Методическая статья

Нелинейная оптика без этикеток для изучения тубулин-зависимых дефектов в центральном миелине

2.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63449

⸱

24 марта 2023 г.

 ,  ,  ,  , 
1Centro de Investigaciones en Óptica A.C. (CIO), 2Division of Sciences and Engineering, Department of Chemical, Electronic, and Biomedical Engineering, Universidad de Guanajuato, 3Institute of Physiology, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, 4Dirección General de Desarrollo Internacional, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье мы представляем протокол обнаружения олигодендроцитов, нагруженных микротрубочками, в модели тубулинопатии с помощью простого, инновационного подхода к микроскопии второй гармонической генерации.

Аннотация

Удовлетворительная визуализация цитоскелетных компонентов в головном мозге является сложной задачей. Повсеместное распределение сетей микротрубочек, микрофиламентов и промежуточных нитей во всех нервных тканях вместе с изменчивостью результатов стратегий слияния флуоресцентных белков и их ограниченной применимостью к динамическим исследованиям антител и лекарств в качестве хромофорных носителей делают классические оптические подходы не такими эффективными, как для других белков. Когда тубулин необходимо изучить, генерация вторых гармоник без меток является очень подходящим вариантом из-за нецентросимметричной организации молекулы. Этот метод при сопряжении с микроскопией может качественно описать объемное распределение параллельных пучков микротрубочек в биологических образцах, с дополнительным преимуществом работы со свежими тканями, которые являются нефиксированными и неразрывноженными. В этой работе описывается, как изобразить тубулин с помощью коммерческой микроскопии второй гармонической генерации для выделения микротрубочек в обогащенных тубулином структурах олигодендроцитов, как при гипомиелинизации с атрофией базальных ганглиев и тубулинопатии мозжечка (H-ABC), недавно описанного расстройства миелина.

Введение

Оптическая визуализация цитоскелетных структур в тканях и препаратах органов – непростая задача. Цитоскелетные нити распространены повсеместно, поэтому, если общее окрашивание выполняется, например, против альфа-тубулина или бета-актина или потенциально кератина в образце эпителия, сигнал, вероятно, будет распределен довольно однородно по всему образцу. Чтобы ограничить окрашивание более значимым подмножеством клеточных компонентов, можно либо использовать трансгенных мышей с целевой экспрессией1, либо планировать использование изоформ-специфических антител. В то время как очень немногие из последних представлены на рынке (и очень немногие из них существуют вообще 2,3,4), трансгенная модель животных может быть доступна. Тем не менее, он должен быть приобретен лабораторией и должным образом размещен, со всеми расходами, связанными с процессом. Некоторые антитела или химические вещества, например, флуорофор-конъюгированные препараты, такие как фаллоидин или паклитаксел, могут быть частично или полностью несовместимы с использованием в живых клетках или тканях, что ограничивает их применимость только к исследованиям фиксированных образцов.

В случае тубулина необходимо учитывать дополнительный аспект, которым является чувствительность полимера к фиксации. Традиционная химическая фиксация формальдегидом известна тем, что не является адекватной для оптимального сохранения целостности микротрубочек5. Кроме того, недавний отчет подтверждает, что сшивание формальдегида вызывает тонкие изменения в ультраструктуре микротрубочек, аналогичные тому, что происходит при связывании некоторых лекарств или физиологических молекул, таких как GTP6.

Поэтому прямая визуализация микротрубочек в незапятнанных, неповрежденных образцах часто желательна. Для достижения этого одним из технических решений является микроскопия второй гармонической генерации (SHG)7, которая основана на способности пучков параллельных микротрубочек действовать как гармониофоры и излучать удвоенный по частоте свет при правильном освещении интенсивным импульсным инфракрасным лазером. Хотя более сильный и стабильный второй гармонический сигнал может быть получен из коллагена и миозина, которые являются единственными двумя другими биологическими материалами, которые, как известно, способны к удвоению частоты, сигнал от тубулина до сих пор использовался в основном для изучения митотических перестроек веретена 8,9,10 и морфологии аксональных микротрубочек 11,12,13.

