Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Двухцветная стимулированная рамановская рассеянная визуализация мозга мыши в режиме реального времени для диагностики тканей

3.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63484

⸱

1 февраля 2022 г.

 ,  , 
1Department of Chemistry, University of Washington

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Микроскопия с стимулированным комбинационным рассеянием (SRS) является мощным, неразрушающим и безвечным методом визуализации. Одним из новых применений является стимулированная гистология комбинации, где двухцветная визуализация SRS на белковых и липидных рамановских переходах используется для генерации изображений псевдогематоксилина и эозина. Здесь мы демонстрируем протокол для двухцветной визуализации SRS в режиме реального времени для диагностики тканей.

Аннотация

Микроскопия стимулированного рамановского рассеяния (SRS) стала мощным оптическим методом визуализации для диагностики тканей. В последние годы было показано, что двухцветная SRS способна предоставлять гематоксилин и эозин (H & E) эквивалентные изображения, которые позволяют быстро и надежно диагностировать рак мозга. Такая возможность позволила создать захватывающие приложения для интраоперационной диагностики рака. Двухцветная SRS-визуализация ткани может быть выполнена с помощью пикосекундного или фемтосекундного лазерного источника. Преимущество фемтосекундных лазеров заключается в том, что они обеспечивают гибкие режимы визуализации, включая быструю гиперспектральную визуализацию и двухцветную визуализацию SRS в режиме реального времени. Спектрально-фокусирующий подход с чирпированными лазерными импульсами обычно используется с фемтосекундными лазерами для достижения высокого спектрального разрешения.

Двухцветное получение SRS может быть реализовано с ортогональной модуляцией и обнаружением блокировки. Сложность щебетания импульсов, модуляции и характеризации является узким местом для широкого распространения этого метода. В данной статье представлен подробный протокол для демонстрации реализации и оптимизации спектрально-фокусирующих SRS и двухцветной визуализации ткани мозга мыши в режиме реального времени в эпирежиме. Этот протокол может использоваться для широкого спектра приложений визуализации SRS, которые используют высокоскоростные и спектроскопические возможности визуализации SRS.

Введение

Традиционная диагностика тканей опирается на протоколы окрашивания с последующим обследованием под оптическим микроскопом. Одним из распространенных методов окрашивания, используемых патологоанатомами, является окрашивание H &E: гематоксилин окрашивает ядра клеток в пурпурно-синий цвет, а эозин окрашивает внеклеточный матрикс и цитоплазму в розовый цвет. Это простое окрашивание остается золотым стандартом в патологии для многих задач диагностики тканей, особенно для диагностики рака. Тем не менее, гистопатология H&E, особенно метод замороженного сечения, используемый в интраоперационных условиях, по-прежнему имеет ограничения. Процедура окрашивания представляет собой трудоемкий процесс, включающий встраивание, срезание, фиксацию и окрашиваниетканей 1. Типичное время выполнения работ составляет 20 минут или дольше. Выполнение H &E во время замороженного секционирования иногда может стать более сложным, когда обрабатывается несколько секций одновременно из-за необходимости оценки клеточных особенностей или моделей роста в 3D для оценки маржи. Кроме того, интраоперационные гистологические методы требуют квалифицированных техников и клиницистов. Ограничение числа сертифицированных патологоанатомов во многих больницах является ограничением для интраоперационной консультации во многих случаях. Такие ограничения могут быть смягчены с помощью быстрых интересов развития цифровой патологии и диагностики на основе искусственного интеллекта2. Тем не менее, результаты окрашивания H &E варьируются в зависимости от опыта техника, что создает дополнительные проблемы для компьютерной диагностики2.

Эти проблемы потенциально могут быть решены с помощью методов оптической визуализации без этикеток. Одним из таких методов является микроскопия SRS. SRS использует синхронизированные импульсные лазеры — накачку и стокс — для возбуждения молекулярных колебаний с высокой эффективностью3. Недавние отчеты показали, что SRS-визуализация белков и липидов может генерировать H&E-эквивалентные изображения (также известные как стимулированная рамановская гистология или SRH) с неповрежденной свежей тканью, что обходит необходимость любой обработки тканей, значительно сокращает время, необходимое для диагностики, и было адаптировано интраоперационно4. Кроме того, SRS-визуализация может предоставлять 3D-изображения, которые предлагают дополнительную информацию для диагностики, когда 2D-изображений недостаточно5. SRH является непредвзятым и генерирует цифровые изображения, которые легко доступны для компьютерной диагностики. Он быстро появляется в качестве возможного решения для интраоперационной диагностики рака и анализа границ опухоли, особенно при раке головного мозга 6,7,8. Совсем недавно была также предложена визуализация SRS химических изменений ткани для предоставления полезной диагностической информации, которая может дополнительно помочь клиницистам стратифицировать различные типы рака или стадии9.

