Культивирование и скрининг растений Паразитическая нематода Ditylenchus dipsaci

По оценкам, растительно-паразитические нематоды (PPN) несут ответственность за потерю 12,3% мирового производства продуктов питания и наносят ущерб в размере 157 миллиардов долларов в год ^1,2,3. К сожалению, способность контролировать PPN ослабевает, потому что эффективные химические нематициды были запрещены или сталкиваются с растущими ограничениями из-за безопасности человека и экологических проблем. Это в первую очередь связано с плохой селективностью нематод предыдущих поколений пестицидов⁴. За последние 25 лет шесть новых химических нематицидов были опробованы или выведены на рынок⁵. Один из них уже был запрещен в Европе, а другой был прекращен на предмет его воздействия на здоровье человека ^6,7. Следовательно, существует острая потребность в новых нематицидах, которые являются высокоселективными для PPN.

Стеблевая и луковичная нематода, Ditylenchus dipsaci (D. dipsaci) является экономически эффективным PPN⁴. D. dipsaci заражает почти 500 видов растений в 30 биологических расах и нацелена на некоторые из наиболее важных в сельскохозяйственном отношении культур, таких как рожь, овес, чеснок, лук и ^{лук-порей 8,9}. Например, D. dipsaci недавно бичевал чесночные поля в Онтарио и Квебеке, в результате чего потери составили до 90%^10,11. Его географическое распространение почти вездесуще и включает Америку (включая Калифорнию и Флориду), Европу, большую часть Азии (включая Китай) и Океанию⁹. D. dipsaci представляет собой мигрирующий эндопаразит, который входит в устьица на листьях или ранах и чечевицах, где они высвобождают ферменты для разрушения клеточной стенки¹². Усугубляя воздействие D. dipsaci на сельскохозяйственные культуры, ущерб, вызванный PPN, делает растение восприимчивым к вторичной инфекции¹¹. К сожалению, D. dipsaci демонстрирует высокие уровни толерантности к современным нематицидам по сравнению с другими штаммами нематод^13,14.

Этот протокол описывает культивирование D. dipsaci и его использование в крупномасштабных экранах для малых молекул-кандидатов нематицидов. Вкратце, популяции D. dipsaci поддерживаются и расширяются на растениях гороха, культивируемых в стерильных средах Gamborg B-5 (GA)¹⁵. Прежде чем выращивать ростки семян на среде GA, семена должны быть стерилизованы через серию промывок и покрыты питательным агаром (NA), чтобы проверить наличие загрязнения. Стерилизация семян необходима для обнаружения бактериальных и грибковых загрязнений, которые могут присутствовать. Незагрязненные семена затем переносятся на пластины GA, где семенные ростки будут расти при подготовке к инфекции. Пластины GA, содержащие семенные ростки, заражаются нематодами из предыдущей культуральной пластины путем переноса куска агара, содержащего корневую ткань, на свежие пластины. Через 6-8 недель нематоды извлекаются из среды GA и фильтруются через воронку с фильтром кофе в стакан для сбора. Нематоды могут быть использованы в различных биоанализах после того, как будет собрано подходящее количество. Метод, описанный в этом протоколе, генерирует приблизительно 15 000 D. dipsaci на культуральную пластину. Альтернативные протоколы культивирования D. dipsaci были опубликованы^16,17.

Здесь также описан скрининговый анализ малых молекул in vitro, основанный на предыдущей работе¹⁸. В качестве показателя здоровья червей подвижность 20 нематод на лунку исследуется после 5 дней воздействия малых молекул. Чтобы лучше визуализировать подвижность червей, NaOH добавляется для увеличения движения живых червей^19,20. Этот протокол позволяет проводить скрининг со средней пропускной способностью и предоставляет ценные данные для оценки нематицидного потенциала малых молекул. Если используется другой метод сбора нематод^16,17, то, тем не менее, может быть реализована методология скрининга малых молекул, описанная в настоящем описании.

