Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Расшифровка молекулярного механизма сборки гистонов методом ДНК-занавеса

2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63501

⸱

9 марта 2022 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Ulsan National Institute of Science and Technology, 2Center for Genomic Integrity, Institute for Basic Science (IBS)

В этой статье

Краткое содержание

ДНК-занавес, высокопроизводительный метод визуализации одной молекулы, обеспечивает платформу для визуализации различных взаимодействий белка и ДНК в режиме реального времени. В настоящем протоколе используется метод ДНК-занавеса для исследования биологической роли и молекулярного механизма Abo1, бромдомен-содержащей ААА+ АТФазы Schizosaccharomyces pombe .

Аннотация

Хроматин представляет собой структуру высшего порядка, которая упаковывает эукариотическую ДНК. Хроматин претерпевает динамические изменения в зависимости от фазы клеточного цикла и в ответ на стимулы окружающей среды. Эти изменения необходимы для целостности генома, эпигенетической регуляции и метаболических реакций ДНК, таких как репликация, транскрипция и репарация. Сборка хроматина имеет решающее значение для динамики хроматина и катализируется шаперонами гистонов. Несмотря на обширные исследования, механизмы, с помощью которых шапероны гистонов обеспечивают сборку хроматина, остаются неуловимыми. Более того, глобальные особенности нуклеосом, организованных шаперонами гистонов, плохо изучены. Для решения этих проблем в данной работе описывается уникальный метод визуализации одной молекулы, называемый ДНК-занавесом, который облегчает исследование молекулярных деталей сборки нуклеосом с помощью гистонов-шаперонов. ДНК-занавес — это гибридный метод, который сочетает в себе липидную текучесть, микрофлюидику и флуоресцентную микроскопию с полным внутренним отражением (TIRFM), чтобы обеспечить универсальную платформу для визуализации различных взаимодействий белка и ДНК в режиме реального времени. С помощью ДНК-занавеса исследована функция гистонов-шаперонов Abo1, бромдомен-содержащая ААА+-АТФазу Schizosaccharomyces pombe , а также выявлен молекулярный механизм, лежащий в основе сборки гистонов Abo1. ДНК-занавес обеспечивает уникальный подход к изучению динамики хроматина.

Введение

Эукариотическая ДНК упакована в структуру более высокого порядка, известную как хроматин 1,2. Нуклеосома является фундаментальной единицей хроматина, которая состоит примерно из 147.н. ДНК, обернутой вокруг гистонов октамерного ядра 3,4. Хроматин играет важнейшую роль в эукариотических клетках; например, компактная структура защищает ДНК от эндогенных факторов и экзогенных угроз5. Структура хроматина динамически изменяется в зависимости от фазы клеточного цикла и стимулов окружающей среды, и эти изменения контролируют доступ к белкам во время транзакций ДНК, таких как репликация, транскрипцияи репарация. Динамика хроматина также важна для стабильности генома и эпигенетической информации.

Хроматин динамически регулируется различными факторами, включая модификации гистонового хвоста и организаторы хроматина, такие как ремоделировщики хроматина, белки поликомбной группы и шапероны гистонов7. Шапероны гистонов координируют сборку и разборку нуклеосом путем осаждения или отрыва основных гистонов 8,9. Дефекты в шаперонах гистонов индуцируют нестабильность генома и вызывают нарушения развития и рак 9,10. Различные шапероны гистонов не нуждаются в химическом потреблении энергии, таком как гидролиз АТФ, для сборки или разборки нуклеосом 9,11,12,13. Недавно исследователи сообщили, что бромдоменсодержащие ААА+ (АТФаза, связанная с разнообразной клеточной активностью) АТФазы играют роль в динамике хроматина в качестве гистонов-шаперонов 14,15,16,17. Человеческий ATAD2 (АТФазный ААА-содержащий белок 2) способствует доступности хроматина для усиления экспрессии генов18. В качестве транскрипционного корегулятора ATAD2 регулирует хроматин онкогенных транскрипционных факторов14, а гиперэкспрессия ATAD2 связана с плохим прогнозом при многих типах рака19. Yta7, гомолог ATAD2 Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae), снижает плотность нуклеосом в хроматине15. Напротив, Abo1, гомолог ATAD2 Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), увеличивает плотность нуклеосом16. Используя уникальный метод визуализации одной молекулы, ДНК-занавеса, решается, способствует ли Abo1 сборке или разборке нуклеосом17,20.