Несмотря на свой огромный потенциал в приложениях для диагностики тканей, визуализация SRS в основном ограничена академическими лабораториями, специализирующимися на оптике, из-за сложности, связанной с платформой визуализации, которая включает в себя сверхбыстрые лазеры, лазерный сканирующий микроскоп и сложную электронику обнаружения. Этот протокол обеспечивает подробный рабочий процесс для демонстрации использования общего фемтосекундного лазерного источника для двухцветной визуализации SRS в режиме реального времени и генерации псевдо-H &E изображений из ткани мозга мыши. Протокол будет охватывать следующие процедуры:

Выравнивание и оптимизация чирпа
Большинство схем визуализации SRS используют пикосекундные или фемтосекундные лазеры в качестве источника возбуждения. У фемтосекундных лазеров полоса пропускания лазера намного больше, чем ширина рамановской линии. Чтобы преодолеть это ограничение, используется спектральный фокусировочный подход для чирикания фемтосекундных лазеров до пикосекундной временной шкалы для достижения узкого спектрального разрешения10. Оптимальное спектральное разрешение достигается только тогда, когда временное щебетание (также известное как дисперсия групповой задержки или просто дисперсия) правильно подобрано для накачки и лазеров Стокса. Здесь демонстрируется процедура выравнивания и этапы, необходимые для оптимизации дисперсии лазерных лучей с использованием высокодисперсионных стеклянных стержней.

Калибровка частоты
Преимущество спектральной фокусировки SRS заключается в том, что рамановское возбуждение может быть быстро настроено путем изменения временной задержки между накачкой и лазерами Стокса. Такая настройка обеспечивает быструю визуализацию и надежное спектральное получение по сравнению с настройкой длин волн лазера. Однако линейная зависимость между частотой возбуждения и временной задержкой требует внешней калибровки. Органические растворители с известными рамановскими пиками используются для калибровки рамановской частоты для спектральной фокусировки SRS.

Двухцветная визуализация в режиме реального времени
Важно увеличить скорость визуализации в приложениях для диагностики тканей, чтобы сократить время, необходимое для анализа крупных образцов тканей. Одновременная двухцветная SRS-визуализация липидов и белков устраняет необходимость настройки лазера или временной задержки, что увеличивает скорость визуализации более чем в два раза. Это достигается за счет использования новой техники ортогональной модуляции и двухканальной демодуляции с помощью запирающего усилителя11. В данной работе описывается протокол ортогональной модуляции и двухканального получения изображения.

Эпи-режимная визуализация SRS
Большинство изображений SRS, показанных на сегодняшний день, выполняется в режиме передачи. Эпимодальная визуализация обнаруживает обратно рассеянные фотоны из ткани12. Для аппликаций патологии хирургические образцы могут быть довольно большими. Для визуализации в режиме передачи часто необходимо срезание тканей, что нежелательно требует дополнительного времени. Напротив, эпирежимная визуализация может работать с неповрежденными хирургическими образцами. Поскольку одна и та же цель используется для сбора обратно рассеянного света, нет необходимости в выравнивании конденсатора с высокой числовой апертурой, необходимого для передачи изображения. Эпи-режим также является единственным вариантом, когда сечение тканей затруднено, например, с костью. Ранее мы продемонстрировали, что для тканей головного мозга эпирежимная визуализация обеспечивает превосходное качество визуализации для толщины ткани > 2 мм13. Этот протокол использует поляризационный делитель пучка (PBS) для сбора рассеянных фотонов, деполяризованных тканью. Можно собрать больше фотонов с помощью кольцевого детектора за счет сложности настраиваемой детекторной сборки12. Подход PBS проще в реализации (аналогично флуоресценции), при этом стандартный фотодиод уже используется для обнаружения режима передачи.

Генерация псевдо-H&E изображений
После того, как двухцветные изображения SRS собраны, они могут быть перекрашены для имитации окрашивания H &E. В данной работе демонстрируется процедура преобразования изображений липидных и белков SRS в псевдо-H&E SRS изображения для патологических применений. Экспериментальный протокол детализирует критические шаги, необходимые для создания высококачественных изображений SRS. Процедура, показанная здесь, не только применима к диагностике тканей, но также может быть адаптирована для многих других приложений гиперспектральной визуализации SRS, таких как визуализация лекарств и метаболическая визуализация14,15.

Общие системные требования
Лазерная система для этого протокола должна быть способна выводить 2 синхронизированных фемтосекундных лазерных луча. Системы идеально оснащены оптическим параметрическим генератором (OPO) для настройки одной из лазерных лучей с широкой длиной волны. Установка в этом протоколе использует коммерческую лазерную систему Insight DS+, которая выводит два лазера (один фиксированный луч на 1 040 нм и один перестраиваемый луч на основе OPO, в диапазоне от 680 до 1 300 нм) с частотой повторения 80 МГц. Лазерные сканирующие микроскопы, как от крупных производителей микроскопов, так и отечественного производства, могут использоваться для визуализации SRS. Используемый микроскоп представляет собой вертикальный лазерный сканирующий микроскоп, построенный поверх коммерческой вертикальной рамки микроскопа. Пара 5 мм зеркал galvo используется для сканирования лазерного луча. Для пользователей, решивших принять самодельный лазерный сканирующий микроскоп, обратитесь к ранее опубликованному протоколу для построения лазерного сканирующего микроскопа16.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все экспериментальные процедуры на животных проводились с 200 мкм, фиксированным, секционным мозгом мыши, в соответствии с протоколом (No 4395-01), одобренным Комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Вашингтонского университета. Мышей дикого типа (штамм C57BL/6J) усыпляют CO2. Затем выполняется трепанация черепа для извлечения их мозга для фиксации в 4% параформальдегиде в фосфатно-буферном физиологическом растворе. Мозг встроен в смесь 3% агарозы и 0,3% желатина и разделен на срезы толщиной 200 мкм вибратомом.