Штамм D. dipsaci G-137, используемый для настоящей работы, был собран из чеснока Fish Lake 4 Variety в округе Принца Эдуарда и был предоставлен Agriculture and Agri-food Canada. Если вы начинаете новую культуру, проконсультируйтесь с Poirier et al. для методологии вакцинации¹⁵.

1. Культивирование D. dipsaci

1. Подготовьте носители и пластины в соответствии с ранее сообщенной работой¹⁵.
   1. Приготовьте 500 мл среды питательного агара (NA) с 23 г/л NA (см. Таблицу материалов) и сверхчистой водой. Используя стерильную технику, налейте 25 мл автоклавной среды NA в 20 одноразовых чашек Петри (диаметр 100 мм x глубина 15 мм). Дайте агару затвердеть при комнатной температуре (22 °C) с крышкой в течение ~2 ч и отложите для последующего использования.
   2. Приготовьте 500 мл среды Gamborg B-5 (GA), содержащей 3,2 г/л базальной среды GA с минимальной органикой, 20 г/л сахарозы, 15 г/л агара и дистиллированной воды (см. Таблицу материалов). Используя стерильную технику, налейте 50 мл автоклавной среды GA в 10 одноразовых чашек Петри (диаметр 100 мм x глубина 25 мм). Дайте агару затвердеть при комнатной температуре (22 °C) с крышкой в течение ~5 ч и храните в вертикальном положении при комнатной температуре в стерильном пакете до переноса ростков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избыточные пластины среды изготавливаются в случае загрязнения.
2. Выполняют стерилизацию семян по методу, модифицированному по сравнению с предыдущей работой¹⁵.
   1. Автоклав один стакан на 2 л с перемешивателем, 2 щипцами, стеклянной чашкой Петри и 1 л дистиллированной воды. Приготовьте 200 мл 95% раствора EtOH и 200 мл 15% раствора коммерческого отбеливателя.
   2. Используйте семена гороха (см. Таблицу материалов). Вылейте 150 семян в стерильный 2-литровый стакан с перемешивателем рядом с пламенем горелки Бунзена на лабораторной скамье.
   3. Добавьте 200 мл 95% EtOH к семенам в стакане, энергично перемешайте на перемешиваемой пластине в течение 5 минут, а затем вылейте EtOH в контейнер для отходов.
   4. Налейте отбеливающий раствор в стакан, чтобы полностью погрузить семена. Энергично перемешайте на тарелке для перемешивания в течение 20 минут, затем вылейте отбеливатель в контейнер для отходов.
   5. Налейте дистиллированную воду в стакан для погружения семян и энергично перемешайте на тарелке для перемешивания в течение 20 минут. Повторите промывку водой три раза, выливая дистиллированную воду после каждой стирки. После окончательного промывания водой вылейте стерилизованные семена в стеклянную чашку Петри.
   6. Чтобы проверить наличие загрязнений, переложите 6 семян на каждую пластину NA размером 10 см (подготовленную на этапе 1.1.1) в ламинарный капюшон с использованием стерилизованных щипцов. Расположите семена по окружности тарелки (лучше всего подходят семена пухлости). Оберните пластины по отдельности в лабораторную пленку и инкубируйте в темноте в течение 3 дней при 26 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Покрытие большего количества семян, чем необходимо, позволит выборочно использовать незагрязненные семена.
3. Выполните перенос ростков, следуя приведенному ниже шагу.
   1. В ламинарной проточной вытяжке используйте стерилизованные щипцы для нанесения 2 незагрязненных семян на каждую пластину GA (подготовленную на этапе 1.1.2). Оберните пластины по отдельности в лабораторную пленку и инкубируйте при комнатной температуре в течение 7-10 дней, чтобы семена проросли.
4. Выполняют выращивание in vitro по методу, модифицированному по сравнению с предыдущей работой¹⁵.
   1. Приготовить 50 мл 20 г/л раствора сахарозы. Фильтр стерилизуют раствором сахарозы и откладывают в сторону.
   2. В ламинарной вытяжке вырежьте кусок агара, содержащий корневую ткань (~ 2^см3), из существующей культуральной пластины. Пипетка 500 мкл раствора сахарозы на новую пластину ГА с рассадой гороха и поместите кубик агара поверх сахарозы. Оберните пластины по отдельности в лабораторную пленку и храните культуру в коробке, выстланной алюминиевой фольгой, при комнатной температуре (~22 °C).
   3. Субкультура нематод на свежих пластинах ГА каждые 8-9 недель для поддержания культуры. Нематоды готовы к извлечению через ~8 недель.