В этой работе мы представляем новое использование микроскопии SHG в качестве диагностического инструмента для различения тканей центральной нервной системы (ЦНС), пораженных тубулинопатией бета-4 А (TUBB4A), от их здоровых аналогов14. Некоторые из мутаций, происходящих в этой преимущественно нейронной изоформе тубулина, например, вызывающие гипомиелинизацию и атрофию базальных ганглиев и мозжечка (H-ABC), вызывают переполнение микротрубочек в олигодендроцитах15,16; цитоскелетные изменения, в свою очередь, связаны с последующими эффектами, такими как дисмиелинизация, с глубоким нарушением двигательных и сенсорных путей 16,17,18,19. Модель тайеповых мышей, используемая в этой работе, отображает аномальное содержание микротрубочек в олигодендроцитах и повторяет большинство сенсорно-моторных симптомов пациентов h-ABC17. Протокол объясняет, как визуализировать такие структуры, как мозолистое тело и мозжечок, которые обычно сильно миелинизированы и которые серьезно страдают у пациентов на людях, а также у крысы тайепа 19, чтобы подчеркнуть различия в сигналах SH между здоровыми и мутантными тканями.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все описанные процедуры были выполнены в соответствии с законами и кодексами, утвержденными в седьмом названии Положения Общего закона о здравоохранении, касающегося исследований в области здравоохранения правительства Мексики (NOM-062-ZOO-1999), и в соответствии с рекомендациями Руководства национальных институтов здравоохранения по уходу за экспериментальными животными и их использованию, и были одобрены институциональным комитетом по биоэтике в исследованиях Университета Гуанахуато и Автономного университета Бенемериты. Пуэбла.

1. Настройки микроскопа

  1. Включите систему микроскопии.
  2. Включите импульсный лазер, чтобы гарантировать, что он будет готов к работе на оптимальном и устойчивом уровне мощности после извлечения и подготовки образца.
  3. Настройте лазер на 810 нм. Для исследования тиссулярных микротрубочек используется 10%-20% доступной мощности лазера, что в описываемой системе соответствует 13-26 мВт, измеренным на задней фокальной плоскости объектива.
  4. Убедитесь, что микроскоп выровнен по Келеру (дополнительный файл 1) с целью, которая будет использоваться для визуализации SHG.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это важно, поскольку в коммерческой установке, используемой в этой работе, обнаружение выполняется в режиме передачи и через конденсатор.
  5. Удалите нежелательные фильтры из оптического пути обнаружения (рисунок 1A).
  6. Убедитесь, что диафрагма конденсатора полностью открыта, чтобы гарантировать, что свет не останавливается без необходимости на этом уровне.
  7. Подготовьте масляный объектив с числовой диафрагмой (NA) с небольшой каплей погружного масла в объектив.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта цель была использована, чтобы наилучшим образом соответствовать конденсатору NA, который составлял 0,55 (в идеале, NAcond≥ NAobj).

2. Предварительный контроль микроскопа

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните предварительное управление микроскопом один раз, если настройка не изменена.

  1. Изображение сухого кукурузного крахмала, зажатого между стеклянными слайдами с параметрами SHG для получения изображений SHG, которые показывают направление лазерной поляризации. Выполните действия, описанные в дополнительном файле 2, за исключением мощности лазера, которая составляет менее 5% для кукурузного крахмала.
  2. Сделайте одно изображение разреженных зерен кукурузного крахмала и отметьте ориентацию долек SHG в плоскости x-y. Эта ориентация соответствует лазерной ориентации (рисунок 2А).
  3. В качестве элемента управления возьмите другое изображение того же образца, вставив в оптический путь полуволновую пластину (положение, показанное на рисунке 1А) для изменения направления колебаний лазера. Полученное изображение отображает повернутые дольки сигнала SHG (рисунок 2B, C).
  4. Если используется другой тип полосового фильтра для SHG, убедитесь, что он обладает оптимальными свойствами передачи, сравнивая изображения (рисунок 2D, E) и интенсивность сигнала пиксель за пикселем вдоль линейного сканирования (рисунок 2F).

3. Извлечение тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте чистые инструменты для выполнения хирургических процедур.

  1. Используйте 6-12-месячных крыс тайепа и соответствующие возрасту контрольные группы Sprague-Dawley (WT).
  2. Обезболивают животных в/инъекцией смеси кетамина-ксилазина (0,125 мг/кг и 5 мг/кг), разведенной в 0,9% стерильном растворе NaCl.
    1. Проверьте болевые рефлексы, и приступайте только в том случае, если они отсутствуют.
  3. Приносить животное в жертву путем обезглавливания.
  4. Как только голова изолирована, осторожно откройте кости свода черепа вдоль средней линии, начиная с самой хвостовой точки наверху к носу, от орбитальных полостей к средней линии, а затем от самой хвостовой точки до нижней части мозга и мозжечка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Костяные резаки и Rongeurs позволяют правильно удалять кости головы, не повреждая структуры мозга.
  5. Освободите мозг и мозжечок от кости. Два полушария могут быть разделены. Если полушария разделены, используйте одну половину для визуализации SHG, а другую половину зафиксируйте в 3,7% параформальдегиде в фосфат-буферном физиологическом растворе (PBS) в течение 20 минут внутри химической вытяжки для последующего сечения и окрашивания.

