Анализ протеинурии, почечной инфильтрации лейкоцитов и почечного отложения белков у склонных к волчанке МРЛ/ЛПР мышей

Основной функцией почек является выведение токсических веществ через мочу при сохранении гомеостаза воды и солей¹. Эта функция находится под угрозой у пациентов с системной красной волчанкой (СКВ), что приводит к так называемому волчаночному нефриту (ЛН). LN является следствием того, что иммунная система атакует почки, что приводит к постоянному воспалению почек, поэтому она теряет способность очищать отходы из крови и регулировать концентрацию соли и жидкости. Это в конечном итоге приведет к почечной недостаточности, которая может быть фатальной. Во время нефритического процесса циркулирующие В-клетки, Т-клетки и моноциты рекрутируются в почку, секретируя хемокины, цитокины и иммунные комплексообразующие аутоантитела. Это в конечном итоге приводит к повреждению эндотелиальных клеток, мембранным повреждениям, атрофии почечных канальцев и фиброзу².

MRL / Mp-Fas^lpr (MRL / lpr) мыши, склонные к волчанке, являются классической моделью мыши, проявляющей волчаноподобные клинические признаки, которые напоминают человеческую СКВ³. Эта модель сыграла важную роль в понимании одной из ведущих причин смертности у пациентов с СКВ, волчаночного нефрита (LN)⁴. Как у человека, так и у мышей СКВ LN характеризуется постепенным воспалением, вызванным почечным отложением иммунных комплексов, за которым следует активация комплемента, набор воспалительных клеток и потеря функции почек⁵. Отложение иммунного комплекса является первым шагом к индуцированию производства хемокина и цитокина внутренними почечными клетками, что расширяет воспалительный ответ путем набора иммунных клеток⁶. Текущий протокол представляет несколько методов для отслеживания прогрессирования почечной недостаточности, которые анализируют инфильтрацию клеток и отложение иммунного комплекса.

Моча, собранная каждую неделю, позволяет обнаружить и визуализировать временное течение протеинурии до, во время и после начала волчанки. Протеинурия как биомаркер может определять биологическую прогрессию ЛН. Другие преимущества этого метода заключаются в том, что он неинвазивный, экономически эффективный и простой в реализации⁷. Когда почка работает отлично, уровень протеинурии стабильно низкий; однако у мышей MRL/lpr после 8-9-недельного возраста наблюдается постепенное повышение уровня протеинурии, который в конечном итоге достаточно высок, чтобы вызвать почечную недостаточность⁸. Несколько полосок реагентов и колориметрических реагентов коммерчески доступны для мониторинга проблемы. Однако брэдфордский анализ дешев и очень точен в определении начала протеинурии и течения волчаночного нефрита. Этот анализ является быстрым, и на реагент не влияет присутствие растворителей, буферов, восстановителей и хелатирующих агентов, которые могут быть в вашем образце ^9,10,11.

Одним из важных аспектов, которые следует учитывать, является инфильтрация клеток в почках. Эти инфильтраты способствуют патогенезу, вызывая секрецию растворимых факторов, таких как цитокины, для усугубления воспаления¹². Чтобы лучше понять, какие клеточные популяции присутствуют в инфильтратах, полезным методом является выделение лейкоцитов¹³. Здесь в качестве примера используется обнаружение почечной инфильтрации В-клеток. Процедура начинается с процесса пищеварения дезоксирибонуклеазой (ДНКаза) и коллагеназой, за которым следует разделение градиента плотности, которое удаляет мусор, эритроциты и плотные гранулоциты. Причина выделения В-клеток (CD19⁺) и плазматических клеток (CD138+) заключается ^в том, что волчаночные почки могут концентрировать эти клетки¹⁴. Предполагается, что наличие В-клеток в небольших агрегатах в почках может свидетельствовать о клональной экспансии и, следовательно, выработке иммуноглобулина (Ig). Хорошо известно, что плазматические клетки присутствуют в этих агрегатах, а также¹⁵. После того, как лейкоциты были выделены, флуоресцентно-активированная клеточная сортировка (FACS) может быть использована для анализа клеток, представляющих интерес, при окрашивании различными флуоресцентно-конъюгированными антителами.

Иммунофлуоресценция является одним из методов иммуногистохимии (IHC), который позволяет флуоресцентную визуализацию белков в образцах почечной ткани толщиной 4 мкм. Другие методы обнаружения IHC зависят от природы аналитов, химии связывания и других факторов¹⁶. Иммунофлуоресценция — это метод быстрой идентификации, который подвергает антиген воздействию его аналога антитела, меченного специфическим фторхромом (или флуоресцентным красителем). При возбуждении он производит свет, который может обнаружить флуоресцентный микроскоп. Этот метод может быть использован для наблюдения осаждения комплемента C3 и IgG2a¹⁷. Чрезмерная каскадная активация комплемента может быть связана с неконтролируемым иммунным ответом и потерей функции¹⁸. Иммунная депонирование антидвухлопчатых аутоантител ДНК (анти-dsDNA) в почках является основной проблемой¹⁹, где те, у кого изотип IgG2a, были связаны с LN²⁰. В частности, анти-dsDNA антитела проявляют большую патогенность и сродство к ядерным материалам, образуя иммунные комплексы²¹. Когда присутствует IgG2a, каскад комплемента, включая C3, активируется для очистки иммунных комплексов²². Маркеры C3 и IgG2a могут быть количественно определены по отдельности или наложены для установления их корреляции.

