Method Article

Выделение микровезикул селезенки на мышиной модели внутрибрюшинной бактериальной инфекции

DOI:

10.3791/63480

⸱

April 13th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Universite de Strasbourg, 2Regenerative Nanomedicine, Centre de Recherche en Biomédecine de Strasbourg, INSERM (French National Institute of Health and Medical Research)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микровезикулы, выделяющиеся из плазматической мембраны, действуют как клеточные эффекторы. Микровезикулы селезенки (СМВ) являются суррогатными маркерами патофизиологических состояний. У крыс и мышей содержание и свойства SMV характеризуют старение или воспаление и изменяются под действием цитопротекторных препаратов, что делает их ценным и в то же время обильным инструментом мониторинга для доклинических исследований.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микровезикулы (МВ) представляют собой субмикронные фрагменты, высвобождаемые из плазматической мембраны активированных клеток, которые действуют как провоспалительные и прокоагулянтные клеточные эффекторы. У крыс МВ селезенки (МВ) являются суррогатными маркерами патофизиологических состояний. Предыдущие исследования in vitro показали, что Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis), основной патоген пародонта, способствует выделению эндотелия и апоптозу, в то время как липополисахарид (ЛПС) способствует выделению микровезикул, полученных из спленоцитов (SMV). Исследования in vivo показали целесообразность фармакологического контроля выделения СМВ. Настоящий протокол устанавливает стандартизированную процедуру выделения СМВ селезенки из модели острой мышиной инфекции P. gingivalis. Инфекция P. gingivalis индуцировалась у молодых мышей C57BL/6 путем внутрибрюшинного введения (три инъекции 5 x 10-7 бактерий в неделю). Через две недели были собраны селезенки, взвешены и подсчитаны спленоциты. SMV были выделены и количественно определены с помощью анализов белка, РНК и протромбиназы. Жизнеспособность клеток оценивали либо с помощью йодида пропидия, либо с помощью исключающих красителей трипанового синего. После экстракции спленоцитов количество нейтрофилов получали методом проточной цитометрии через 24 ч культивирования спленоцитов. У мышей, которым вводили P. gingivalis, наблюдалось увеличение массы селезенки в 2,5 раза и увеличение количества спленоцитов в 2,3 раза, в то время как количество нейтрофилов увеличилось в 40 раз. Клеточная жизнеспособность спленоцитов мышей, которым вводили P. gingivalis, варьировала от 75% до 96% и снижалась на 50% после 24 ч культивирования без какой-либо существенной разницы по сравнению с контрольной группой, не подвергавшейся воздействию. Тем не менее, спленоциты от инъекционных мышей выделяли большее количество MV с помощью анализа протромбиназы или измерения белка. Данные показывают, что прокоагулянтные SMV являются надежными инструментами для оценки раннего ответа селезенки на внутрибрюшинную инфекцию P. gingivalis.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микровезикулы (МВ), также называемые микрочастицами или эктосомами, представляют собой фрагменты плазматической мембраны диаметром 0,1-1,0 мкм, выделяемые в жидкостях организма и внеклеточном пространстве в ответ на различные клеточные стимулы. Впервые идентифицированные как тромбоцитарная пыль, обнажающая прокоагулянтные фосфолипиды, в основном фосфатидилсерин (PSer), MV представляют собой дополнительную поверхность для сборки комплексов свертывания крови 1,2. Ключевая роль циркулирующих MV в качестве прокоагулянтных эффекторов была продемонстрирована у пациентов с синдромом Скотта2, редким генетическим заболеванием, которое приводит к дисфункциональному воздействию PSer и кровотечению (дополнительный рисунок 1). МВ широко изучались в качестве циркулирующих биомаркеров тромботического риска при хронических заболеваниях, связанных с сердечно-сосудистыми расстройствами, таких как диабет, хроническая болезнь почек, преэклампсия и гипертензия 3,4. В настоящее время они признаны истинными клеточными эффекторами в жидкостях или тканях органов, таких как миокард1. Поскольку они передают активные белки, липиды и микроРНК, они дистанционно модулируют сосудистые реакции, такие как гемостаз, воспаление, сосудистый ангиогенез и рост сосудов илиремоделирование тканей.

В то время как в клинических исследованиях изучается прогностическая ценность МВ в отношении факторов риска, МВ, выделенные из жидкостей или тканей пациента, позволяют ex vivo оценить их эффекторные свойства6. Расшифровка механизмов, управляющих биогенезом МВ и способностью к перекрестным помехам, обычно достигается в моделях клеточных культур для идентификации активных молекул, подвергающихся воздействию или инкапсулированных внутри МВ, и их нисходящей сигнализации. Взаимодействие MV с клетками-мишенями будет зависеть от связывания мембранного белка/белка, при наличии соответствующих контрлигандов и/или слияния липидов7.

В физиологических условиях МВ, циркулирующие в плазме, в основном происходят из сосудистых клеток, что идентифицируется маркерами дифференцировки кластеров линии (CD)8,9. Однако при патологии, особенно при раке10 и отторжении трансплантата 11,12, МВ выделяются из поврежденной ткани и обладают вредными прокоагулянтными и провоспалительными свойствами. Они обнаруживаются в системном кровотоке, что делает их полезными зондами для мониторинга защитной или омолаживающей терапии, а также возможных фармакологических мишеней13. Поскольку МВ циркулируют в виде динамического накопительного пула, отражающего гомеостаз сосудистых и тканевых клеток в норме и при заболеваниях, необходимо также исследовать более глубокое понимание их отдаленного действия in vivo, после внутривенного введения или назального инстилляции у мелких животных14,15. Действительно, МВ считаются основными участниками сложных путей, связывающих чрезмерное воспаление и тромбоз16.

Пародонтит – это воспалительное заболевание инфекционного происхождения, поражающее ткани, поддерживающие зуб17,18 и связанное с риском тромбоза. Он характеризуется кровоточивостью десен, разрушением альвеолярной кости, подвижностью зубов и в конечном итоге может привести к потере зубов. Пародонтит широко распространен во всем мире и поражает более 50% населения, причем 11% имеют тяжелую форму19. Пародонтит индуцируется бактериальным дисбиозом поддесневых биопленок, которые поддерживают обостренную воспалительную реакцию, вызывающую разрушение тканей20. В течение последнего десятилетия пародонтит был связан с системными заболеваниями, такими как сердечно-сосудистые заболевания, диабет и ревматоидный артрит. Возможными объяснениями являются действие пародонтальных патогенов на расстоянии и/или усиление системного воспаления, опосредованного провоспалительными цитокинами, такими как интерлейкин (IL-1, IL-6) и TNF-α21,22.

Среди патогенов, ассоциированных с возникновением и развитием пародонтита, Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis)23 обнаруживается при наиболее тяжелых поражениях, которые собирают несколько факторов вирулентности, включая липополисахарид (ЛПС)24, индуцирующий воспалительные реакции, опосредованные Toll-подобными рецепторами (TLR)25 и рекрутирование нейтрофилов и полиморфноядерных лейкоцитов (ПМН) в месте первоначальной инфекции26. ЛПС P. gingivalis активирует TLR-4 или TLR-2, способствуя иммунному обнаружению и уклонению от выживания бактерий27. На сосудистом уровне активация TLR2 с помощью ЛПС связана с иммунотромбозом. Уникальная способность P. gingivalis вызывать передачу сигналов TLR-2 в то время как TLR-4-зависимое распознавание значительно нарушено, способствует стойкой инфекции низкой степенизлокачественности 28,29.

Процедуры in vivo для изучения реакции MV на хроническую и устойчивую инфекцию возбудителя низкой степени злокачественности редки. Методологические подходы к экстракции тканевых МВ слабо описаны в литературе и в основном касаются забора МВ из патологических тканей, таких как солидные опухоли, стеатоз печени, атеротромботические бляшки или трансплантаты 11,29,30, в то время как селезенка воспринимает бактерии и вирусы в кровотоке. Он также хранит эритроциты, тромбоциты, лимфоциты, моноциты, базофилы и эозинофилы, участвующие в иммунном ответе. Гранулоциты, такие как нейтрофилы из красной пульпы, также генерируют активные формы кислорода (АФК) и протеазы, которые уничтожают патогены и предотвращают распространение инфекции31,32. Удивительно, но, насколько нам известно, МВ селезенки не исследуются в контексте вызванных патогенами повреждений тканей. Существует глобальная неудовлетворенная потребность в изучении вариаций ципсулярных МВ в физиопатологии.

Данные in vitro из нашей лаборатории показали, что ЛПС индуцирует выделение прокоагулянтных МВ из спленоцитов крыс, что, в свою очередь, вызывает старение культивируемых коронарных эндотелиальных клеток и последовательный провоспалительный и прокоагулянтный эндотелиальный фенотип11. Возможность фармакологического контроля МВ селезенки была дополнительно продемонстрирована после лечения животного оптимизированной формулой омега-3. Было обнаружено, что пероральный зонд крыс среднего и пожилого возраста защищает как от выделения прокоагулянтных MV из спленоцитов, так и от их старческих вредных свойств по отношению к коронарному эндотелию33.

По сравнению с кровью, селезенка имеет то преимущество, что является важным источником лейкоцитов у одного человека. Кроме того, недавно была предложена ось селезенка-сердце 3,34, что делает селезенку возможным фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний, связанного с инфекцией, представляющим полезный интерес для фармакологического контроля. Оценка свойств или высвобождения SMV является ключом к пониманию патогенных или воспалительных реакций. Интересно, что это может быть достигнуто у обработанных животных и при различных физиопатологических моделях (возраст, гипертония, диабет). Действительно, сравнивая крыс среднего и старого возраста33, различия в свойствах и высвобождении МВ селезенки могут быть доказаны после простого 24-часового посева спленоцитов.

Учитывая вышеуказанные свидетельства изменения эффекторных свойств МВ селезенки в зависимости от физиопатологического состояния и целесообразность их фармакологического контроля у крыс, в настоящем документе описан стандартизированный протокол выделения МВ селезенки мышей. Эта процедура лучше подходит для углубленных исследований in vivo механизмов, поддерживающих SMV-опосредованные эффекты, в конечном итоге у сконструированных мышей. Процедура была установлена на мышах C57BL/6 с использованием местной внутрибрюшинной инфекции P. gingivalis, чтобы установить доказательства отдаленного действия патогена на эффекторные свойства MV селезенки (SMV).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все протоколы экспериментов были одобрены и составлены в соответствии с соответствующими руководящими принципами местного Комитета по этике (APAFIS#28745-2020121815051557) и службы по уходу за животными Университета по дому и INSERM. Для экспериментов использовали самцов молодых мышей C57BL/6 в возрасте 6-8 недель. Мышей регулярно обследовали для оценки боли и стресса, а их вес контролировался ежедневно. Если не указано иное, все экстрагирующие буферы и растворы должны быть стерильными и иметь комнатную температуру.

1. Подготовка животных

  1. Вводите мышам шесть внутрибрюшинных инъекций P. gingivalis (PG) каждые 2 дня в течение 2 недель (три инъекции 5 x 107 бактерий в неделю, Дополнительный файл 1).
  2. Обезболите мышей комбинацией 100 мг/кг кетамина и 10 мг/кг ксилазина.
  3. Принесите в жертву мышей, находящихся под наркозом, и соберите селезенку после лапаротомии.
    Примечание: Конкретные условия заражения P. gingivalis и жертвоприношения животных для сбора селезенки подробно описаны в разделе «Эксперимент на животных» Дополнительного файла 1. Схематическое изображение этапов протокола показано на рисунке 1.

2. Экстракция спленоцитов

  1. Используя скальпель, измельчите ткань селезенки на ломтики ~1 мм в чашке Петри, уже заполненной 3 мл RPMI, содержащей антибиотики (стрептомицин (100 ЕД/мл)/пенициллин (100 ЕД/мл), фунгизон (250 мг/мл), L-глютамин (2 мМ)), и с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS) (см. Таблицу материалов).
  2. Переложите ломтики на сито (см. Таблицу материалов), которое заранее прикреплено к полистирольной трубке объемом 50 мл.
  3. С помощью поршня шприца в качестве пестика раздавите салфетки на сите.
  4. Промойте сито средой RPMI (3 мл).
  5. Центрифугируйте клеточную суспензию, элюируйте при 450 х г в течение 5 мин при комнатной температуре и осторожно выбросьте надосадочную жидкость с помощью обратного потока.

3. Удаление эритроцитов с помощью осмотического шока

  1. Добавьте 1 мл буфера ACK (см. Таблицу материалов), хорошо перемешайте, инкубируйте в течение 3 минут при комнатной температуре и осторожно встряхивайте, вращая рукой.
  2. Разбавьте, добавив 9 мл RPMI, и хорошо перемешайте с помощью аспирации и обратного потока.
  3. Центрифуга при давлении 450 х г в течение 5 минут при комнатной температуре.
  4. Выбросьте надосадочную жидкость путем аспирации и обратного потока и повторно суспендируйте гранулу в 5 мл среды RPMI.
  5. Осторожно перемешайте (аспирация/обратный поток) и в конечном итоге удалите липидный мусор с помощью пипетирования или с помощью сита.

4. Корректировка концентрации выделенных спленоцитов

  1. Заполните микропробирку объемом 1,5 мл, содержащую 900 мкл RPMI.
  2. С помощью микропипетки возьмите 100 мкл клеточной суспензии, добавьте в микропробирку объемом 1,5 мл, содержащую 900 мкл среды RPMI, и хорошо перемешайте.
  3. Перенесите 10 мкл разведенных клеток в микропробирку, добавьте 10 мкл трипанового синего эксклюзионного красителя и хорошо перемешайте.
  4. Поместите 10 μL раствора (шаг 3.3) в предметное стекло автоматического счетчика клеток (см. Таблицу материалов) и определите количество клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение устройства выдает два значения: общее количество клеток и количество живых клеток и процент.
  5. Отрегулируйте концентрацию живых клеток до 3 или 5 x 106 клеток/мл (Vmax = 20 мл; максимальная общая емкость составляет 100 x 106 клеток/мл).
  6. Поместите клетки в колбу объемом 75 мл, содержащую RPMI.
  7. Инкубируйте колбу вертикально во влажном инкубаторе при температуре 37 °C в течение 24 часов.
    ВНИМАНИЕ: Трипановый синий является мутагенным и канцерогенным агентом35,36. Обязательно надевайте перчатки во время подсчета, даже снаружи капюшона. Немедленно выбросьте наконечники и жидкости в контейнеры и вымойте поверхность скамейки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если собранные клетки меньше 50 x 106, используйте колбу для культур объемом 25 мл. Номер ячейки не должен сильно отличаться от одного человека к другому. Процент живых клеток обычно превышает 80% на этом этапе.

5. Выделение микровезикул спленоцитов

  1. Через 24 ч высыпать содержимое колбы в полипропиленовую или полистирольную пробирку объемом 50 мл.
  2. Центрифуга при 450 x g в течение 15 минут при комнатной температуре для удаления клеток и мусора.
  3. После центрифугирования оставьте 100 мкл 1-го надосадочной жидкости (SN1) для возможного измерения начальной концентрации MV для расчета выхода изоляции. Обратите внимание на том SN1.
  4. Центрифугируйте SN1 при давлении 450 x g в течение 15 минут при комнатной температуре.
  5. Выбросьте гранулы и снова центрифугируйте при 450 x g в течение 15 минут при комнатной температуре. Быстро извлеките и соберите SN2 (обратите внимание на громкость).
  6. Перенесите SN2 в микропробирки объемом 1,8 мл с коническим дном. Храните 100 мкл SN2 для возможного измерения исходной концентрации MV для расчета выхода изоляции в случае, если слишком большое количество мусора в конечном итоге ухудшит измерение MV в SN1.
  7. Добавьте 5 мл среды RPMI в гранулу (клетки) и подсчитайте количество спленоцитов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточная суспензия также может быть зафиксирована для определения характеристик проточной цитометрии в 0,1% параформальдегида (конечная концентрация)37.
  8. Центрифугируйте SN2 при 14 000 x g в течение 1 ч при 4 °C и в конечном итоге предварительно охладите ротор, запустив пустой ротор при 4 °C. На этом шаге генерируется SN3.
  9. Немедленно извлеките SN3 из каждой микропробирки, перевернув одну стерильную пробирку объемом 50 мл (под колпаком). Обратите внимание на том SN3.
  10. Аккуратно перемешайте SN3 с помощью пипетки под колпаком. Храните аликвоты для возможных измерений в суспензии.
    Примечание: Раствор в настоящее время истощен MV, но содержит растворимые медиаторы и экзосомы.
  11. Соскребите каждую микротрубку (закрытую) на решетке с шипами, чтобы механически способствовать повторной суспензии MV в грануле.
  12. Добавьте 200 мкл сбалансированного физиологического раствора Хэнка без Ca2+ и Mg2+ (HBSS) в первую микропробирку (см. Таблицу материалов).
  13. Ресуспендируйте гранулу MV из первой пробирки с помощью щадящих циклов аспирации/обратного потока (~10 раз) с помощью микропипетки объемом 1 мл. Будьте очень осторожны, чтобы избежать пенообразования, так как это будет способствовать окислению везикул и других фрагментов в суспензии.
  14. Соберите первые 200 μл ресуспендированных MV и вылейте их во вторую пробирку над гранулой. Аккуратно перемешайте, как указано выше, а затем снова вылейте в третью трубку и аккуратно перемешайте. Суспензия становится все более мутной от трубки к трубке. Закройте третью трубку.
  15. Начните забор следующих трех микропробирок, как указано выше (шаг 4.14).
  16. Соберите все ресуспендированные МВ в одну (или две) коллекторные микропробирки (2 мл с коническим дном). Оставьте 50 мкл для окончательного расчета выхода на этом этапе. Обратите внимание на объем суспензии.
  17. Центрифугируйте коллекторную трубку при давлении 14 000 x g в течение 1 ч при 4 °C. На этом шаге генерируется SN4.
  18. Немедленно выбросьте SN4 (залейте пробирку для сбора надосадочной жидкости). Сохраните аликвоту SN4 для расчета выхода на этапе очистки и аккуратно ресуспендируйте гранулу в 500 мкл HBBS (без Ca2+ и Mg2+). Сохраните аликвоту в 50 мкл ресуспендированной гранулы, чтобы рассчитать выход очистки и отметить ее объем.
  19. Ресуспендированную гранулу хранят при температуре 4 °C до одного месяца для функциональных анализов в стерильных условиях или при -20 °C для структурных анализов.
  20. Рассчитайте выход очистки (см. ПРИМЕЧАНИЕ ниже) каждого этапа или всей процедуры, измерив концентрацию МТ в надосадочной жидкости и/или суспензиях гранул.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выход очистки (%): ([MV1] x объем SN1) / ([MV4] x конечный объем суспензии) x 100.
    Этот выход должен быть рационализирован до количества спленоцитов, выделенных из колбы с культурой и подсчитанных на шаге 4.4. Выход очистки в данном эксперименте составляет ~70%, начиная со 111 х 106 клеток и 60 мл надосадочной жидкости.
    1. Оцените потерю SMV, вызванную процедурой, путем измерения SMV, оставшихся в надосадочной жидкости, обедненных SMV и в основном содержащих экзосомы (SN2 и SN4).
    2. Измерьте концентрацию MV с помощью TRPS или анализа протромбиназы38 для получения высокой чувствительности и специфичности.
      ВНИМАНИЕ: Соберите MV после центрифугирования путем быстрой заливки надосадочной жидкости вверх ногами. Ожидание или использование U-образных микротрубок приведет к потере MV на стенке микротрубки. Никогда не используйте микропипетку для удаления надосадочной жидкости; Вместо этого гранулу можно аспирировать. Никогда не откладывайте процесс после остановки центрифуги. Превышение частоты вращения центрифугирования приведет к загрязнению гранулы MV экзосомами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость и продолжительность центрифугирования оптимизированы для обогащения MV с минимальным загрязнением экзосомами. Этот протокол ненадежен для изучения МВ моноцитов/макрофагов селезенки, поскольку эти клетки могут фагоцитировать и быстро захватывать свои собственные МВ39. Протокол не может быть приостановлен и возобновлен позже из-за потери клеток из-за жизнеспособности клеток.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Предоставленные данные дают полное представление о всей процедуре с использованием двух основных условий на животных: контрольные молодые мыши C57BL/6 без лечения и их однопометники, подвергавшиеся шести внутрибрюшинным (IP) инъекциям PG каждые 2 дня в течение 2 недель. Они также показывают отдаленное действие внутрибрюшинной инъекции ПГ на реакцию селезенки через 2 недели. Микровезикулы спленоцитов количественно определяли либо с помощью ферментативного анализа протромбиназы, либо путем измерения концентрации их белков ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящее исследование подтверждает, что селезенка является основным и надежным источником МВ с физиологической значимостью по сравнению с другими источниками, такими как кровь, ограниченного объема у мышей. При условии соблюдения мер предосторожности метод прост в настройке и не требует дорогостоящего оборудования. Поскольку альтернативного способа, кроме оценки in vivo , не существует, нынешняя модель представляется ценным методом изучения влияния про-лекарств на выделение MV....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы выражают признательность Клодин Эбель (Claudine Ebel) из Service commun de cytométrie en flux (Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Strasbourg) за экспертную помощь и проведение комплексного анализа проточной цитометрии селезенки и Али Эль Хабхабу (Ali El Habhab) за начальное обучение по мечению клеток селезенки крыс. Дениз Карагёз помогал в раскопках, сборе литературы. Эта работа была частично поддержана двумя грантами ANR COCERP (N°A17R417B), ENDOPAROMP (N°ANR-17-CE17-0024-01).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2 мл пробирки типа EppendorfDutscher54816Коническое дно sté riel микропробирки
Allegra 64 R CentrifugeBeckman Coulter
Автоматический счетчик клетокBiorad
Bovine serum albuminEuromedex04-100-812-EПодготовленный, отфильтрованный с 0,22 &; m и хранить при температуре 4°С; С в стерильных условиях с использованием следующих формул: 2 мМ ЭДТА, 0,5% БСА и стерильные PBS
CD11 (Mac-1)e-Biosciences45-00112-80Конъюгированные с eFluor 450; λ <суб>макс возбуждение 405 нм &лямбда; max излучение 445 нм
CD16/32BD Biosciences553142несопряженная
EDTACalbiochemCalbiochemS 6381-92-6
Falcon tubeКлеточнаязвезда 22726150 мл
фетальной бычьей сывороткиDutscherS1810-500Номер партии = S14028S1810
Fortessa AriaBD Biosciencesдля сортировка клеток
проточным цитометром FortessaBecton-Dickinson.
ФунгизонPAN biotechP06-01050
HBSSGibco14175-053Без фенола красного, без Ca+2 и Mg+2
ICAM-1abcamab171123
LYG-6 (Gr-1)BD Biosciences566218Конъюгирован с BUV395; &лямбда; max возбуждение 348 нм, λ <суб>макс излучение 395 нм
Лизисные буферные эритроциты (ACK)SigmaPrepared, отфильтрованные с 0,22 &микро; m просеивают и хранят при температуре 4°С; C в стерильных условиях по следующим формулам: NH4Cl, 0,15 M (молярность), 53,491 (mw) 4 г
KHCO3 1 mM (молярность) 100,115 (mw), 50 мг
EDTA  0,1 мМ (молярность), 292,24 (мВт), 14,6 г<бр/> рН: 7,2&нда; 7.4
Спектрофотометр NanoDrop 1000Thermoscientific
PBSLonza17-516Fбез Ca+2  и Mg+2
Пластиковая чашка100 мм
Полистирольная трубкаFalcon352070
q-Nano GoldiZON science
Питательная среда RPMI 1640: 2 г/л глюкозыPAN biotechp04-18047С добавлением стрептомицина (100 Ед/мл) / пенициллина (100 Ед/мл), фунгизона (250 мг/мл), L-глутамина (2 мМ) и FBS 10%.
Скальпели
Сито НейлонСокол США352360100 & микро; m
Стрептомицин/ПенициллинPAN biotechP06-07100
Шприц2 мл
Trypan BlueBiorad1450013
VCAM1abcam ab215380
Петри

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Loyer, X., et al. Intra-cardiac release of extracellular vesicles shapes inflammation following myocardial infarction. Circulation Research. 123 (1), 100-106 (2018).
  2. Aupeix, K., Toti, F., Satta, N., Bischoff, P., Freyssinet, J. M. Oyxsterols induce membrane procoagulant activity in monocytic THP-1 cells. Biochemical Journal. 314 (3), 1027-1033 (1996).
  3. Emami, S., et al. Antibiotic resistance pattern and distribution of pslA gene among biofilm producing Pseudomonas aeruginosa isolated from waste water of a burn center. Jundishapur Journal of Microbiology. 8 (11), 23669(2015).
  4. Burger, D., et al. Microparticles: biomarkers and beyond. Clinical Science. 124 (7), 423-441 (2013).
  5. Braeckmans, K., et al. Sizing nanomatter in biological fluids by fluorescence single particle tracking. Nano Letters. 10 (11), 4435-4442 (2010).
  6. Chironi, G. N., et al. Endothelial microparticles in diseases. Cell and Tissue Research. 335 (1), 143-151 (2009).
  7. Meldolesi, J. Exosomes and ectosomes in intercellular communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
  8. Chen, T. S., et al. Mesenchymal stem cell secretes microparticles enriched in pre-microRNAs. Nucleic Acids Research. 38 (1), 215-224 (2010).
  9. Pirro, M., et al. Microparticles derived from endothelial progenitor cells in patients at different cardiovascular risk. Atherosclerosis. 197 (2), 757-767 (2008).
  10. Zahra, S., Anderson, J. A., Stirling, D., Ludlam, C. A. Microparticles, malignancy and thrombosis. British Journal of Haematology. 152 (6), 688-700 (2011).
  11. Amoura, L., et al. Assessment of plasma microvesicles to monitor pancreatic islet graft dysfunction: Beta cell- and leukocyte-derived microvesicles as specific features in a pilot longitudinal study. American Journal of Transplantation. 20 (1), 40-51 (2020).
  12. De Rop, C., et al. Evaluation of tissue factor bearing microparticles as biomarkers in allogeneic stem-cell transplantation. Transplantation. 92 (3), 351-358 (2011).
  13. de Abreu, R. C., et al. Native and bioengineered extracellular vesicles for cardiovascular therapeutics. Nature Reviews Cardiology. 17 (11), 685-697 (2020).
  14. Beitler, J. R., et al. Advancing precision medicine for acute respiratory distress syndrome. The Lancet Respiratory Medicine. 10 (1), 107-120 (2022).
  15. Porro, C., et al. Proinflammatory effect of cystic fibrosis sputum microparticles in the murine lung. Journal of Cystic Fibrosis. 12 (6), 721-728 (2013).
  16. Boisrame-Helms, J., et al. Lipid emulsions differentially affect LPS-induced acute monocytes inflammation: in vitro effects on membrane remodeling and cell viability. Lipids. 49 (11), 1091-1099 (2014).
  17. Kinane, D. F., Stathopoulou, P. G., Papapanou, P. N. Authors' reply: Predictive diagnostic tests in periodontal diseases. Nature Reviews Disease Primers. 3 (1), (2017).
  18. Kinane, D. F., Stathopoulou, P. G., Papapanou, P. N. Periodontal diseases. Nature Reviews Disease Primers. 3 (1), 1-14 (2017).
  19. Kassebaum, D. K., Tedesco, L. A. The 21(st)-century dental curriculum: a framework for understanding current models. Journal of Dental Education. 81 (8), 13-21 (2017).
  20. Hajishengallis, G., Chavakis, T., Hajishengallis, E., Lambris, J. D. Neutrophil homeostasis and inflammation: novel paradigms from studying periodontitis. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 539-548 (2015).
  21. Suh, J. S., et al. Periodontitis-induced systemic inflammation exacerbates atherosclerosis partly via endothelial-mesenchymal transition in mice. International Journal of Oral Science. 11 (3), 21(2019).
  22. Bugueno, I. M., et al. Porphyromonas gingivalis triggers the shedding of inflammatory endothelial microvesicles that act as autocrine effectors of endothelial dysfunction. Scientific Reports. 10 (1), 1778(2020).
  23. Hajishengallis, G., Lamont, R. J. Breaking bad: manipulation of the host response by Porphyromonas gingivalis. European Journal of Immunology. 44 (2), 328-338 (2014).
  24. Lamont, T., Worthington, H. V., Clarkson, J. E., Beirne, P. V. Routine scale and polish for periodontal health in adults. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 12, (2018).
  25. Huck, O., et al. Reduction of articular and systemic inflammation by Kava-241 in a Porphyromonas gingivalis-induced arthritis murine model. Infection and Immunity. 86 (9), 00356(2018).
  26. Sochalska, M., Potempa, J. Manipulation of neutrophils by Porphyromonas gingivalis in the development of periodontitis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 197(2017).
  27. Kocgozlu, L., Elkaim, R., Tenenbaum, H., Werner, S. Variable cell responses to P. gingivalis lipopolysaccharide. Journal of Dental Research. 88 (8), 741-745 (2009).
  28. Slocum, C., et al. Distinct lipid a moieties contribute to pathogen-induced site-specific vascular inflammation. PLOS Pathogens. 10 (7), 1004215(2014).
  29. Thietart, S., Rautou, P. E. Extracellular vesicles as biomarkers in liver diseases: A clinician's point of view. Journal of Hepatology. 73 (6), 1507-1525 (2020).
  30. Witek, R. P., et al. Liver cell-derived microparticles activate hedgehog signaling and alter gene expression in hepatic endothelial cells. Gastroenterology. 136 (1), 320-330 (2009).
  31. Tahir, F., Ahmed, J., Malik, F. Post-splenectomy sepsis: a review of the literature. Cureus. 12 (2), 6898(2020).
  32. Hussain, M., Stover, C. M., Dupont, A. P. gingivalis in periodontal disease and atherosclerosis - scenes of action for antimicrobial peptides and complement. Frontiers in Immunology. 6, 45(2015).
  33. Qureshi, A. W., et al. Ageing enhances the shedding of splenocyte microvesicles with endothelial pro-senescent effect that is prevented by a short-term intake of omega-3 PUFA EPA:DHA 6:1. Biochemical Pharmacology. 173, 113734(2020).
  34. Dunford, A., Keramida, G., Anagnostopoulos, C. D., Michael Peters, A. The cardiosplenic axis: another obscure pathophysiological function of the spleen and its investigation using molecular imaging. Nuclear Medicine Communications. 38 (3), 205-208 (2017).
  35. Ford, R. J., Becker, F. F. The characterization of trypan blue-induced tumors in Wistar rats. The American Journal of Pathology. 106 (3), 326-331 (1982).
  36. Field, F. E., et al. Trypan blue: identification and teratogenic and oncogenic activities of its coloured constituents. Chemico-Biological Interactions. 16 (1), 69-88 (1977).
  37. Covarrubias, R., et al. Optimized protocols for isolation, fixation, and flow cytometric characterization of leukocytes in ischemic hearts. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 317 (3), 658-666 (2019).
  38. El Habhab, A., et al. Significance of neutrophil microparticles in ischaemia-reperfusion: Proinflammatory effectors of endothelial senescence and vascular dysfunction. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (13), 7266-7281 (2020).
  39. Freyssinet, J. M. Cellular microparticles: what are they bad or good for. The Journal of Thrombosis and Haemostasist. 1 (7), 1655-1662 (2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Splenic MicrovesiclesMicrovesicle IsolationMurine Infection ModelIntraperitoneal InfectionProthrombinase AssayFlow CytometryCell ViabilitySplenocyte ExtractionNeutrophil CountProcoagulant Microvesicles
Video Coming Soon

Related Articles