4. Вибратомное секционирование

  1. Подготовьте буферный лоток для вибратома, наполненный теплым (37 °C) сбалансированным солевым раствором Хэнка (HBSS).
  2. Закрепите мозг на пластине образца с помощью цианоакрилатного клея через кусок маскировочной ленты. Наибольшая каудальная часть/ область контактирует с клеем, так что пригодные для использования корональные участки из противоположной ростральной части могут быть разрезаны.
    1. Дайте ~10 с для полимеризации клея для получения эффективного прикрепления образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наилучшие результаты получаются, когда мозг ориентирован так, что лезвие режет «сверху вниз», а не «из стороны в сторону» (рисунок 1B).
  3. Перенесите пластину образца на магнитную опору внутри буферного лотка.
  4. Начните резать 300-500 мкм срезов до тех пор, пока полученные срезы не охватят всю поверхность мозга.
  5. В этот момент уменьшите толщину сечения до 160 мкм.
  6. После того, как полный срез размером 160 мкм разрезан на уровне мозолистого тела, восстановите его с помощью модифицированной стеклянной пипетки Пастера с большим пламенным отверстием (рисунок 1C).
  7. Переложите его в чистую чашку Петри с новым теплым HBSS или непосредственно на стеклянную опору для микроскопии (крышку или стеклянную тарелку).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для описанных экспериментальных условий добавление крышки над образцом наносит ущерб визуализации.

5. Перенос в микроскоп

  1. Если микроскоп находится в другом помещении, подготовьте изолированную коробку с подогретыми гелевыми компрессами для переноса участков ткани при сохранении температуры. Коробка также служит для поддержания разделов в тепле до тех пор, пока они не будут изображены.
  2. Поместите образец под микроскоп и убедитесь, что он правильно расположен под объективом, путем непосредственного наблюдения через глаз с пропускаемым светом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы выровнять прогнозируемые излучающие структуры с направлением колебаний лазера для максимизации излучаемого (и, следовательно, обнаруженного) сигнала SHG.
  3. Удалите избыток HBSS так, чтобы тонкая жидкая пленка покрывала весь образец. Визуально проверяйте жидкую пленку каждые несколько минут, чтобы избежать чрезмерного испарения и высыхания образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В описанных условиях секция используется не более 20 мин. Высыхание образца вызывает резкие артефактные эффекты (дополнительный рисунок 1А). Вместо того, чтобы добавлять больше HBSS, рекомендуется периодическое замачивание участка в теплой, свежей среде, если требуется более длительное время визуализации. Использование перфузионных камер и клея или низкоплавкой агарозы для иммобилизации ткани также рекомендуется при проведении более длительных экспериментов.
  4. Подготовьте стадию микроскопа для неосканированной визуализации, которая может включать закрытие всех дверей темной инкубационной камеры или покрытие инкубационной камеры черной нейлоновой полиуретановой тканью.

6. Визуализация

  1. Выберите режим «неотсканированной» визуализации вдоль пути передачи. Таким образом, захват слабого сигнала SH тубулина будет оптимизирован.
  2. Выберите цель LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA.
  3. Установите мощность лазера от 13 мВт до 26 мВт со временем выдержки пикселя 12,6 мкс. Делайте снимки размером не более 512 x 512 пикселей со скоростью 5 и средним значением 2 для среднего времени съемки около 15 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование более высокой мощности лазера и/или более длительного времени выдержки может повредить образец (дополнительный рисунок 1B).
  4. Сначала сделайте снимки с помощью фильтра коротких частот 485 нм (SP485), а на втором этапе добавьте резкий полосовой фильтр 405 нм (BP405; Рисунок 3). Выполните действия, описанные в дополнительном файле 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения псевдоярчего поля могут быть получены через тот же детектор с использованием остаточного лазерного света видимой линии (лучше всего работают лазеры 405 нм или 488 нм).

7. Обработка мозжечка

  1. Сначала разрезают мозжечок скальпелем на две полусферы, а затем приклеивают их к вибратомной опоре средней частью (плоской частью, полученной после разреза).
  2. Сечение и изображение мозжечка таким же образом, как было описано для мозга (160 мкм срезов, те же настройки вибратома, то же лезвие, те же настройки микроскопа и т.д.).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за анатомии мозжечка его ориентация в момент сечения не является критической; в большинстве срезов, образующихся вдали от поверхности, фолиевы будут хорошо разделены на белое вещество.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Изображения, полученные с помощью данной методики, имеют внутренний низкий фоновый уровень из-за очень ограниченного количества гармоникофоров, присутствующих в биологических тканях, что является одним из существенных преимуществ метода.

