SecA и SecYEG (рисунок 1A-D). По полученным расстояниям и трехмерным структурам SecA, SecYEG и препротеина прогнозировалось местоположение сайта связывания препротеинов. Вместо ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Используя методологию картирования FRET, мы идентифицировали сайт связывания сигнальной последовательности на белке SecA. Важно отметить, что наличие 3-D кристаллической структуры комплекса значительно облегчило наше исследование. Сила этой методологии картографирования заключается в способности использовать существующую структуру для определения мест для маркировки. Эта методология не может быть использована для определения 3D-структуры; однако определение структурных элементов56, уточнение сущес...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом Национальных институтов здравоохранения R15GM135904 (присуждается IM) и грантом Национальных институтов здравоохранения GM110552 (присуждается DBO).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
490 нм светодиодный лазерHoriba1684-LED
Alexa Fluor 647 C2 Малеимид//DIBO AlkyneLife TechnologiesA20347
АгарDifcoDF0812
Alexa Fluor 488 C5 Малеимид/DIBO AlkyneLife TechnologiesA10254
Alexa Fluor 488 DIBO AlkyneLife TechnologiesS10904
Alexa Fluor 647 DIBO AlkyneLife TechnologiesS10906
Amicon Ultra­ 4 Центробежный фильтр (50 кДа MWCO)SigmaUFC805008
додецилмальтозид (DDM)AnatraceD310
E. coli сигнальный пептид щелочной фосфатазы SP22Biomolecules MidwestN/AСинтезированный пользовательский продукт
расширенный сигнальный пептид SP41Biomolecules MidwestN/AСинтезированный пользовательский продукт
FluorEssenceHoribaверсии 2.4для спектрофлуориметра Fluoromax4
Спектрофлуориметр Fluoromax 4HoribaN/A
GlobalsWEЛаборатория флуоресцентной динамики, Калифорнийский университет, Ирвайнпрограмма спектрального анализа для распадов с временным разрешением
H­ 4&sted; Azido­ Фе­ OHBACHEM4020250.0001
LB (Miller) БульонFisher ScientificBP9723
Ludox HS-40 коллоидный диоксид кремния (40 мас.% суспензии в H2O)Сигма-Олдрич420816разбавление необходимо для получения правильного рассеивающего раствора
PTI Felix GXHoribaверсия 4.1.0.4096программа сбора спектральных данных для PTI Time Master Instrument
PTI Time Master ПриборHoribaNA
Pymol Программа молекулярной графикиSchrodingerверсия 2.4
Водяная баняThermo ScientificNESLAB RTE 10
Программа сбора спектральных данных

Ссылки

  1. Thompson, M. C., Yeates, T. O., Rodriguez, J. A. Advances in methods for atomic resolution macromolecular structure determination. F1000Research. 9, (2020).
  2. Zhang, Q., Li, Y., Olson, R., Mukerji, I., Oliver, D. Conserved SecA signal peptide-binding site revealed by engineered protein chimeras and Forester resonance energy transfer. Biochemistry. 55 (9), 1291-1300 (2016).
  3. Zhang, Q., et al. Alignment of the protein substrate hairpin along the SecA two-helix finger primes protein transport in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9343-9348 (2017).
  4. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).
  5. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. Boston, MA. (2006).
  6. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  7. Magde, D., Wong, R., Seybold, P. G. Fluorescence quantum yields and their relation to lifetimes of rhodamine 6G and fluorescein in nine solvents: improved absolute standards for quantum yields. Photochemistry and Photobiology. 75 (4), 327-334 (2002).
  8. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods in Enzymology. 211, 353-388 (1992).
  9. Scientific, T. F. R0 Values from Some Alexa Fluor Dyes - Table 1.6. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/tables/r0-values-for-some-alexa-fluor-dyes.html (2021).
  10. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors. 16 (9), Basel, Switzerland. 1488(2016).
  11. Day, R. N., Davidson, M. W. Fluorescent proteins for FRET microscopy: monitoring protein interactions in living cells. BioEssays : News and Reviews in Molecular, Cellular, and Developmental Biology. 34 (5), 341-350 (2012).