Традиционно биохимические свойства биомолекул изучались с помощью массовых экспериментов, таких как электрофоретический анализ сдвига подвижности (EMSA) или коиммунопреципитация (co-IP), в которых исследуется большое количество молекул и характеризуются их средние свойства21,22. В массовых экспериментах молекулярные субсостояния завуалированы эффектом среднего ансамбля, а зондирование биомолекулярных взаимодействий ограничено. В отличие от этого, одномолекулярные методы обходят ограничения массовых экспериментов и позволяют детально охарактеризовать биомолекулярные взаимодействия. В частности, методы одномолекулярной визуализации широко используются для изучения ДНК-белковых и белок-белковых взаимодействий23. Одним из таких методов является ДНК-занавес, уникальный метод визуализации отдельных молекул, основанный на микрофлюидике и флуоресцентной микроскопии с полным внутренним отражением (TIRFM)24,25. В занавесе ДНК сотни отдельных молекул ДНК прикреплены к липидному бислою, что обеспечивает двумерное движение молекул ДНК за счет липидной текучести. При применении гидродинамического потока молекулы ДНК движутся вдоль потока на бислое и застревают в диффузионном барьере, где они выравниваются и растягиваются. В то время как ДНК окрашивается интеркалирующими агентами, вводятся флуоресцентно меченные белки, а TIRFM используется для визуализации взаимодействий белок-ДНК в режиме реального времени на уровне одной молекулы23. Платформа ДНК-занавеса облегчает наблюдение за перемещениями белков, такими как диффузия, транслокация и столкновение 26,27,28. Кроме того, ДНК-занавес может быть использован для картирования белков на ДНК с определенными позициями, ориентациями и топологиями или применен для изучения фазового разделения белков и нуклеиновых кислот 29,30,31.

В этой работе метод ДНК-занавеса используется для предоставления доказательств функции шаперонов путем прямой визуализации специфических белков. Более того, поскольку ДНК-занавес является платформой с высокой пропускной способностью, он облегчает сбор данных, достаточный для статистической надежности. В данной статье подробно описано, как проводить анализ ДНК-занавеса для изучения молекулярной роли бромдомен-содержащей S. pombe ААА+ АТФазы Abo1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка проточной ячейки

