Выделение и функциональный анализ артериолярного эндотелия паренхимы головного мозга мыши

Md A. Hakim; Paulo W. Pires; Erik  J. Behringer

doi:10.3791/63463

Методическая статья

Выделение и функциональный анализ артериолярного эндотелия паренхимы головного мозга мыши

DOI:

10.3791/63463

⸱

11 марта 2022 г.

Md A. Hakim¹ , Paulo W. Pires² , Erik J. Behringer¹

¹Department of Basic Sciences, Loma Linda University, ²Departments of Physiology, Surgery and Neurosurgery and Sarver Heart Center, University of Arizona College of Medicine Tucson

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Проиллюстрирована интенсивная подготовка интактных эндотелиальных «трубок» головного мозга мыши из церебральных паренхиматозных артериол для изучения регуляции мозгового кровотока. Кроме того, мы демонстрируем экспериментальные сильные стороны этой модели эндотелиального исследования для флуоресцентной визуализации и электрофизиологического измерения ключевых клеточных сигнальных путей, включая изменения внутриклеточного [Ca²⁺] и мембранного потенциала.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мозговой кровоток передается сосудистыми артериями сопротивления и ниже по течению паренхиматозными артериолами. Устойчивое сосудистое сопротивление кровотоку увеличивается с уменьшением диаметра от артерий до артериол, которые в конечном итоге питаются капиллярами. Из-за их меньшего размера и расположения в паренхиме артериолы были относительно недостаточно изучены и с меньшей воспроизводимостью в результатах, чем поверхностные пиальные артерии. Несмотря на это, структура и функция артериолярных эндотелиальных клеток, неотъемлемая часть физиологии и этиологии хронических дегенеративных заболеваний, требует обширного исследования. В частности, новые данные демонстрируют, что нарушенная функция эндотелия предшествует и усугубляет когнитивные нарушения и деменцию.

В паренхиматозной микроциркуляции функция эндотелиального канала K⁺ является наиболее надежным стимулом для тонкого контроля распространения вазодилатации, чтобы способствовать увеличению притока крови к областям нейрональной активности. Эта статья иллюстрирует усовершенствованный метод свежеизолирования интактных и электрически связанных эндотелиальных «трубок» (диаметр, ~25 мкм) из паренхиматозных артериол мозга мыши. Артериолярные эндотелиальные трубки обеспечиваются в физиологических условиях (37 °C, рН 7,4) для разрешения экспериментальных переменных, которые охватывают функцию канала K⁺ и их регуляцию, включая внутриклеточную динамику Ca²⁺ , изменения мембранного потенциала и мембранную липидную регуляцию. Явным техническим преимуществом по сравнению с артериальным эндотелием является улучшенное морфологическое разрешение размеров клеток и органелл (например, митохондрий), что расширяет полезность этого метода. Здоровая церебральная перфузия на протяжении всей жизни влечет за собой надежную функцию эндотелия в паренхиматозных артериолах, напрямую связывая кровоток с подпиткой нейронной и глиальной активности в точных анатомических областях мозга. Таким образом, ожидается, что этот метод значительно расширит общие знания сосудистой физиологии и неврологии относительно здорового и больного мозга.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Паренхиматозные артериолы непосредственно доставляют необходимый кислород и питательные вещества по всему мозгу¹. Взаимодействуя с капиллярами, высоковазоактивные артериолы реагируют на ретроградную передачу сигналов, инициированную капиллярными ионными каналами, которые воспринимают метаболические сигналы от определенных нейронных^{областей 2}. Поскольку паренхима головного мозга исторически получила основную часть исследований, в настоящее время появилась роль эндотелиальной дисфункции для прояснения патологических механизмов, связанных с различными цереброваскулярными нарушениями, лежащими в основе деменции (например, иш....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экспериментаторы должны обеспечить, чтобы назначенное использование животных и связанные с ними протоколы были одобрены их Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) и выполнялись в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных» Национального исследовательского совета (^8-еиздание, 2011 год) и руководящими принципами ARRIVE. IACUC Университета Лома Линда и Университета Аризоны одобрили все протоколы, используемые для этой рукописи для мышей C57BL/6N и 3xTg-AD (самцы и самки; возрастной диапазон: 2-30 месяцев). См. Рисунок 1 в качестве обзора выделения и ис....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Демонстрация протокола показана на фиг.1 с этапами рассечения артериолярных артерий и изоляции эндотелиальной трубки, как показано на фиг.2 и фиг.3 соответственно. Здесь эндотелиальную функцию оценивали путем измерения [Ca²⁺]_i и V_{m с использованием} фотометрии Fura-2 и электрофизиологии острых электродов (рисунок 4A) в ответ на фармакологический агент [2-метилтиоаденозинд.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Растущие данные свидетельствуют о том, что цереброваскулярные заболевания (ССЗ), старение и болезнь Альцгеймера сильно коррелируют и являются актуальной темой исследований деменции 4,8,14,21. Таким образом, очевидно, что исследования цереброваскулярной сети будут иметь широкое влияние на здоровье, требуя продолжения обширных исследований в условиях заболевания. Как значимая точка сосудистого с.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано грантами Национальных институтов здравоохранения (R00AG047198 & R56AG062169 для EJB; R00HL140106 к PWP) и Ассоциации Альцгеймера (AZRGD-21-805835 к PWP). Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно представляет официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения или Ассоциации Альцгеймера.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
Имя	Компания	Каталожный номер
Усилители	Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния, США	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Звуковые базовые мониторы	Ampol US LLC, Сарасота, Флорида, США	Чиллер для ванны BM-A-TM
(Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
капилляры из боросиликатного стекла (штифт)	Warner Instruments	G150T-6
Капилляры из боросиликатного стекла (острые электроды)	Warner Instruments	GC100F-10
Капилляры из боросиликатного стекла (тритурация)	World Precision Instruments (WPI), Сарасота, Флорида, США	1B100-4
BSA: Сывороточный альбумин крупного рогатого скота	Sigma	A7906
CaCl2: хлорид кальция	сигма	223506
коллагеназа (смесь типа H)	Покровное стекло Sigma	C8051
(2.4 × 5.0 cm)	ThermoFisher Scientific	12-548-5M
Acquision Digitizer	Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния, США	Digidata 1550A
Диссекционная чашка (стакан Петри с древесным углем дном)	Приборы для живых систем, Сент-Олбанс-Сити, Вермонт, США	DD-90-S-BLK
Дитиоэритритол	Sigma	D8255
ДМСО: диметилсульфоксид	Sigma	D8418
Эластаза (поджелудочная железа свиньи)	Sigma	E7885
Трекер эндоплазматического ретикулума (ER-Tracker красный, глибенкламид BODIPY TR)	ThermoFisher Scientific	E34250
Волоконно-оптические источники света	Шотт, Майнц, Германия и KL200, Zeiss	Fostec 8375
Клапан управления потоком	Warner Instruments	FR-50
Интерфейс флуоресцентной системы, дуговая лампа и источник питания, гиперпереключатель и	молекулярные устройства PMT, Саннивейл, Калифорния, США	Системы IonOptix Щипцы
(с тонким наконечником, заточенные)	FST	Dumont #5 & Dumont #55
Функциональный генератор	EZ Digital, Сеул, Южная Корея	FG-8002
Fura-2 AM краситель	Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США	F14185
Глюкоза	Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США)	G7021
HCl: Соляная кислота	ThermoFisher Scientific (Питтсбург, Пенсильвания, США	)A466250
	Headstages Molecular Устройства	HS-2A & HS-9A
HEPES: (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинитансульфоновая кислота)	Sigma	H4034
Поточный нагреватель раствора	Warner Instruments	SH-27B
KCl: хлорид калия	Sigma	P9541
MgCl2: хлорид магния	Sigma	M2670
Microforge	Narishige, East Meadow, NY, США	; MF-900
Микроманипулятор	Siskiyou	Съемник микропипеток MX10
(цифровой)	Sutter Instruments, Новато, Калифорния, США	Микроскоп P-97 или P-1000
(Nikon-инвертированный)	Nikon Instruments Inc, Мелвилл, Нью-Йорк, США	Ts2
(Nikon-инвертированный)	Объективы микроскопа Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
	Instruments Inc	20X (S-Fluor) и 40X (Plan Fluor)
Платформа для микроскопа (анодированный алюминий; диаметр, 7,8 cm)	Warner Instruments	PM6 или PH6
Столик для микроскопа (алюминий)	Siskiyou, Grants Pass, OR, США	8090P
Контроллер микрошприцевого насоса	World Precision Instruments (WPI), Сарасота, Флорида, США	SYS-MICRO4
MTA: 2-метилтиоадендифосфат тринатриевая соль	Tocris	1624
NaCl: хлорид натрия	сигма	S7653
NaOH: Гидроксид натрия	Sigma	S8045
Ядерный краситель (реагент NucBlue Live ReadyProbes; Hoechst 33342)	Осциллограф ThermoFisher Scientific	R37605
Tektronix, Бивертон, Орегон, США		TDS 2024B
Papain	Sigma	P4762
Фазово-контрастные объективы	Nikon Instruments Inc	( Ph1 DL; 10X & 20X)
Окрашивание плазматической мембраны (CellMask Deep Red)	ThermoFisher Scientific	C10046
Plexiglas суперфузионная камера	Warner Instruments, Камден, Коннектикут, США	RC-27
(лезвия 3 мм и 7 мм)	Fine Science Tools (или FST), Фостер-Сити, Калифорния, США	Ножницы Moria MC52 и 15000-00
(стиль Ваннас; 9.5 мм & 3 мм лезвия)	World Precision Instruments	555640S, 14364
Стереомикроскопы	Zeiss, Нью-Йорк, США	Stemi 2000 & 2000-C
Шприцевой фильтр (0,22 & микро; m)	Терморегулятор ThermoFisher Scientific	722-2520
(двухканальный)	Warner Instruments	TC-344B или C
Система управления клапанами	Warner Instruments	VC-6
Виброизоляционный стол	Техническое производство, Пибоди, Массачусетс, США	Микро-г

Data Микроскоп Nikon Ножницы

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22290-22295 (2010).
Longden, T. A., et al.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Выделение и функциональный анализ артериолярного эндотелия паренхимы головного мозга мыши

В этой статье

Краткое содержание

Аннотация

Введение

Протокол

Результаты

Обсуждение

Раскрытие информации

Благодарности

Материалы

Ссылки

Перепечатки и разрешения

Теги

Похожие статьи