  12. Lee, S. J., Syed, S., Ha, T. Single-Molecule FRET Analysis of Replicative Helicases. Methods in Molecular Biology. 1805, Clifton, N.J. 233-250 (2018).
  13. Uhm, H., Hohng, S. Single-Molecule FRET Assay for Studying Cotranscriptional RNA Folding. Methods in Molecular Biology. 2106, 271-282 (2020).
  14. Globyte, V., Joo, C. Single-molecule FRET studies of Cas9 endonuclease. Methods in Enzymology. 616, 313-335 (2019).
  15. Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. Single-Molecular Förster Resonance Energy Transfer Measurement on Structures and Interactions of Biomolecules. Micromachines. 12 (5), 492(2021).
  16. Catipovic, M. A., Bauer, B. W., Loparo, J. J., Rapoport, T. A. Protein translocation by the SecA ATPase occurs by a power-stroke mechanism. The EMBO Journal. 38 (9), 101140(2019).
  17. Seinen, A. B., Spakman, D., van Oijen, A. M., Driessen, A. J. M. Cellular dynamics of the SecA ATPase at the single molecule level. Scientific Reports. 11 (1), 1433(2021).
  18. Dimura, M., et al. Quantitative FRET studies and integrative modeling unravel the structure and dynamics of biomolecular systems. Current Opinion in Structural Biology. 40, 163-185 (2016).
  19. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nature Methods. 9 (12), 1218-1225 (2012).
  20. Paetzel, M. Structure and mechanism of Escherichia coli type I signal peptidase. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (8), 1497-1508 (2014).
  21. Ng, D., Brown, J., Walter, P. Signal sequences specify the targeting route to the endoplasmic reticulum membrane. The Journal of Cell Biology. 134 (2), 269-278 (1996).
  22. Huber, D., et al. SecA Cotranslationally Interacts with Nascent Substrate Proteins In Vivo. Journal of Bacteriology. 199 (2), 00622(2017).
  23. Lill, R., et al. SecA protein hydrolyzes ATP and is an essential component of the protein translocation ATPase of Escherichia coli. The EMBO Journal. 8 (3), 961-966 (1989).
  24. Lill, R., Dowhan, W., Wickner, W. The ATPase activity of SecA is regulated by acidic phospholipids, SecY, and the leader and mature domains of precursor proteins. Cell. 60 (2), 271-280 (1990).
  25. Kimura, E., Akita, M., Matsuyama, S., Mizushima, S. Determination of a region of SecA that interacts with presecretory proteins in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6600-6606 (1991).
  26. Hunt, J. F., et al. Nucleotide control of interdomain interactions in the conformational reaction cycle of SecA. Science. 297 (5589), New York, N.Y. 2018-2026 (2002).
  27. Sharma, V., et al. Crystal structure of Mycobacterium tuberculosis SecA, a preprotein tranlsocating ATPase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2243-2248 (2003).
  28. Vassylyev, D., et al. Crystal structure of the translocation ATPase SecA from Thermus thermophilus reveals a parallel, head-to-head dimer. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 248-258 (2006).
  29. Zimmer, J., Li, W., Rapoport, T. A. A novel dimer interface and conformational changes revealed by an X-ray structure of B. subtilis SecA. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 259-265 (2006).
  30. Zimmer, J., Rapoport, T. A. Conformational flexibility and peptide interaction of the translocation ATPase SecA. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 606-612 (2009).
  31. Bauer, B. W., Rapoport, T. A. Mapping polypeptide interactions of the SecA ATPase during translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (49), 20800-20805 (2009).
  32. Auclair, S., et al. Mapping of the signal peptide-binding domain of Escherichia coli SecA using Förster resonance energy transfer. Biochemistry. 49 (4), 782-792 (2010).
  33. Zimmer, J., Nam, Y., Rapoport, T. A. Structure of a complex of the ATPase SecA and the protein-translocation channel. Nature. 455 (7215), 936-943 (2008).
  34. Li, L., et al. Crystal structure of a substrate-engaged SecY protein-translocation channel. Nature. 531 (7594), 395-399 (2016).