1. Начальное выравнивание

ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что размер луча и расхождение обоих рычагов совпадают для наилучшей чувствительности и разрешения. Объедините насос и лучи Стокса и отрегулируйте их размеры, прежде чем они попадут в лазерный сканирующий микроскоп. Для этого используйте пару ахроматических линз для каждого луча, прежде чем комбинировать их на дихроичном зеркале. Всегда надевайте правильные лазерные очки для выравнивания луча.

  1. Коллимация пучков
    1. Установите пару ахроматических линз для пучка насоса. В качестве отправной точки используйте объектив 100 мм и объектив 200 мм, чтобы увеличить размер лазерного луча в 2 раза. Убедитесь, что расстояние между двумя объективами составляет примерно 300 мм. Выровняйте пучок насоса по центру обеих линз.
    2. Поместите зеркало после второй линзы, чтобы направить луч к стене (>1 м). Будьте осторожны при отправке луча на большие расстояния. Проследите луч от зеркала до стены с помощью ИК-карты и проверьте, изменяется ли размер луча. Коллимируйте луч, если луч изменяется в размере в зависимости от расстояния.
      1. Если луч сходится (уменьшается размер с распространением), переместите две линзы ближе.
      2. Если луч расходится (увеличивая размер с распространением), переместите две линзы дальше друг от друга. Отрегулируйте расстояние до тех пор, пока луч не будет коллимирован.
    3. Повторите шаги 1.1.1 и 1.1.2, чтобы балка Стокса коллимировала балку.
  2. Регулировка размера балки
    1. Если имеется профилировщик луча, измерьте размер коллимированного луча для каждого луча. В качестве альтернативы можно оценить размер луча с помощью ИК-карты и линейки для получения диаметра луча 4-5 мм.
    2. Если размер луча слишком мал или слишком велик, измените пару линз, используемую на шаге 1.1. Отрегулируйте пару линз до тех пор, пока оба луча не достигнут диаметра 4-5 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение луча представляет собой отношение между фокусным расстоянием второго объектива к первому объективу (f2/f1).
  3. Пространственное перекрытие
    ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация SRS требует, чтобы оба лазерных луча были объединены в пространстве и времени для возбуждения молекулярных колебаний. Схема спектрально-фокусирующей SRS-визуализации показана на рисунке 1.
    1. Объедините два лазерных луча, установив дихроичное зеркало с несколькими зеркалами рулевого управления для регулировки. Оптимизируйте пространственное перекрытие насоса и Stokes, контролируя лучи после дихроичного зеркала в двух разных положениях далеко друг от друга (~1 м). Итеративно отрегулируйте рулевое зеркало перед дихроичным и дихроичным зеркалом, чтобы выровнять луч Стокса с балкой насоса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если два луча пространственно перекрываются в обоих положениях, они достаточно перекрыты.
    2. Убедитесь, что комбинированные лучи направляются в центр сканирующих зеркал лазерного сканирующего микроскопа, регулируя пару зеркал рулевого управления, когда сканирующие зеркала находятся в припаркованном положении. Убедитесь, что оба луча проходят через центр объектива микроскопа и конденсатор.
    3. После конденсатора используйте другую пару линз с фокусными расстояниями 100 мм и 30 мм соответственно для передачи передаваемого луча на фотодиод. Убедитесь, что оба луча содержатся внутри фотодиода, и установите два фильтра нижних частот, чтобы блокировать модулированный луч Стокса.