Когда волокна мозолистого тела визуализируются, волокнистые короткие структуры и округлые элементы могут быть последовательно найдены в мозге тайепа (рисунок 3B), в то время как мозолистое тело контрольного мозга показыва...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Микроскопия SHG является частью группы нелинейных оптических методов, которые включают в себя двухфотонную микроскопию возбуждения, микроскопию генерации третьей гармоники и когерентную рамановскую рассеянную микроскопию против Стокса, которые способствовали расширению спектра применения обычной оптической микроскопии в науках о жизни20.

В частности, основные сильные и слабые стороны микроскопии SHG связаны с одним и тем же состоянием: генератор сигналов нецентросимметр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным советом по вопросам науки и технологий (CONACYT) посредством следующих грантов: infraestructura 226450 для VP-CIO, infraestructura 255277 для V.P. и FORDECYT-PRONACES/194171/2020 для V.H. Мы признаем поддержку Хувенала Эрнандеса Гевары в CIO в создании видео.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
405/10 нм BrightLine(R) однополосный полосовой фильтр СемрокФФ01-405/10-25Диаметр 32 мм, с корпусным кольцом
Черный нейлон, ткань с полиуретановым покрытиемТорлабсБК55' x 9' (1,5 м x 2,7 м) x 0,005 дюйма (0,12 мм) Толщина 
Лезвия для вибратомалюбой рекламный ролик; Например, меч Уилкинсона  Классические бритвенные лезвия из нержавеющей стали с двойным лезвием
Чашки для клеточных культур, 35 ммлюбой рекламный ролик; Например, Сокол351008
Конфокальный микроскопЦейссLSM710NLO AxioObserver Z1Инвертированный микроскоп, используемый объектив LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA 
Холодильниклюбой рекламный роликЛюбая изолированная полистирольная коробка может подойти, чтобы поддерживать образец при температуре около 37 градусов; C
Кукурузный штахНапример, кукурузаИз супермаркета
Покровные стекла #1.5любой рекламный роликПрямоугольный
Цианоакрилатный клейНапример, LoctiteЧтобы приклеить мозг к малярному скотчу
Тонкие щипцыИнструменты тонкой науки11412-11Для работы с участками тканей с помощью мозговых оболочек
Тонкие ножницыИнструменты тонкой науки14370-22Чтобы срезать кожу...
Тонкие ножницы с изогнутым концомИнструменты тонкой науки14061-09Резать по средней линии
Формальдегид 37%Сигма-Олдрич252549Для разбавления 1:10 в PBS
Фридман РонгерИнструменты тонкой науки16000-14Чтобы разрезать кость
Гелевые пакетылюбой рекламный роликРазогретый до 37 градусов; C, чтобы помочь поддерживать температуру внутри охладителя
Стеклянная пипетка Пастера, модифицированнаялюбой рекламный роликДля переноса участка ткани
Хэнкс и прайм; Сбалансированный раствор соли (HBSS)Gibco14025-076Может быть приготовлен из порошков
Гемостатики КеллиИнструменты тонкой науки13018-14Чтобы отделить косточку 
Малярный скотчлюбой рекламный роликДля защиты поверхности пластины образца
Модуль NDD, тип CЦейсс000000-1410-101Для обнаружения сигнала, уменьшения потерь света. Корпус фильтра 000000-1935-163 с SP485
Офсетные кусачки для костейИнструменты тонкой науки16101-10Чтобы разрезать кость
Фосфатно-солевой буфер (PBS)Gibco10010-031Может быть приготовлен из порошков или таблеток
Импульсный лазерКогерентныйХамелеон Вижн II680– Перестраиваемый лазер 1080 нм
Скальпельлюбой рекламный роликПрямое лезвие с острым концом
Щипцы стандартной формыИнструменты тонкой науки11000-18
Весенние ножницы VannasИнструменты тонкой науки15018-10Для резки принимают мозговые оболочки, которые остаются соединенными как с срезом, полученным при вибратомной резке, так и с срезом, приклеенным к пластине образца.
Вибратомлюбой рекламный ролик; Например, LeicaВТ1200