2. Добыча и сбор D. dipsaci

1. Выполните извлечение D. dipsaci , выполнив следующие действия.
   1. Автоклав - стакан 50 мл, воронка 80 мм, дистиллированная вода 150 мл и фильтры для кофе. Поместите воронку в стакан и выровняйте воронку стерильным кофейным фильтром.
   2. В ламинарном проточном капюшоне разрежьте агар и корневую ткань на 1^см3 с помощью стерильного скальпеля. Переложите кубики агара в воронку с фильтром для кофе и медленно налейте дистиллированную воду на агар, чтобы смочить кофейный фильтр.
   3. Извлеките воронку с фильтром кофе из стакана и наполните стакан дистиллированной водой до тех пор, пока уровень воды не коснется нижней части фильтра после замены воронки с фильтром для кофе.
   4. Накройте воронку с фильтром для кофе и стакан алюминиевой фольгой. Оставьте на ночь (16 ч) на столешнице, чтобы черви могли перемещаться через кофейный фильтр в стакан для сбора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина культуры нематоды готова к экстракции, когда черви заползли в агар при осмотре с помощью рассеченного микроскопа. Как правило, пластина готова к экстракции через 6-8 недель после ее первоначальной прививки.
2. Выполните сбор D. dipsaci.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На следующий день черви D. dipsaci осядут на дно стакана.
   1. Снимите воронку с фильтром для кофе и аспирируйте верхние 40 мл воды из стакана для сбора; следите за тем, чтобы не нарушить работу осевших червей. Используя пластиковую серологическую пипетку объемом 10 мл, соберите оставшуюся жидкость в коническую центрифужную трубку объемом 15 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта коллекция может быть использована непосредственно в анализах. Поместите при температуре 4 °C, если они не будут использоваться в течение 24 часов. Червей можно оставить на 3 дня при 4 °C без видимого влияния на подвижность. Удаление воронки может потревожить червей в стакане сбора. Дайте им осесть на дно перед сбором.