2. Обнаружение сигнала SRS

  1. Электрооптическая модуляция (EOM)
    ПРИМЕЧАНИЕ: EOM 20 МГц используется для модуляции амплитуды Стокса. Как обсуждалось позже, EOM получен из лазерного импульсного поезда 80 МГц, который необходим для ортогональной модуляции. Другие частоты модуляции могут быть использованы, если выполняется только одноцветная или гиперспектральная SRS. В этом случае синхронизация частоты модуляции с частотой лазера не нужна. Генератор частоты с ВЧ усилителем мощности может использоваться для привода EOM. В результате этапы 2.1.1-2.1.4 могут быть пропущены.
    1. Поместите пробоотборник луча на траекторию луча Стокса, чтобы уловить 10% луча и отправить его на быстрый фотодиод для обнаружения импульсной цепи 80 МГц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сигнал фотодиода отправляется на делитель частоты для создания выхода TTL 20 МГц. Этот выход далее отправляется в буфер вентилятора для репликации выходных данных на четыре идентичных выхода 20 МГц. Один из выходов используется для запуска осциллографа.
    2. Возьмите один из выходов буфера вентилятора и отфильтруйте его полосовым фильтром, чтобы получить синусоидальную волну 20 МГц. Используйте радиочастотный аттенюатор для регулировки выходного напряжения от пика до пика до ~500 мВ.
    3. Отправьте полученный выход на фазовращатель, который позволяет точно регулировать радиочастотную фазу с источником напряжения. Отправьте этот выход на радиочастотный усилитель мощности и подключите выход усилителя к EOM.
    4. Разблокируйте луч Стокса и оптимизируйте глубину модуляции EOM1, разместив фотодиод на пути луча. Отрегулируйте напряжение EOM и четвертьволновую пластину до тех пор, пока глубина модуляции (отношение долины к пику) не станет удовлетворительной.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При модуляции 20 МГц (1/4 частоты повторения лазера) ожидаются два импульса каждые 50 нс.
  2. Временное перекрытие
    ПРИМЕЧАНИЕ: Временное перекрытие насоса и Стокса достигается путем задержки одной из двух лазерных импульсных передач со светоотражателем, установленным на ступени задержки (на рисунке 1 показана задержка Стокса). Грубое перекрытие контролируется осциллографом, а тонкое перекрытие контролируется сигналом SRS. Тонкое временное перекрытие также может быть достигнуто с помощью автокоррелятора, если таковой имеется.
    1. Поместите фотодиод после дихроичного зеркала, чтобы обнаружить лазерный луч. Сначала заблокируйте балку Стокса. Увеличьте масштаб одного из пиков импульса насоса на осциллографе. Поместите вертикальный курсор, чтобы отметить временное положение этого пика с помощью осциллографа.
    2. Заблокируйте балку насоса и разблокируйте балку Стокса. Преобразуйте этап задержки, чтобы временно сопоставить пиковое положение на осциллографе с отмеченным положением на предыдущем шаге. На рисунке 2 показано временное перекрытие двух лучей.
      1. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Если трансляция стадии задержки недостаточна для временного соответствия двух лучей, то переместите стадию задержки в середину диапазона ее движения.
      2. Рассчитайте расстояние задержки, необходимое для соответствия двум лучам, взяв временную разницу между двумя лучами и умножив разницу на скорость света, чтобы найти количество расстояния, необходимое для временного соответствия двух лучей.
      3. Удлините траекторию луча более быстрого луча или сократите траекторию луча более медленного луча, чтобы примерно соответствовать временной задержке соответственно.
    3. Подготовьте образец слайда микроскопа с помощью DMSO и двусторонней ленты в качестве распорки для удержания образца между слайдом и крышкой.
    4. Поместите образец на микроскоп стороной крышки, обращенной к объективу микроскопа. Измените микроскоп на яркое освещение и наблюдайте за образцом из окуляра. Найдите фокус образца, сначала найдя фокус как в верхнем, так и в нижнем слое пузырьков воздуха на интерфейсе стеклянной ленты, а затем переместите фокус, чтобы он находился между двумя слоями ленты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что лазерные лучи заблокированы, прежде чем смотреть в окуляр.
    5. Установите настраиваемую выходную мощность луча на 798 нм. Исходя из оптической пропускной способности конденсатора, отрегулируйте оптическую мощность до ~40 мВт каждая для насоса и лучей Стокса в фокусе цели.
    6. Откройте ScanImage в MATLAB (или другом сканирующем программном обеспечении, которое управляет микроскопом) и нажмите кнопку с надписью FOCUS , чтобы начать сканирование.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лазерные лучи будут растровым сканированием через образец для создания изображения. Выход низкочастотного сигнала с фотодиода (<100 кГц) передается непосредственно в канал 1 карты сбора данных (называемый каналом постоянного тока). Высокочастотный выход (>100 кГц) от фотодиода отправляется в блокирующий усилитель, а X-выход сигнала блокирующего усилителя отправляется в канал 2 карты сбора данных (называемый каналом переменного тока).
    7. Отрегулируйте рулевое зеркало перед сканером galvo, чтобы центрировать сигнал постоянного тока на дисплее канала 1. Переместите моторизованный каскад задержки и внимательно наблюдайте за выходом блокировки, отображаемым на дисплее канала 2 (т.е. канала переменного тока).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Когда насос и Стокс совпадают по времени, сигнал будет отображаться на канале переменного тока. Полезно настроить цветовую шкалу канала переменного тока, чтобы отобразить небольшое изменение интенсивности.
    8. Максимизируйте интенсивность сигнала переменного тока, точно отрегулировав временную задержку. Отрегулируйте дихроичное зеркало, чтобы центрировать сигнал SRS на канале переменного тока (сохраняя при этом канал постоянного тока в центре). Отрегулируйте фазу запирающего усилителя, чтобы максимизировать сигнал. Удовлетворительный сигнал см. на рисунке 3 .

3. Оптимизация спектрального разрешения

ПРИМЕЧАНИЕ: Пучки насоса и Стокса, достигающие образца, должны иметь одинаковое количество групповой дисперсии задержки (GDD) для максимизации спектрального разрешения. Дисперсия сильно зависит от экспериментальной установки. Экспериментальная установка, описанная здесь, использует фемтосекундные импульсы при 1040 нм и 800 нм в качестве Стокса и насоса соответственно. В качестве импульсно-растягивающей среды используются плотные кремневые стеклянные стержни (H-ZF52A).