Ссылки

  1. Palmiter, R. D., et al. Cell lineage ablation in transgenic mice by cell-specific expression of a toxin gene. Cell. 50 (3), 435-443 (1987).
  2. Banerjee, A., et al. A monoclonal antibody against the type II isotype of beta-tubulin. Preparation of isotypically altered tubulin. The Journal of Biological Chemistry. 263 (6), 3029-3034 (1988).
  3. Banerjee, A., Roach, M. C., Trcka, P., Luduena, R. F. Preparation of a monoclonal antibody specific for the class IV isotype of beta-tubulin. Purification and assembly of alpha beta II, alpha beta III, and alpha beta IV tubulin dimers from bovine brain. The Journal of Biological Chemistry. 267 (8), 5625-5630 (1992).
  4. Banerjee, A., et al. Localization of βv tubulin in the cochlea and cultured cells with a novel monoclonal antibody. Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 505-514 (2008).
  5. Cross, A. R., Williams, R. C. Kinky microtubules: Bending and breaking induced by fixation in vitro with glutaraldehyde and formaldehyde. Cell Motility and the Cytoskeleton. 20 (4), 272-278 (1991).
  6. Van Steenbergen, V., et al. Molecular understanding of label-free second harmonic imaging of microtubules. Nature Communications. 10 (1), 3530(2019).
  7. Campagnola, P. J., Clark, H. A., Mohler, W. A., Lewis, A., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy of living cells. Journal of Biomedical Optics. 6 (3), 277(2001).
  8. Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
  9. Yu, C. -H., et al. Measuring microtubule polarity in spindles with second-harmonic generation. Biophysical Journal. 106 (8), 1578-1587 (2014).
  10. Bancelin, S., et al. Probing microtubules polarity in mitotic spindles in situ using Interferometric Second Harmonic Generation Microscopy. Scientific Reports. 7, 6758(2017).
  11. Dombeck, D. A., et al. Uniform polarity microtubule assemblies imaged in native brain tissue by second-harmonic generation microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7081-7086 (2003).
  12. Psilodimitrakopoulos, S., et al. Estimation of the effective orientation of the SHG source in primary cortical neurons. Optics Express. 17 (16), 14418(2009).
  13. Sharoukhov, D., Bucinca-Cupallari, F., Lim, H. Microtubule imaging reveals cytoskeletal deficit predisposing the retinal ganglion cell axons to atrophy in DBA/2J. Investigative Opthalmology & Visual Science. 59 (13), 5292(2018).
  14. Alata, M., Piazza, V., Eguibar, J. R., Cortes, C., Hernandez, V. H. H-ABC tubulinopathy revealed by label-free second harmonic generation microscopy. Scientific Reports. 12, 14417(2022).
  15. Duncan, I. D., Lunn, K. F., Holmgren, B., Urba-Holmgren, R., Brignolo-Holmes, L. The taiep rat: A myelin mutant with an associated oligodendrocyte microtubular defect. Journal of Neurocytology. 21 (12), 870-884 (1992).
  16. Duncan, I. D., et al. A mutation in the Tubb4a gene leads to microtubule accumulation with hypomyelination and demyelination: Tubb4a Mutation. Annals of Neurology. 81 (5), 690-702 (2017).
  17. Garduno-Robles, A., et al. MRI features in a rat model of H-ABC tubulinopathy. Frontiers in Neuroscience. 14, 555(2020).
  18. Lopez-Juarez, A., et al. Auditory impairment in H-ABC tubulinopathy. Journal of Comparative Neurology. 529 (5), 957-968 (2021).
  19. Alata, M., et al. Longitudinal evaluation of cerebellar signs of H-ABC tubulinopathy in a patient and in the taiep model. Frontiers in Neurology. 12, 702039(2021).
  20. Parodi, V., et al. Nonlinear optical microscopy: From fundamentals to applications in live bioimaging. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 585363(2020).
  21. Lefort, C. A review of biomedical multiphoton microscopy and its laser sources. Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (42), 423001(2017).
  22. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).
  23. vander Knaap, M. S., et al. New syndrome characterized by hypomyelination with atrophy of the basal ganglia and cerebellum. American Journal of Neuroradiology. 23 (9), 1466(2002).
  24. Stoller, P., Kim, B. -M., Rubenchik, A. M., Reiser, K. M., Da Silva, L. B. Polarization-dependent optical second-harmonic imaging of a rat-tail tendon. Journal of Biomedical Optics. 7 (2), 205(2002).
  25. Brown, E. B., et al. In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nature Medicine. 7 (7), 864-868 (2001).
  26. Chakraborti, S., Natarajan, K., Curiel, J., Janke, C., Liu, J. The emerging role of the tubulin code: From the tubulin molecule to neuronal function and disease. Cytoskeleton. 73 (10), 521-550 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи