Микровезикулы, выделяющиеся из плазматической мембраны, действуют как клеточные эффекторы. Микровезикулы селезенки (СМВ) являются суррогатными маркерами патофизиологических состояний. У крыс и мышей содержание и свойства SMV характеризуют старение или воспаление и изменяются под действием цитопротекторных препаратов, что делает их ценным и в то же время обильным инструментом мониторинга для доклинических исследований.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение микровезикул селезенки на мышиной модели внутрибрюшинной бактериальной инфекции
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Микровезикулы (МВ) представляют собой субмикронные фрагменты, высвобождаемые из плазматической мембраны активированных клеток, которые действуют как провоспалительные и прокоагулянтные клеточные эффекторы. У крыс МВ селезенки (МВ) являются суррогатными маркерами патофизиологических состояний. Предыдущие исследования in vitro показали, что Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis), основной патоген пародонта, способствует выделению эндотелия и апоптозу, в то время как липополисахарид (ЛПС) способствует выделению микровезикул, полученных из спленоцитов (SMV). Исследования in vivo показали целесообразность фармакологического контроля выделения СМВ. Настоящий протокол устанавливает стандартизированную процедуру выделения СМВ селезенки из модели острой мышиной инфекции P. gingivalis. Инфекция P. gingivalis индуцировалась у молодых мышей C57BL/6 путем внутрибрюшинного введения (три инъекции 5 x 10-7 бактерий в неделю). Через две недели были собраны селезенки, взвешены и подсчитаны спленоциты. SMV были выделены и количественно определены с помощью анализов белка, РНК и протромбиназы. Жизнеспособность клеток оценивали либо с помощью йодида пропидия, либо с помощью исключающих красителей трипанового синего. После экстракции спленоцитов количество нейтрофилов получали методом проточной цитометрии через 24 ч культивирования спленоцитов. У мышей, которым вводили P. gingivalis, наблюдалось увеличение массы селезенки в 2,5 раза и увеличение количества спленоцитов в 2,3 раза, в то время как количество нейтрофилов увеличилось в 40 раз. Клеточная жизнеспособность спленоцитов мышей, которым вводили P. gingivalis, варьировала от 75% до 96% и снижалась на 50% после 24 ч культивирования без какой-либо существенной разницы по сравнению с контрольной группой, не подвергавшейся воздействию. Тем не менее, спленоциты от инъекционных мышей выделяли большее количество MV с помощью анализа протромбиназы или измерения белка. Данные показывают, что прокоагулянтные SMV являются надежными инструментами для оценки раннего ответа селезенки на внутрибрюшинную инфекцию P. gingivalis.
Введение
Микровезикулы (МВ), также называемые микрочастицами или эктосомами, представляют собой фрагменты плазматической мембраны диаметром 0,1-1,0 мкм, выделяемые в жидкостях организма и внеклеточном пространстве в ответ на различные клеточные стимулы. Впервые идентифицированные как тромбоцитарная пыль, обнажающая прокоагулянтные фосфолипиды, в основном фосфатидилсерин (PSer), MV представляют собой дополнительную поверхность для сборки комплексов свертывания крови 1,2. Ключевая роль циркулирующих MV в качестве прокоагулянтных эффекторов была продемонстрирована у пациентов с синдромом ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все протоколы экспериментов были одобрены и составлены в соответствии с соответствующими руководящими принципами местного Комитета по этике (APAFIS#28745-2020121815051557) и службы по уходу за животными Университета по дому и INSERM. Для экспериментов использовали самцов молодых мышей C57BL/6 в возрасте 6-8 недель. Мышей регулярно обследовали для оценки боли и стресса, а их вес контролировался ежедневно. Если не указано иное, все экстрагирующие буферы и растворы должны быть стерильными и иметь комнатную температуру.
1. Подготовка животных
- Вводите мышам шесть внутрибрюшинных инъе....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Предоставленные данные дают полное представление о всей процедуре с использованием двух основных условий на животных: контрольные молодые мыши C57BL/6 без лечения и их однопометники, подвергавшиеся шести внутрибрюшинным (IP) инъекциям PG каждые 2 дня в течение 2 недель. Они также показывают отдаленное действие внутрибрюшинной инъекции ПГ на реакцию селезенки через 2 недели. Микровезикулы спленоцитов количественно определяли либо с помощью ферментативного анализа протромбиназы, либо путем измерения концентрации их белков .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Настоящее исследование подтверждает, что селезенка является основным и надежным источником МВ с физиологической значимостью по сравнению с другими источниками, такими как кровь, ограниченного объема у мышей. При условии соблюдения мер предосторожности метод прост в настройке и не требует дорогостоящего оборудования. Поскольку альтернативного способа, кроме оценки in vivo , не существует, нынешняя модель представляется ценным методом изучения влияния про-лекарств на выделение MV........
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы выражают признательность Клодин Эбель (Claudine Ebel) из Service commun de cytométrie en flux (Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Strasbourg) за экспертную помощь и проведение комплексного анализа проточной цитометрии селезенки и Али Эль Хабхабу (Ali El Habhab) за начальное обучение по мечению клеток селезенки крыс. Дениз Карагёз помогал в раскопках, сборе литературы. Эта работа была частично поддержана двумя грантами ANR COCERP (N°A17R417B), ENDOPAROMP (N°ANR-17-CE17-0024-01).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 2 мл пробирки типа Eppendorf | Dutscher | 54816 | Коническое дно sté riel микропробирки |
| Allegra 64 R Centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Автоматический счетчик клеток | Biorad | ||
| Bovine serum albumin | Euromedex | 04-100-812-E | Подготовленный, отфильтрованный с 0,22 &; m и хранить при температуре 4°С; С в стерильных условиях с использованием следующих формул: 2 мМ ЭДТА, 0,5% БСА и стерильные PBS |
| CD11 (Mac-1) | e-Biosciences | 45-00112-80 | Конъюгированные с eFluor 450; λ <суб>макс возбуждение 405 нм &лямбда; max излучение 445 нм |
| CD16/32 | BD Biosciences | 553142 | несопряженная |
| EDTA | Calbiochem | Calbiochem | S 6381-92-6 |
| Falcon tube | Клеточная | звезда 227261 | 50 мл |
| фетальной бычьей сыворотки | Dutscher | S1810-500 | Номер партии = S14028S1810 |
| Fortessa Aria | BD Biosciences | для сортировка клеток | |
| проточным цитометром Fortessa | Becton-Dickinson. | ||
| Фунгизон | PAN biotech | P06-01050 | |
| HBSS | Gibco | 14175-053 | Без фенола красного, без Ca+2 и Mg+2 |
| ICAM-1 | abcam | ab171123 | |
| LYG-6 (Gr-1) | BD Biosciences | 566218 | Конъюгирован с BUV395; &лямбда; max возбуждение 348 нм, λ <суб>макс излучение 395 нм |
| Лизисные буферные эритроциты (ACK) | Sigma | Prepared, отфильтрованные с 0,22 &микро; m просеивают и хранят при температуре 4°С; C в стерильных условиях по следующим формулам: NH4Cl, 0,15 M (молярность), 53,491 (mw) 4 г KHCO3 1 mM (молярность) 100,115 (mw), 50 мг EDTA 0,1 мМ (молярность), 292,24 (мВт), 14,6 г<бр/> рН: 7,2&нда; 7.4 | |
| Спектрофотометр NanoDrop 1000 | Thermoscientific | ||
| PBS | Lonza | 17-516F | без Ca+2 и Mg+2 |
| Пластиковая чашка | 100 мм | ||
| Полистирольная трубка | Falcon | 352070 | |
| q-Nano Gold | iZON science | ||
| Питательная среда RPMI 1640: 2 г/л глюкозы | PAN biotech | p04-18047 | С добавлением стрептомицина (100 Ед/мл) / пенициллина (100 Ед/мл), фунгизона (250 мг/мл), L-глутамина (2 мМ) и FBS 10%. |
| Скальпели | |||
| Сито Нейлон | Сокол США | 352360 | 100 & микро; m |
| Стрептомицин/Пенициллин | PAN biotech | P06-07100 | |
| Шприц | 2 мл | ||
| Trypan Blue | Biorad | 1450013 | |
| VCAM1 | abcam ab215380 |
Ссылки
- Loyer, X., et al. Intra-cardiac release of extracellular vesicles shapes inflammation following myocardial infarction. Circulation Research. 123 (1), 100-106 (2018).
- Aupeix, K., Toti, F., Satta, N., Bischoff, P., Freyssinet, J. M.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