  1. Вставьте 48 см высокодисперсионного стеклянного стержня (H-ZF52A или эквивалентное плотное кремневое стекло) в траекторию луча 800 нм. Оцените GDD с помощью Eq (1):
    figure-protocol-1 (1)
    ПРИМЕЧАНИЕ: GVD различных стеклянных материалов на разных длинах волн можно найти из ресурса базы данных показателя преломления. Например, H-ZF52A имеет полную массу 220,40 fs2/мм при 800 нм. Общий GDD составляет 105792 fs2.
  2. Рассчитайте, сколько см дисперсионного стеклянного стержня требуется для добавления к траектории луча 1040 нм, чтобы соответствовать GDD насоса. Вставьте соответствующую длину дисперсионных стеклянных стержней в траекторию луча 1040 нм, чтобы она примерно соответствовала GDD луча 800 нм. Обратите внимание, что добавление стеклянных стержней изменит временное перекрытие двух балок, и может потребоваться регулировка задержки.
  3. Калибровка спектрального разрешения
    1. Сделайте образец слайда микроскопа с ДМСО. Поместите затвор на микроскоп и проверьте мощность лучей, выходящих из конденсатора микроскопа. Отрегулируйте мощность соответствующим образом, чтобы иметь ~ 40 мВт каждый в фокусе образца.
    2. Откройте ScanImage из MATLAB. Найдите максимальный сигнал SRS, просканировав через стадию задержки, которая соответствует рамановскому пику DMSO 2,913 см-1 . Оцените положение ступени на основе положения предыдущей ступени с увеличенной длиной оптического пути за счет вставки стержней. Перестраивайте пространственное перекрытие луча из-за небольшого отклонения балки при добавлении стеклянных стержней.
    3. Сохраните гиперспектральное сканирование SRS, последовательно делая серию изображений SRS при перемещении моторизованной стадии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диапазон задержки сканирования охватывает два рамановских пика, соответствующих 2,913 см-1 и 2,994 см-1 Рамановским пикам DMSO, соответственно. Эти два перехода наблюдаются при использовании 800 нм накачки и 1040 нм лазера Стокса.
    4. Построение спектров SRS решения DMSO с помощью ImageJ или MATLAB. Установите большой пик DMSO 2,913 см-1 к гауссовской или лоренцевой функции в MATLAB, чтобы вычислить полную ширину при половинном максимуме (FWHM) пика.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативные результаты показаны на рисунке 4. Если присутствует только один широкий пик, это означает, что либо спектральное разрешение слишком плохое, чтобы различать два пика, и требуется больше стеклянных стержней, либо диапазон сканирования был слишком мал, чтобы обнаружить второй пик. Как правило, приемлемое спектральное разрешение DMSO составляет ~20-25 см-1 при использовании стеклянных стержней длиной >60 см. Более низкое разрешение часто используется для визуализации тканей для обмена на более высокие сигналы с более короткими импульсами17.
  4. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Используйте автокоррелятор или FROG (Frequency-Resolved Optical Gating) для определения длительности импульса каждого рычага, чтобы точно рассчитать количество GDD и длину стержней, необходимых для соответствия GDD между насосом и Stokes.
  5. Повторите шаги 3.3.2-3.3.4 для стержней различной длины на луче Стокса, чтобы найти оптимальное спектральное разрешение, что означает, что лучшее соответствие GDD было найдено экспериментально. Используйте несколько наборов стеклянных стержней, различающихся по длине, для достижения оптимального спектрального разрешения.

4. Характеристика сигнал-шум (SNR)

  1. Убедитесь, что шаг 4.2 выполнен после полного пространственного и временного выравнивания.
  2. Получите изображение SRS, соответствующее рамановскому пику DMSO размером 2 913 см-1 . Откройте изображение в ImageJ и выделите небольшую область в центре кадра. Используйте функцию меры для вычисления среднего и стандартного отклонения значений в выбранной области.
  3. Разделите среднее значение выбранной области на стандартное отклонение, чтобы найти значение SNR, как в Eq (2).
    figure-protocol-2 (2)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хороший SNR для системы (с константой времени блокировки 4 мкс) с использованием DMSO при 40 МВт / 40 МВт в фокусе для обоих рычагов составляет >800. Более низкие концентрации DMSO или более низкая мощность могут быть использованы для более точной оценки SNR, если карта сбора данных имеет ограниченную битовую глубину.
  4. Если SNR слишком низкий, перестройте лазерные импульсы для оптимизации пространственного перекрытия, временного перекрытия, сопоставления размера луча / коллимации и / или сопоставления дисперсии. Для цели с ошейником коррекции аберрации оптимизируйте сигнал, отрегулировав коррекционный ошейник.

5. Калибровка оси частоты

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг выполняется для связи положения стадии задержки с отсканированным переходом комбинационного рассеяния. Тщательный отбор растворителей необходим для создания соответствующей «рамановской линейки». DMSO является эффективным растворителем для связей CH, поскольку он имеет два острых рамановских пика при 2,913 см-1 и 2,994 см-1.

  1. Сохраните гиперспектральное сканирование с диапазоном стадий задержки, охватывающим пики DMSO 2,913 см-1 и 2,994 см-1 . Сохраните позиции стадии, соответствующие набору гиперспектральных данных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Глобальный максимальный пик спектра соответствует рамановскому сдвигу DMSO 2,913 см-1 , а второй максимальный пик соответствует сдвигу DMSO 2,994 см-1 Raman.
  2. Выполните линейную регрессию для положений сцены и рамановские сдвиги на 2,913 см-1 и 2,994 см-1. Используя уравнение линейной регрессии, связывающее положение стадии с рамановским сдвигом, преобразуйте позиции задержки в соответствующие рамановские частоты.

6. Ортогональная модуляция и двухцветная визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Этап ортогональной модуляции необходим только тогда, когда требуется двухцветная визуализация в режиме реального времени. Схема этой схемы показана на рисунке 5. Ортогональная модуляция использует пару ЭОМ, приводимых в движение на четверти частоты лазера (20 МГц для лазера 80 МГц) со сдвигом фазы 90° между ними. Этот этап ортогональной модуляции можно пропустить для одноцветной визуализации SRS или гиперспектральной визуализации SRS.