3. In vitro низкомолекулярный экран

1. Подготовьте пробирные пластины, выполнив следующие действия.
   1. Налейте автоклавную дистиллированную воду в стерильный желоб и, используя многоканальную пипетку, дозируйте 40 мкл дистиллированной воды из корыта в каждую лунку плоскодонной 96-луночной пластины.
2. Подготовьте инструмент для закрепления и добавьте химикаты
   1. Установите лотки для пиннера (см. Таблицу материалов) рядом с пламенем горелки Бунзена на лабораторном стенде. Добавьте в последовательные лотки для пиннера следующее: 25 мл раствора для очистки контактов, 35 мл 50% DMSO (в воде), 45 мл дистиллированной воды, 55 мл 70% EtOH и 65 мл 95% EtOH. Поместите один лист промокательной бумаги перед каждым лотком
   2. Очистите инструмент для закрепления, вставив штифты в чистящий раствор и переместив штифты вверх и вниз три раза (3x) в растворе. В этом протоколе «3x» и «10x» определяются как перемещение пиннера вверх и вниз в растворе три или десять раз соответственно. Промокните булавки на промокательной бумаге. Повторите эту процедуру еще раз.
      1. Затем промойте штифты 3x в дистиллированной воде, а затем промокайте штифты. Повторите процедуру еще раз.
      2. Наконец, промойте штифты 3x в 95% EtOH, а затем промокайте штифты. Повторите еще раз. Зажгите пиннер и дайте этанолу испариться.
   3. Добавьте химические вещества из 96-луночных химических пластин в пробирные пластины, прикрепив 3x к химической пластине, а затем переместив штифты 10X в пробирную пластину. Промокните на бумаге перед чистящим раствором.
   4. Очистите инструмент для закрепления между пластинами путем промывки в следующем порядке, промокнув между ними на промокательной бумаге: 3x в 50% DMSO (один раз), 3x в дистиллированной воде (один раз), 3x в 75% EtOH (один раз), 3x в 95% EtOH (дважды). Зажгите пиннер и дайте этанолу испариться.
   5. Повторите шаг 3.2.2 после завершения закрепления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скрининг проводили при конечной концентрации 60 мкМ.
3. Добавление червей
   1. Подсчитайте количество нематод из коллекции, сначала повторно используя, а затем пипетировав 5 мкл, используя наконечники с низким уровнем удержания на слайде для наблюдения. Подсчитайте количество нематод в 5 мкл с помощью рассеченного микроскопа.
      1. Отрегулируйте концентрацию до 2 червей/мкл с помощью стерильной дистиллированной воды. Используя многоканальную пипетку и желоб, добавьте 10 мкл (~ 20 червей) к каждой скважине из 96-луночных плит.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительно 15 000 нематод D. dipsaci будут собраны на культуральную пластину с использованием описанного метода культивирования и сбора. На скважину используется двадцать червей, так как небольшое количество облегчает четкую визуализацию и учет подвижных и неподвижных.
   2. Запечатайте пластины в лабораторную пленку и оберните влажным бумажным полотенцем. Поместите в коробку и прикрепите к липкой прокладке при 20 °C встряхивающий инкубатор, установленный при 200 об/мин. Убедитесь, что пластины стабилизированы в коробке, добавив дополнительное влажное бумажное полотенце, чтобы обеспечить минимальное движение пластин.

4. Сбор и анализ данных

1. Наблюдайте за пластинами на 5-й день под рассекающим микроскопом. Подсчитайте количество мобильных и общее количество D. dipsaci в системах контроля растворителей ДМСО и обработанных лекарственными средствами скважинах.
   1. Если черви относительно неподвижны, добавьте 2 мкл 1 М NaOH к конечной концентрации 40 мМ в лунку, чтобы стимулировать движение^19,20.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После добавления NaOH черви будут перемещаться мгновенно и должны быть просмотрены в течение 5 минут. Количество мобильных червей и общее количество червей будет использоваться для расчета доли мобильных червей. Длина анализа может меняться в зависимости от цели экрана.
2. Рассчитайте долю мобильных червей. В экранах D. dipsaci скважины, которые воспроизводимо давали 0% мобильных червей, классифицируются как сильные попадания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Длительное воздействие пластин на стадии рассеченных микроскопов избегается, поскольку источник света может нагревать пластины и вызывать переменное воздействие на биоанализ.

Независимые реплики показывают воспроизводимые хиты
Чтобы проиллюстрировать ожидаемые различия между реплицированными экранами, средства и вариации подвижности образца строятся из трех репрезентативных пластин с недавнего экрана (рисунок 1). Три реплики экрана были выполнены в три разных дня. Все три пластины имеют отрицательные (только растворители) контрольные элементы (более темные полосы), а образцы в наборе содержали установленные нематициды. Остальные соединения взяты из пользовательской библиотеки, которая в настоящее время характеризуется в лаборатории Роя. По сравнению с аналогичными экранами, сделанными с C. elegans с теми же молекулами (SC, JK, PJR, неопубликованные результаты), частота попадания с D. dipsaci значительно ниже, и многие лекарственные пластины не проявляют активности (рисунок 1A). Некоторые пластины имеют полностью воспроизводимые попадания (рисунок 1B,C), в то время как другие различаются по активности (рисунок 1C). По сравнению с другими видами, прошедшими скрининг (не показанными), D. dipsaci показывает меньшую изменчивость в своей реакции на соединения. Несмотря на это, реплики считаются необходимыми для идентификации воспроизводимых хитов.