  35. Ma, C., et al. Structure of the substrate-engaged SecA-SecY protein translocation machine. Nature Communications. 10 (1), 2872(2019).
  36. Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
  37. Jilaveanu, L. B., Oliver, D. In vivo membrane topology of Escherichia coli SecA ATPase reveals extensive periplasmic exposure of multiple functionally important domains clustering on one face of SecA. The Journal of Biological Chemistry. 282 (7), 4661-4668 (2007).
  38. Ramamurthy, V., Oliver, D. Topology of the integral-membrane form of Escherichiacoli SecA protein. The Journal of Biological Chemistry. 272 (37), 23239-23246 (1997).
  39. Chin, J., et al. Addition of p-Azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  40. Deiters, A., et al. Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharomyces cerevisiae. Journal of the American Chemical Society. 125 (39), 11782-11783 (2003).
  41. Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Analytical Biochemistry. 100 (1), 95-97 (1979).
  42. Mitchell, C., Oliver, D. B. Two distinct ATP-binding domains are needed to promote protein export by Escherichia coli SecA ATPase. Molecular Microbiology. 10 (3), 483-497 (1993).
  43. Thiol-reactive Probe Labeling Protocol. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/labeling-chemistry-protocols/thiol-reactive-probe-labeling-protocol.html (2021).
  44. Click Chemistry - Section 3.1. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/reagents-for-modifying-groups-other-than-thiols-or-amines/click-chemistry.html (2021).
  45. Correction Factor. AAT Bioquest. , Available from: https://www.aatbio.com/resources/correction-factor/ (2019).
  46. Calculate dye:protein (F/P) molar ratios. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://tools.thermofischer.com/content/sfs/brochures/TR0031-Calc-FP-rations.pdf (2011).
  47. A Guide to Recording Fluorescence Quantum Yields. Horiba Scientific. , Available from: https://static.horiba.com/fileadmin/Horiba/Application/Materials/Material_Research/Quantum_Dots/quantumyieldstrad.pdf (2011).
  48. Ivanov, V., Li, M., Mizuuchi, K. Impact of emission anisotropy on fluorescence stectroscopy and FRET distance measurements. Biophysical Journal. 97 (3), 922-929 (2009).
  49. Auclair, S., Oliver, D., Mukerji, I. Defining the solution state dimer structure of Escherichia coli SecA using Forster resonance energy transfer. Biochemistry. 52 (14), 2388-2401 (2013).
  50. The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.4. , Schrodinger, LLC. New York. Available from: https://pymol.org/2/ (2021).
  51. Musial-Siwek, M., Rusch, S. L., Kendall, D. A. Selective photoaffinity labeling identifies the signal peptide binding domain on SecA. Journal of Molecular Biology. 365 (3), 637-648 (2007).
  52. Miller, A., Wang, L., Kendall, D. A. Synthetic signal peptides specifically recognize SecA and stimulate ATPase activity in the absence of preprotein. The Journal of Biological Chemistry. 273 (19), 11409-11412 (1998).
  53. Gelis, I., et al. Structural basis for signal-sequence recognition by the translocase motor SecA as determined by NMR. Cell. 131 (4), 756-769 (2007).
  54. Erlandson, K. J., et al. A role for the two-helix finger of the SecA ATPase in protein translocation. Nature. 455 (7215), 984-988 (2008).
  55. Das, S., Oliver, D. Mapping of the SecA-SecY and SecA-SecG interfaces by site-directed in vivo photocross-linking. The Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12371-12380 (2011).
  56. Wheatley, E. G., Pieniazek, S. N., Vitoc, I., Mukerji, I., Beveridge, D. L. Molecular Dynamics Structure Prediction of a Novel Protein-DNA Complex: Two HU Proteins with a DNA Four-way Junction. Innovations in Biomolecular Modeling and Simulations: Volume 2. , The Royal Society of Chemistry. 111-128 (2012).
  57. Vitoc, C. I., Mukerji, I. HU binding to a DNA four-way junction probed by Förster resonance energy transfer. Biochemistry. 50 (9), 1432-1441 (2011).
  58. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

FRETSecA SecYEG
Картирование резонансного переноса энергии Фёрстера: новая методология для выяснения глобальных структурных особенностей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.