  1. Модуляция EOM1
    1. Установите PBS (PBS2), четвертьволновую пластину (QWP2) и вторую EOM (EOM2) в траекторию луча Стокса после первой EOM. Отключите входной сигнал к EOM2. Подключите сигнальный вход к EOM1 и включите его.
    2. Модулируйте луч Стокса (фиксированный на 1040 нм) на частоте 20 МГц (f0/4), посылая луч через первый EOM. Отрегулируйте наклон и положение EOM1, чтобы убедиться, что луч попадает прямо и центрируется через кристалл EOM.
    3. Контролируйте глубину модуляции, наблюдая обе поляризации, выходящие из PBS1 с двумя фотодиодами и отображая модуляцию на осциллографе.
    4. Отрегулируйте напряжение QWP1, EOM1 и фазу входного сигнала 20 МГц (с помощью фазовращателя), чтобы оптимизировать глубину модуляции передаваемого луча, чтобы она была близка к 100%. Смотрите рисунок 2B для иллюстрации хорошей глубины модуляции.
  2. Модуляция EOM2
    1. Отключите EOM1 и подключите EOM2.
    2. Отправьте выход высокого напряжения второго усилителя на частоте 20 МГц в EOM2. Отрегулируйте наклон и положение EOM2, чтобы убедиться, что луч попадает прямо и центрируется через кристалл EOM.
    3. Еще раз контролируйте глубину модуляции, глядя на обе поляризации, выходящие из PBS2 с помощью осциллографа. Отрегулируйте напряжение QWP2, EOM2 и фазовращатель по мере необходимости для достижения почти 100% модуляции для обеих поляризаций.
    4. Убедитесь, что импульсная модуляция имеет сдвиг фазы на 90° от первой модуляции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если две импульсные цепи насоса не являются ортогональными на 90°, перекрестные помехи между двумя каналами будут проблемой.
    5. Проверьте ортогональность модуляции, включив и подключив EOM1 и EOM2. Мониторинг обеих поляризаций, разделенных PBS2 с помощью осциллографа. Реоптимизируйте EOM1 и EOM2 по отдельности, если пульсовая тренировка после второго PBS не похожа на рисунок 2C.
    6. Установите 20 мм двулучепреломляющий кристалл кварца (BRC) и HWP после EOM2. Подключите оба EEM одновременно и контролируйте импульсную передачу так, чтобы она напоминала рисунок 2D.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для чирпа, используемого в этом эксперименте, 20 мм BRC вызывает временную задержку, которая соответствует сдвигу 80 см-1 Раман. Другая длина BRC может потребоваться, если используется другое чирпирование.
  3. Калибровка
    1. Откалибруйте систему с помощью DMSO, обнаружив сигналы от выхода X- и Y-каналов усилителя (отправляемые на каналы 2 и 3 карты сбора данных).
    2. Проверьте, близки ли сигналы, генерируемые пиком 2,913 см-1 от более быстрой поляризации и от более медленной поляризации, к 90° вне фазы на блокируемом усилителе. Если это не так, отрегулируйте выравнивание EOM до тех пор, пока два сигнала не будут близки к 90° вне фазы.
    3. После завершения калибровки найдите положение задержки, которое зондирует переход белка при 2 930 см-1 для одного из ортогональных пучков. Убедитесь, что другая поляризация зондирует липидный переход 2 850 см-1.

7. Эпи-режимная визуализация SRS

ПРИМЕЧАНИЕ: В схеме визуализации режима передачи объектив фокусирует лазер в образце, а затем конденсаторная линза направляет передаваемый луч на фотодиод для обнаружения блокировки. В эпимодальной схеме визуализации свет, который обратно рассеивается и деполяризуется образцом, вспоминается фокусирующим объективом и изолируется с помощью поляризационного делителя пучка. Изолированные и обратно рассеянные фотоны отправляются на фотодиод через пару релейных линз для обнаружения блокировки. На рисунке 6 показана схема эпимодальной визуализации.

  1. Установите HWP до того, как луч войдет в микроскоп, чтобы изменить поляризацию луча, идущего в микроскоп. Поместите PBS над объективом, чтобы деполяризованный обратно отраженный луч достиг детектора.
  2. Используйте пару линз, состоящих из 75-миллиметрового ахроматного объектива и 30-мм асферического объектива, для передачи обратно рассеянных фотонов от задней диафрагмы объектива к фотоприемнику. Установите детектор для сбора обратно рассеянного света, направленного PBS. Установите фильтр, чтобы заблокировать попадание модулированного луча в детектор.
  3. Поместите образец ткани под объектив. Поскольку конденсатор не нужен для эпирежимной визуализации, удалите его, если требуется больше места.
  4. Отображение
    1. Перекрыть балку затвором; светить белым источником света на образец сбоку; и используйте brightfield для поиска объективной направленности.
    2. Разблокируйте оба пучка и используйте предварительно откалиброванные положения задержки для получения изображений липидов и белков SRS из ткани с двух выходов блокирующего усилителя.
    3. Отрегулируйте коэффициент усиления блокировки и коэффициент блокировки пикселей для получения изображений хорошего качества.

8. Окрашивание ложным цветом

  1. Откройте стек изображений с помощью ImageJ.
  2. Вытащите два изображения, которые соответствуют липидным (2 850 см-1) и белковым (2 930 см-1) видам, щелкнув правой кнопкой мыши на изображении и щелкнув Дубликат.
  3. Переименуйте липидное изображение в липиды , а изображение белка в белки.
  4. Перейти к процессуальной | Калькулятор изображений и выполнение белков вычитания липидов.
  5. Объедините изображения, перейдя в image | Цвет | Объединяйте каналы, устанавливая липиды в зеленый и белки в синий. Откройте инструмент «Каналы изображений» (Image | Цвет | Инструмент «Каналы») и отрегулируйте яркость и контрастность (Image | Отрегулируйте | Яркость/Контрастность).
  6. Отрегулируйте яркость и контрастность для каждого канала с помощью инструмента «Каналы ». Для липидного канала отрегулируйте контраст до тех пор, пока клеточные объекты не станут темными. Для белкового канала отрегулируйте контраст до тех пор, пока клеточные особенности не станут синими. Преобразуйте объединенное зелено-синее изображение канала в RGB-изображение, перейдя в раздел Image | Тип | Цвет RGB. Экспортируйте это изображение с помощью | файлов Сохранить как | Тифф.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для ложного окрашивания H &E цветовая схема показывает розовую цитоплазму, в то время как ядра темно-сине-фиолетовые.
  7. Загрузите скрипт HE.m MATLAB из ресурса ложного сценария окрашивания H&E в таблице материалов.
  8. Запустите сценарий HE.m в MATLAB. Выберите экспортированное RGB-изображение из предыдущего шага, чтобы создать искусственно окрашенное изображение H&E.
  9. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Нормализуйте интенсивность изображения для изображений с большим полем зрения, поскольку изображение выглядит темнее на периферии, чем в центре.
    1. Чтобы выполнить полевую нормализацию изображений, усредните как можно больше изображений. Затем удалите элементы интенсивности с помощью ImageJ (Process | фильтры | Гауссовское размытие | Радиус=50).
    2. Измерьте максимальную интенсивность размытого изображения (Ctrl+M). Разделите размытое изображение на максимальную интенсивность (Process | Математические | Разделить). Разделите необработанное изображение SRS на размытое изображение (Process | Изображение | Калькулятор).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Оптимизация спектрального разрешения:
Дисперсия через материал зависит от дисперсионной среды (длины и материала) и длины волны. Изменение длины дисперсионного стержня влияет на спектральное разрешение и размер сигнала. Это отношения взаимных уступок, которые могут быть взвешены по-разному в зависимости от применения. Стержни растягивают импульс луча от широкого по частоте и узкого во времени до узкого по частоте и широкого по времени. На рисунке 7 показано влияние различ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Двухцветная схема визуализации SRS, представленная в этом протоколе, зависит от правильной реализации одноцветной визуализации SRS. В одноцветной визуализации SRS критическими шагами являются пространственное выравнивание, временное выравнивание, глубина модуляции и сдвиг фазы. Пространственное объединение двух лучей осуществляется дихроичным зеркалом. Несколько рулевых зеркал используются для тонкой регулировки при отправке лучей на дихроичное зеркало. После того, как лучи объединены с дихроичным зеркалом, пространствен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что конфликта интересов нет.

Благодарности

Это исследование было поддержано NIH R35 GM133435 до D.F.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ахроматический объектив 100 ммTHORLABSAC254-100-Bширокополосный, 650 - 1,050 нм, фокусное расстояние ахроматического объектива, 100 мм
20 МГц полосовой фильтрМинисхемыBBP-21.4 +сосредоточенный LC полосовой фильтр, 19,2 - 23,6 МГц, 50 Ω
Ахроматический объектив 200 ммTHORLABSAC254-200-Bширокополосный, 650 - 1,050 нм, фокусное расстояние ахроматического объектива, 200 мм
Ахроматический полуволновой объективUnionOptic WPA2210-650-1100-M25.4Широкополосный полуволновой объектив
Achromatic Четвертьволновой светильникUnion OpticWPA4210-650-1100-M25.4Широкополосный четырехволновой
дискретизатор лучаTHORLABSBSN1110:90 Пластинчатый делитель луча
Дихроичное зеркалоTHORLABSDMSP1000Можно использовать другие дихроики с центральной длиной волны около 1000 нм.
ДМСО (диметилсульфоксид)Sigma Aldrich472301Растворитель для калибровки комбинационного сдвига. Можно использовать другие растворители с известными пиками комбинационного рассеяния.
Электрооптический амплитудный модуляторTHORLABSEO-AM-NR-C1Для ортогональной модуляции и двухканальной визуализации необходимы два EOM. Рекомендуется резонансная версия, чтобы можно было использовать более низкое напряжение управления.
Ложные H&; E Staining ScriptMatlabhttps://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout BufferPRL-414BPulse Research Lab1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, для генерации частоты управления EOM и привязки к
быстрому фотодиодуTHORLABSDET10A2частоты времени нарастания 1 нс
PRL-220APulse Research LabДелитель частоты TTL (f/2, f/4, f/8, f/16), для генерации частоты 20 МГц от лазерного выхода.
Высокодисперсионные стеклянные стержниUnion OpticCYLROD01высокодисперсионные H-ZF52A Стержневая линза 120 мм, SF11 Стержневая линза 100 мм
Insight DS+NewportЛазерная система, способная выводить два синхронизированных импульсных лазера (один фиксированный луч на длине волны 1,040 нм и один перестраиваемый луч на длине волны 680-1,300 нм) с частотой повторения 80 МГц. 
Усилитель Lock-in LiquidInstrumentsMoku LabLock-in усилитель для извлечения сигнала SRS с фотодиода. Также можно использовать Zurich Instrument HF2LI или аналогичный инструмент.
ЗеркалаTHORLABSBB05-E03-10Широкополосное диэлектрическое зеркало, 750 - 1 100 нм. Также можно использовать серебряные зеркала.
Моторизованный каскад задержкиZaberX-DMQ12P-DE52Каскад задержки для точного контроля временного перекрытия накачки и лазеров Стокса. Подойдет любая другая моторизованная сцена.
Масляный погружной конденсаторNikonCSC10031.4 NA. Можно использовать и другие конденсаторы с NA>1.2.
ОсциллографTektronixTDS7054Подойдет любой другой осциллограф с полосой пропускания 400 МГц или выше.
ФазовращательSigaTekSF50A2Для сдвига фазы частоты модуляции
фотодиодHamamatsu CorpS3994-01Кремниевый PIN-диод большой площади (10 x 10 см2). Можно использовать и другие диоды с большой площадью и малой емкостью.
Поляризационный светоделительUnion OpticPBS9025-620-1000Широкополосный поляризационный светоделитель
Refactive Index база данныхrefractiveindex.info
Ретрорефлектор EdmundOptics34-408BBAR Прямоугольная призма. Можно использовать другие призмы или ретрорефлектор.
Минисхемы усилителя мощности ВЧЗХЛ-1-2Вт +блок усиления, 5 - 500 МГц, 50 & Омега;
Сканирующие зеркалаCambridge Technologies6215HМы использовали набор зеркал 5 мм с серебряным покрытием
ScanImageVidrioScanImage BasicПрограммное обеспечение для управления лазерным сканирующим микроскопом
Shortpass FilterTHORLABSFESH100025,0 мм Premium Shortpass Filter, отсечка Длина волны: 1 000 нм. Для эффективного подавления синдрома Стокса могут потребоваться два фильтра.
Вертикальный микроскопNikonEclipse FN1Можно использовать любую другую рамку микроскопа. При наличии лазерного сканирующего микроскопа его можно использовать напрямую. В противном случае к микроскопу нужно было добавить гальвосканер и сканирующую линзу.
Объектив для погружения в водуOlympusXLPLN25XWMP2Многофотонный объектив 25X имеет NA 1,05. Можно использовать и другие подобные цели.
Si Detector, делитель