Nematicides различаются по своей способности обездвиживать Ditylenchus dipsaci
Из семи охарактеризованных нематицидов, протестированных против D. dipsaci, только Флуопирам проявляет устойчивую активность в анализе, описанном в настоящем описании (рисунок 1С). Это согласуется с предыдущей работой, показывающей, что D. dipsaci терпим к nematicides13,14. Флуопирам ингибирует комплекс II цепи переноса электронов нематодным селективным образом и является коммерческим нематицидом, используемым для управления различными PPN, включая Rotylenchulus reniformis и Meloidogyne incognita 4,21,22. Флуопирам и один из нематицидов, которые не проявляли активности при тестируемой концентрации (Oxamyl)23, были исследованы более подробно с помощью анализа «доза-реакция» с D. dipsaci. Флуопирам индуцирует кажущееся дозозависимое влияние на подвижность D. dipsaci при EC50 9,3 мкМ (с 95% доверительным интервалом от 8,2 до 10,5 мкМ) (рисунок 2A,B). Этот результат ожидается на основе опубликованных in vitro результатов Storelli et al., 202013. Оксамил не оказывает существенного влияния на подвижность до концентрации 120 мкМ (p = 0,3632, непарный t-тест) (рисунок 2C,D).

Гидроксид натрия улучшает чувствительность к анализу
В отличие от почти непрерывной плавательной активности C. elegans в жидкой культуре18, животные D. dipsaci значительно менее подвижны. Это не редкость среди паразитических нематод в культуре16. Чтобы помочь отличить «покоящихся» червей от больных червей, 40 мМ NaOH используется в конечной точке анализа для стимуляции движения у тех людей, которые способны (рисунок 3)19,20. Этот метод позволяет четко идентифицировать малые молекулы, которые обездвиживают червей, учитывая, что все черви в отрицательных контрольных скважинах движутся и дают исключительно низкий фон ложных срабатываний на экране.

Рисунок 1: Примеры вывода на экран. Три биологические реплики (открытые круги) с D. dipsaci были выполнены против малых молекул (60 мкМ) в каждой из трех показанных пластин. Все три пластины имеют 0,6% dmso только растворителей (более темные полосы). Если не отмечено иное с помощью контроля растворителей или известных нематицидов, колодцы трех пластин содержат относительно нехарактеризованные лекарственно-подобные соединения, приобретенные у поставщиков (см. Burns et al., 2015)18. (A) В 96-луночной пластине из библиотеки малых молекул отсутствует какая-либо молекула с наблюдаемой биологической активностью против D. dipsaci. (B) Пластина из 96 лунок из библиотеки малых молекул имеет одну молекулу, которая воспроизводимо нарушает подвижность D. dipsaci . (C) 96-луночная лекарственная пластина, содержащая характерные нематициды флуопирам (флуо), ипродион (ипро), абамектин (абам), флуэнсульфон (дым), тиоксазафен (тиокс), оксамил (оксам) и вакт-11. Полосы погрешностей представляют стандартную погрешность среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Пример положительных и отрицательных результатов с использованием анализа подвижности. (А) Примеры терминальных фенотипов после воздействия D. dipsaci на повышение концентрации флуопирама за 5 дней до добавления NaOH. (B) Анализ "доза-реакция" движения D. dipsaci после 5 дней воздействия указанных концентраций флуопирама. (С,Г) То же самое, что и А,В, за исключением оксамила. На каждом графике показаны испытания, проведенные в два отдельных дня с тремя репликами каждый день. Ось Y каждого графика показывает долю подвижности червей в каждой скважине, рассчитанную как количество движущихся животных относительно общего числа животных в скважине. Полосы погрешностей на обоих графиках представляют стандартную погрешность среднего значения. Шкала представляет собой 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Подвижность D. dipsaci после добавления 40 мМ NaOH. Эффект добавления NaOH к образцам D. dipsaci в присутствии контроля только растворителя (A), тиоксазафена (B) или флуопирама (C) после 5 дней совместной инкубации. Шкала представляет собой 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.