  1. Подготовьте очищенное предметное стекло из плавленого кремнезема, содержащее нанотраншейные узоры в соответствии с ранее опубликованным отчетом25.
    1. Просверлите два отверстия диаметром 1 мм в очищенном затворе из плавленого кремнезема (Рисунок 1A) с помощью сверла с алмазным покрытием (см. Таблицу материалов).
    2. Нанесите 250 нм толстого алюминия (Al) на предметное стекло с помощью распыления постоянного тока32 (см. таблицу материалов) с 10 мТорр газообразного аргона.
    3. При 4 000 об/мин наносите слой 4% полиметилметакрилата (ПММА) 950K (см. Таблицу материалов) толщиной 310 нм и выпекайте на горячей плите при температуре 180 °C в течение 3 минут.
    4. Нарисуйте нанотраншеи на слое ПММА между двумя отверстиями с помощью электронно-лучевой литографии33 с током 0,724 нА при напряжении 80 кВ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Архитектура и размеры нанотраншей показаны на рисунке 1А.
    5. Извлеките ПММА, подвергшуюся воздействию луча, замочив предметные стекла в проявочном растворе (соотношение метилизобутилкетона и изопропанола 1:3, см. таблицу материалов) на 2 мин.
    6. Травление алюминиевых слоев методом индуктивно-связанного плазменно-реактивного ионного травления (ICP-RIE) с использованием хлора (Cl2) и трихлорида бора (BCl3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти два газа могут удалять алюминий из областей, подверженных воздействию луча.
    7. Вырежьте нанотраншеи на предметных стеклах, используя тетрафторид серы (SF4), тетрафторметан (CF4) и кислород (O2) (см. таблицу материалов).
    8. Удалите оставшийся алюминиевый слой, замочив слайды в протравителе Al (проявитель AZ 300 MIF, см. Таблицу материалов) на 10 минут.
    9. После изготовления промыть предметные стекла деионизированной водой и провести ультразвуковую обработку в ацетоне в течение 30 мин с помощью ультразвукатора ванного типа.
    10. Очищают предметные стекла в 2% растворе Hellmanex III (см. Таблицу материалов) не менее 1 суток при магнитном перемешивании.
    11. Последовательно обрабатывайте предметные стекла ацетоном в течение 30 мин и 1 М NaOH в течение 30 мин.
    12. Промойте предметные стекла деионизированной водой и высушите газообразным азотом (N2).
  2. Положите чистую бумагу (5 мм x 35 мм) на центр двустороннего скотча. Прикрепите ленту к предметному стеклу, чтобы закрыть два отверстия и наноузоры бумагой.
  3. Удалите бумагу чистым лезвием (Рисунок 1A).
  4. Наложите стеклянный покровный листок поверх двустороннего скотча и потрите его наконечником пипетки, чтобы образовалась микрофлюидная камера (Рисунок 1A).
  5. Поместите собранную проточную ячейку между двумя предметными стеклами микроскопа и закрепите их.
  6. Выпекать в вакуумной печи при температуре 120 °C в течение 45 минут.
  7. Прикрепите жидкостный соединитель (нанопорт) для анализа на основе чипа (см. Таблицу материалов) к каждому открытому отверстию с помощью пистолета для горячего клея и соедините две линии трубок Luer Lock.
  8. Подсоедините шприц с замком Люэра, содержащий 3 мл деионизированной воды, и промойте камеру.
  9. Промойте камеру 3 мл липидного буфера (20 мМ Tris-HCl, pH 8,0 и 100 мМ NaCl) по каплевидному соединению.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соединение «капля за каплей» связывает все шприцы с проточной ячейкой, чтобы избежать впрыска пузырьков воздуха в камеру.
  10. Ввести 1 мл 0,04-кратного биотинилированного липида в липидном буфере в камеру в два приема с 5-минутной инкубацией на выстрел.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовление 1х биотинилированного липидного запаса описано в ранее опубликованном отчете34.
  11. Промойте камеру 3 мл липидного буфера и инкубируйте в течение 20 минут, чтобы липидный бислой созрел на поверхности предметного стекла.
  12. Добавьте 1 мл буфера BSA (40 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 50 мМ NaCl, 2 мМMgCl2 и 0,2 мг/мл BSA) и инкубируйте в течение 5 мин для пассивации поверхности предметного стекла.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап может уменьшить неспецифическое связывание белков с поверхностью предметного стекла.
  13. Вводят 0,025 мг/мл стрептавидина в 1 мл буфера БСА двумя инъекциями и 10-минутной инкубацией на укол.
  14. Вымойте остатки стрептавидина 3 мл буфера БСА.
  15. Введите ~300 пМ (30 мкл) биотинилированной лямбда-фаговой ДНК в 1 мл буфера BSA в камеру с двумя выстрелами и 10-минутной инкубацией на выстрел.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Получение биотинилированной лямбда-ДНК описано в ранее опубликованном отчете34.

2. Подключение проточной ячейки к микрофлюидной системе и загрузка ее в микроскоп

  1. Приготовьте буфер для визуализации Abo1 (50 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 100 мМ NaCl, 1 мМ DTT, 1 мМ АТФ, 2 мМ MgCl2, 1,6% глюкозы и 0,1x гликси, см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Gloxy - это система очистки кислорода, которая уменьшает фотообесцвечивание флуоресцентных красителей. Приготовление 100-кратного гликси-буфета с глюкозооксидазой и каталазой описано в ссылке35.
  2. Подсоедините шприц, содержащий 10 мл буфера для визуализации, к шприцевому насосу и удалите пузырьки во всех трубках микрофлюидной системы.
  3. Соедините подготовленную проточную ячейку с микрожидкостной системой с помощью соединения «капля-капля», чтобы избежать впрыска пузырьков в проточную ячейку (Рисунок 1B).
  4. Соберите проточную ячейку и держатели проточной ячейки и установите узел на изготовленный по индивидуальному заказу микроскоп TIRF (рис. 1C).
    ВНИМАНИЕ: Когда проточная ячейка помещается под микроскоп, осторожно установите высоту линзы объектива. Проточная ячейка не должна касаться линзы объектива. Это может привести к повреждению объектива.
  5. Капля индекса, соответствующего маслу, в центре проточной ячейки и наденьте на каплю масла изготовленную на заказ призму Голубя (см. Таблицу материалов).

3. Сборка гистонов Abo1 с использованием ДНК-занавеса

  1. Смешайте 5 нМ Abo1 и 12,5 нМ меченого Cy5 димера гистонов H3-H4 (Cy5-H3-H4) (см. таблицу материалов) в 150 мкл буфера визуализации. Все белки были получены в соответствии с ранее опубликованным отчетом17.
  2. Выдержите смесь на льду в течение 15 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать фотообесцвечивания Cy5, инкубацию необходимо проводить в темноте.
  3. Введите ~20 пМ (2 мкл) красителя YOYO-1 в буфер для визуализации через петлю образца объемом 100 мкл для окрашивания молекул лямбда-ДНК.
  4. Запустите программное обеспечение для визуализации (см. таблицу материалов) и включите лазер с длиной волны 488 нм, чтобы проверить, правильно ли сформированы занавески ДНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если завесы ДНК сформированы правильно, молекулы ДНК, окрашенные YOYO-1, отображаются в виде выровненных линий на барьере в присутствии потока. Растянутые линии отскакивают и диффундируют от барьера при отключении потока.
  5. Введите 2 мл буфера с высоким содержанием соли (200 мМ NaCl и 40 мМ MgCl2), чтобы удалить краситель YOYO-1 из ДНК.
  6. После удаления красителя YOYO-1 введите предварительно инкубированный образец белка.
  7. Когда белки достигнут занавеса ДНК, выключите шприцевой насос, закройте запорный клапан и инкубируйте 15 мин для загрузки гистонов Abo1.
  8. Вымывают несвязанные белки Abo1 и гистоны в течение 5 мин.
  9. Включите запорный клапан и возобновите впрыск потока.
  10. Включите лазер с длиной волны 637 нм и визуализируйте флуоресцентные белки при включенном буферном потоке.
  11. Временно отключите буферный поток, чтобы проверить, загружены ли белки гистонов в ДНК (рис. 2C).
  12. Соберите изображения ДНК-занавеса с помощью программы получения изображений (см. Таблицу материалов).
    Примечание: Когда буферный поток временно прекращается, ДНК выходит из исчезающего поля полного внутреннего отражения, и флуоресцентно меченные белки, связанные с ДНК, исчезают.

4. Анализ данных

  1. Преобразуйте изображения, сделанные программой получения изображений, в формат TIFF в виде последовательностей изображений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все данные были проанализированы с использованием изображения J (NIH), как описано в ссылке20.
  2. Выберите одну молекулу ДНК из последовательностей изображений и нарисуйте кимограф.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кимограф может показать изменение интенсивности флуоресценции каждого белка гистонов, связанного с одной молекулой ДНК, в зависимости от времени.
  3. Создайте профиль интенсивности флуоресценции с помощью кимографа и подгоните его под несколько гауссовых функций.
  4. Соберите центральные координаты пиков из профиля интенсивности флуоресценции. На этом этапе можно получить минимальную интенсивность флуоресценции гистонов.
  5. Разделите все пиковые интенсивности, собранные из профилей, на минимальную интенсивность. На этом этапе оценивается количество димеров H3-H4, связанных с ДНК.
  6. Выполните шаги 4.2-4.5 для других молекул ДНК.
  7. Постройте гистограмму для распределения связывания димеров H3-H4 с размером ячейки 1 kbp. Количество анализируемых молекул не менее 300.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В данной работе описана процедура подготовки проточных клеток к анализу ДНК-занавески (рис. 1А). Анализ ДНК-шторы способствовал изучению сборки димера гистонов H3-H4 на ДНК с помощью Abo1. Во-первых, формирование ДНК-занавеса было проверено путем окрашивания молекул ДНК интеркалирующим красителем YOYO-1. Зеленые линии были показаны в параллельных массивах, что указывает на то, что YOYO-1 интеркалируется в молекулы ДНК, которые были хорошо выровнены и растянуты на диффузионном барьере под дей...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В качестве метода визуализации одной молекулы ДНК-занавес широко используется для исследования метаболических реакций ДНК43. Занавес ДНК представляет собой гибридную систему, объединяющую липидную текучесть, микрофлюидику и TIRFM. В отличие от других одномолекулярных методов, ДНК-занавес обеспечивает высокопроизводительную визуализацию взаимодействий белка и ДНК в режиме реального времени. Таким образом, метод ДНК-занавеса подходит для исследования механизма, лежащего в основе молекулярных взаимод...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы высоко оценивают любезную поддержку Abo1 и Cy5-H3-H4 со стороны профессора Джи-Джун Сонга, доктора философии Кэрол Чо и доктора философии Джувона Чана из KAIST, Южная Корея. Работа выполнена при поддержке гранта Национального исследовательского фонда (NRF-2020R1A2B5B01001792), фонда очных исследований (1.210115.01) Ульсанского национального института науки и технологий и Института фундаментальных наук (IBS-R022-D1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 мл шприц с люэровским замкомBecktonDickinson301321
1' x 3' стекло с плавленым кремом G. Finkenbeiner1 дюйм x 3 дюйма прямоугольный и толщиной 1 мм
10 мл шприц с люэровским замкомBecktonDickinson302149
18:1 (Δ 9-Cis) PC (DOPC)Avanti850375Это компонент биотинилированного липидного материала
18:1 Биотиниловый колпачок PEAvanti870273Это компонент биотинилированного липидного материала
18:1 PEG2000 PEAvanti880130Это компонент биотинилированного липидного материала
3 мл люэр-локальный шприцBecktonDickinson302832
6-ходовой клапан для впрыска пробIDEXMX series II
950K PMMAAll-resist671.04
АцетонSAMCHUNA1759
Аденозин 5'-трифосфат динатриевая соль гидрат (АТФ)SigmaA2383
Алюминий (Al)TASCO, Южная КореяLT50AI414Диаметр 4 дюйма, толщина 1/4 дюйма
Центробежный фильтр Amicon Ultra, MWCO 10 кДаМиллипорZ648027
ампициллинаMbcellMB-A4128Антибиотики
AZ 300 MIF проявительMerck10454110521Используется для удаления алюминия
Лезвие DORCODN5212 мм x 6 м
Трихлорид бора (BCl3)UNIONГАЗЧистота: >99,99%
Бычий сывороточный альбумин (BSA)SigmaA7030
CatalaseSigmaC40-1gЭто компонент 100x глоксистического стока
Хлор (Cl2)UNIONГАЗЧистота: >99,99%
Прозрачный двухсторонний скотч3M313770
D-(+)-глюкозаSigmaG7528
DC распылительSoronaSRM-120Используется для нанесения алюминия на предметное стекло
Алмазное сверлоEurotoolDIB-211.00Используется для проделывания отверстий в стекле
DL-Dithiothreitol (DTT)SigmaD0632
Dove-prismKorea Electro-Optics Co. Ltd.1906-106Изготовленная на заказ призма голубя из плавленого кремнезема с антибликовым покрытием
DrillDremelDremel 3000Используется для проделывания отверстий в стекле из плавленого кремнезема
Electron Bean LithographyNanobeam Ltd.NB3
Этилен-диамин-тетрауксусная кислота (ЭДТА)SigmaEDS-1KG
Фитинги для снятия пальцевIDEXF-300Соединяются с "PFA Tubing Natural" для формирования трубки с люэровским замком
Бесфланцевая наружная гайкаIDEXP-235Соединяются с "PFA Tubing Natural" для формирования трубки с люэровым замком
Сублимационная сушилка, HyperCOOLLabogeneHC3110Используется для лиофилизации жидких белков
ГлюкозооксидазаSigmaG2133-50KUЭто компонент 100x глокси стока
гидрохлорида гуанидинияAcros Organics364790025
шприца HamiltonCompany80065Этот шприц используется для введения образца
Hellmanex IIISigmaZ805939
HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 стр.Cytiva28-9893-36Используется для FPLC (исключение размера)
Мешалка с горячей пластинойCorningPC-420D
Соляная кислотаSigmaH1759Tris-HCl
IndexZEISS444970-9000-000
Индуктивно связанная плазма-реактивная ионная травкаTop Technology Ltd.FabStar
Изопропил &бета;-D-1-тиогалактопиранизид (IPTG)Glentham LifeSciences GC6586-100gИспользуется для индукции активности &бета;-галактозидазы
Лямбда-фаг ДНКNEBN0311
LB бульонBD difco244610Среда для роста клеток E.coli
адаптер Люэра 10-32IDEXP-659Это соединение люэр-замка шприц и трубка
Хлорид магния гексагидратбиореагенты ФишераBP214
Метилизобутилкетон (MIBK)KAYAKU ADVANCED MATERIALSИспользуется для разработки раствора
Микроскоп (Eclipse Ti2)NikonEclipse Ti2Инвертированный флуоресцентный микроскоп
Микроскоп стеклянный покровный листMARIENFELD10114222 x 50 мм (No1)
Предметное стекло для микроскопаDURAN GROUPDU.2355013Стекло шлифованный край 45°, обычный 26 x 76 мм
НанопортIDEXN-333-01
ОбъективNikonCFI Plan Apochromat VC 60XC WIТип погружения: вода, увеличение: 60x, коррекция: 18, рабочее расстояние: 0,29 (0,31-0,28)
One Shot BL21 (DE3)pLysS Химически компетентный E. coliThermo Fisher ScientificC6060-03Компетентная клетка для сверхэкспрессии белков
Кислород (O<суб>2)NOBLEGAS, Южная КореяЧистота: >99,99%
PFA трубка натуральнаяIDEX1512LОна соединена с "Fingertight Fittings" для образования трубки с люэровским замком
Фенилметилсульфонилфторид (PMSF)Roche11359061001ингибитор
протеазыSephacryl S-200 Цитива высокого разрешения17-0584-01Используется для FPLC (исключение размера)
Запорный клапанIDEXP-732
Ацетат натрияSigma791741
Хлорид натрия (NaCl)SigmaS3014
Гидроксид натрия (NaOH)Sigmas5881
Спектр/Por трубка с молекулярно-пористой мембраной, MWCO 6-8 kDaSpectrum laboratories132660
СтрептавидинThermo Fisher ScientificS888
Тетралфторид серы (SF4)NOBLEGAS, Южная КореяЧистота: >99.99%
Шприцевой насосKD Scientific78-8210
Тетрафторметан (CF4)NOBLEGAS, Южная КореяЧистота: >99,99%
TritonX-100SigmaT9284
База TrizmaSigmaT1503Используется для Tris-HCl
TSKgel SP-5PWTOSOH14715Используется для FPLC (ионный обмен)
Союзная сборкаIDEXP-760Это соединяет трубки
МочевинаSigmaU5378
Вакуумная печьJeio TechOV-11
YOYO-1Thermo Fisher ScientificY3601Этот интеркаляционный краситель разбавлен в ДМСО
&бета;-меркаптоэтаноле (BME)SigmaM6250
Используется для масла для согласования

Ссылки

  1. Woodcock, C. L., Ghosh, R. P. Chromatin higher-order structure and dynamics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (5), 000596(2010).
  2. Kim, K., Eom, J., Jung, I. Characterization of structural variations in the context of 3D chromatin structure. Molecules and Cells. 42 (7), 512-522 (2019).
  3. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
  4. McGhee, J. D., Felsenfeld, G. Nucleosome structure. Annual Review of Biochemistry. 49, 1115-1156 (1980).
  5. Takata, H., et al. Chromatin compaction protects genomic DNA from radiation damage. PLOS One. 8 (10), 75622(2013).
  6. Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
  7. Peterson, C. L., Almouzni, G. Nucleosome dynamics as modular systems that integrate DNA damage and repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), 012658(2013).
  8. Torigoe, S. E., Urwin, D. L., Ishii, H., Smith, D. E., Kadonaga, J. T. Identification of a rapidly formed nonnucleosomal histone-DNA intermediate that is converted into chromatin by ACF. Molecules and Cells. 43 (4), 638-648 (2011).
  9. Gurard-Levin, Z. A., Quivy, J. P., Almouzni, G. Histone chaperones: assisting histone traffic and nucleosome dynamics. Annual Review of Biochemistry. 83, 487-517 (2014).
  10. Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
  11. Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
  12. Hammond, C. M., Stromme, C. B., Huang, H., Patel, D. J., Groth, A. Histone chaperone networks shaping chromatin function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (3), 141-158 (2017).
  13. De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: an escort network regulating histone traffic. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
  14. Zou, J. X., Revenko, A. S., Li, L. B., Gemo, A. T., Chen, H. W. ANCCA, an estrogen-regulated AAA+ ATPase coactivator for ERalpha, is required for co-regulator occupancy and chromatin modification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18067-18072 (2007).
  15. Lombardi, L. M., Davis, M. D., Rine, J. Maintenance of nucleosomal balance in cis by conserved AAA-ATPase Yta7. Genetics. 199 (1), 105-116 (2015).
  16. Gal, C., et al. Abo1, a conserved bromodomain AAA-ATPase, maintains global nucleosome occupancy and organisation. EMBO Reports. 17 (1), 79-93 (2016).
  17. Cho, C., et al. Structural basis of nucleosome assembly by the Abo1 AAA+ ATPase histone chaperone. Nature Communications. 10 (1), 5764(2019).
  18. Morozumi, Y., et al. Atad2 is a generalist facilitator of chromatin dynamics in embryonic stem cells. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (4), 349-362 (2016).
  19. Zhang, M., Zhang, C., Du, W., Yang, X., Chen, Z. ATAD2 is overexpressed in gastric cancer and serves as an independent poor prognostic biomarker. Clinical and Translational Oncology. 18 (8), 776-781 (2016).
  20. Kang, Y., Cho, C., Lee, K. S., Song, J. J., Lee, J. Y. Single-molecule imaging reveals the mechanism underlying histone loading of schizosaccharomyces pombe AAA+ ATPase Abo1. Molecules and Cells. 44 (2), 79-87 (2021).
  21. Fried, M. G. Measurement of protein-DNA interaction parameters by electrophoresis mobility shift assay. Electrophoresis. 10 (5-6), 366-376 (1989).
  22. Kessler, S. W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A. Journal of Immunology. 115 (6), 1617-1624 (1975).
  23. Lu, H. P. Single-molecule study of protein-protein and protein-DNA interaction dynamics. Methods in Molecular Biology. 305, 385-414 (2005).
  24. Fazio, T., Visnapuu, M. L., Wind, S., Greene, E. C. DNA curtains and nanoscale curtain rods: high-throughput tools for single molecule imaging. Langmuir. 24 (18), 10524-10531 (2008).
  25. Kang, Y., et al. High-throughput single-molecule imaging system using nanofabricated trenches and fluorescent DNA-binding proteins. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1640-1648 (2020).
  26. Cheon, N. Y., Kim, H. S., Yeo, J. E., Scharer, O. D., Lee, J. Y. Single-molecule visualization reveals the damage search mechanism for the human NER protein XPC-RAD23B. Nucleic Acids Research. 47 (16), 8337-8347 (2019).
  27. Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecules and Cells. 54 (5), 832-843 (2014).
  28. Kang, H. J., et al. TonEBP recognizes R-loops and initiates m6A RNA methylation for R-loop resolution. Nucleic Acids Research. 49 (1), 269-284 (2021).
  29. Zhou, H., et al. Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1. Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).
  30. Visnapuu, M. L., Greene, E. C. Single-molecule imaging of DNA curtains reveals intrinsic energy landscapes for nucleosome deposition. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (10), 1056-1062 (2009).
  31. Stigler, J., Camdere, G. O., Koshland, D. E., Greene, E. C. Single-molecule imaging reveals a collapsed conformational state for DNA-bound cohesin. Cell Reports. 15 (5), 988-998 (2016).
  32. Thornton, J. A. Sputter Coating- Its Principles and Potential. SAE Transactions. 82, 1787-1805 (1973).
  33. Grigorescu, A. E., Hagen, C. W. Resists for sub-20-nm electron beam lithography with a focus on HSQ: state of the art. Nanotechnology. 20 (29), 292001(2009).
  34. Meir, A., Kong, M., Xue, C., Greene, E. C. DNA curtains shed light on complex molecular systems during homologous recombination. Journal of Visualized Experiments. (160), e61320(2020).
  35. Cold Spring Harbor Protocols. Gloxy. Vol. 2. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
  36. Gracey, L. E., et al. An in vitro-identified high-affinity nucleosome-positioning signal is capable of transiently positioning a nucleosome in vivo. Epigenetics Chromatin. 3 (1), 13(2010).
  37. Subtil-Rodriguez, A., Reyes, J. C. BRG1 helps RNA polymerase II to overcome a nucleosomal barrier during elongation, in vivo. EMBO Reports. 11 (10), 751-757 (2010).
  38. Lancrey, A., et al. Nucleosome positioning on large tandem DNA repeats of the '601' sequence engineered in Saccharomyces cerevisiae. bioRxiv. , (2021).
  39. Perales, R., Zhang, L., Bentley, D. Histone occupancy in vivo at the 601 nucleosome binding element is determined by transcriptional history. Molecular and Cellular Biology. 31 (16), 3485-3496 (2011).
  40. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
  41. Rossmann, K. Point spread-function, line spread-function, and modulation transfer function. Tools for the study of imaging systems. Radiology. 93 (2), 257-272 (1969).
  42. Blainey, P. C., et al. Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1224-1229 (2009).
  43. Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
  44. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
  45. Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
  46. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  47. Teif, V. B., Rippe, K. Nucleosome mediated crosstalk between transcription factors at eukaryotic enhancers. Physical Biology. 8 (4), 044001(2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Расшифровка молекулярного механизма сборки гистонов методом ДНК-занавеса
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.