Ссылки

  1. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
  2. Cui, M., Zhang, D. Y. Artificial intelligence and computational pathology. Laboratory Investigation. 101 (4), 412-422 (2021).
  3. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  4. Orringer, D. A., et al. Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy. Nature Biomedical Engineering. 1, 0027(2017).
  5. Ji, M., et al. label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  6. Hollon, T. C., et al. Near real-time intraoperative brain tumor diagnosis using stimulated Raman histology and deep neural networks. Nature Medicine. 26 (1), 52-58 (2020).
  7. Shin, K. S., et al. Intraoperative assessment of skull base tumors using stimulated Raman scattering microscopy. Scientific Reports. 9 (1), 20392(2019).
  8. Lu, F. -K., et al. Label-free neurosurgical pathology with stimulated Raman imaging. Cancer Research. 76 (12), 3451-3462 (2016).
  9. Shin, K. S., et al. Quantitative chemical imaging of breast calcifications in association with neoplastic processes. Theranostics. 10 (13), 5865-5878 (2020).
  10. Fu, D., Holtom, G., Freudiger, C., Zhang, X., Xie, X. S. Hyperspectral imaging with stimulated Raman scattering by chirped femtosecond lasers. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (16), 4634-4640 (2013).
  11. Figueroa, B., Hu, R., Rayner, S. G., Zheng, Y., Fu, D. Real-time microscale temperature imaging by stimulated Raman scattering. The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (17), 7083-7089 (2020).
  12. Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  13. Hill, A. H., Hill, A. H., Manifold, B., Manifold, B., Fu, D. Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).
  14. Fu, D., et al. Imaging the intracellular distribution of tyrosine kinase inhibitors in living cells with quantitative hyperspectral stimulated Raman scattering. Nature Chemistry. 6 (7), 614-622 (2014).
  15. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
  16. Tsai, P. S., et al. Principles, design, and construction of a two-photon laser-scanning microscope for in vitro and in vivo brain imaging. In Vivo Optical Imaging of Brain. Frostig, R. D., et al. , CRC Press. 113-171 (2002).
  17. Francis, A., Berry, K., Chen, Y., Figueroa, B., Fu, D. Label-free pathology by spectrally sliced femtosecond stimulated Raman scattering (SRS) microscopy. PLoS One. 12 (5), 0178750(2017).
  18. Figueroa, B., et al. Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source. Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).
  19. Kong, L., et al. Multicolor stimulated Raman scattering microscopy with a rapidly tunable optical parametric oscillator. Optics Letters. 38, 145-147 (2013).
  20. He, R., et al. Dual-phase stimulated Raman scattering microscopy for real-time two-color imaging. Optica. 4 (1), 44-47 (2017).
  21. Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. Multi-window sparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).
  22. Wei, M., et al. Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (14), 6608-6617 (2019).
  23. Wright, A. J., et al. Adaptive optics for enhanced signal in CARS microscopy. Optics Express. 15 (26), 18209-18219 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

SRSSRS
Двухцветная стимулированная рамановская рассеянная визуализация мозга мыши в режиме реального времени для диагностики тканей
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.