Примечательно, что измерение креатинина в сыворотке крови является еще одним надежным методом, который можно использовать вместе с микроскопической гематурией и биопсией почек для диагностики LN²³. Однако наличие протеинурии является сильным показателем повреждения клубочков. В этом смысле мониторинг уровня протеинурии во время волчанки может обнаружить начало заболевания и дополнить другие методы диагностики волчанки. Кроме того, иммунные комплексы, отложенные в клубочках, могут вызывать воспалительную реакцию, активировать систему комплемента и набирать больше воспалительных клеток. Еще одним примечательным моментом этого протокола является инфильтрация В-клеток в почке. Это, вместе с инфильтрированными Т-клетками, усиливает местные иммунные реакции, которые вызывают повреждение органов. Важно отметить, что классификация LN основана не только на клубочковых морфологических изменениях, наблюдаемых в микроскопии, но и на иммунных отложениях, наблюдаемых при иммунофлуоресценции. Поэтому в данном протоколе предлагаются точные и экономически эффективные методы анализа функции почек в лабораторных условиях.

Настоящий протокол одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Virginia Tech. Поскольку болезнь волчанки имеет более высокую заболеваемость у самок, использовались только самки мышей MRL / lpr. Отбор проб начинался в возрасте 4 недель и заканчивался в 15 недель. Мыши были получены из коммерческих источников (см. Таблицу материалов) и были выведены и содержались в определенной среде, свободной от патогенов, в соответствии с институциональными руководящими принципами.

1. Тест на протеинурию

1. Соберите мочу, следуя приведенным ниже шагам.
   1. Стерилизуйте капот, распыляя 70% этанола. Поместите на поверхность стерильный пластиковый лист. Подготовьте наконечники, пробирки по 1,5 мл и пипетку, чтобы собрать около 20 мкл жидкости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наконечники и трубки должны быть стерильными и без предварительной обработки.
   2. Возьмите клетку и распылите 70% этанола, прежде чем поместить его внутрь капота.
   3. Одной рукой держите мышь, а другой рукой мягко массируйте вентральную область сверху донизу.
   4. Используйте пробирку или пипетку объемом 1,5 мл для непосредственного сбора мочи, или, если образец падает, соберите ее из пластикового листа. Используйте свежие перчатки, простыни и наконечники для каждого образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если это не сработает, используйте стерильный стакан для изоляции мыши, а затем соберите мочу из стакана после того, как мышь помочится.
   5. Поместите мышь обратно в клетку. Выньте другую мышь и повторите шаги 1.1.3-1.1.4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда очищайте пластиковый лист и стакан с 70% этанолом после сбора образца для каждой мыши. Для статистической значимости необходимо не менее пяти мышей в группе. Образцы мочи могут храниться при -80 °C до использования в течение 12 месяцев.
2. Количественное определение белков методом^{Брэдфорда 24}.
   1. Позвольте образцам мочи, стандартному альбумину и реагенту Брэдфорда достичь комнатной температуры (RT), храня их вне морозильной камеры в течение 10-20 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Реагент Брэдфорда и стандарт альбумина включены в коммерчески доступный комплект (см. Таблицу материалов). Начальная концентрация стандарта альбумина составляет 2 мг/мл. Последовательные разведения (1:2 шесть раз) необходимо проводить водой.
   2. Добавьте реагент Брэдфорда в 96-луночную пластину (200 мкл/лунку), неразбавленную.
   3. Пипетка 5 мкл неразбавленного образца мочи на лунку и используйте наконечник для пипетки вверх и вниз несколько раз, чтобы правильно перемешать.
   4. Добавьте стандарты (400, 200, 100, 50, 25, 12,5 мг/дл) в двух экземплярах. Оставьте пару колодцев в виде заготовок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление образцов и стандартов должно быть сделано быстро.
   5. Дайте ему постоять 5-10 минут на RT.
   6. Считывайте пластину при 595 нм в считывателе пластин в соответствии с протоколом производителя (см. Таблицу материалов).

2. Выделение клеток почек

1. Усыплите мышь с CO₂ (скорость потока: 30%-70% объем/мин, для достижения потери сознания или смерти) в камере с последующим вывихом шейки матки. Приступают к рассечению, чтобы собрать обе почки. Поместите полторы почки в ледяную среду C10. Поместите другую половину почки в ОКТ (шаг 3.1.1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: C10 производится с RPMI 1640, дополненным 10% фетальной бычьей сывороткой, 1 мМ пирувата натрия, 1% 100x MEM заменимых аминокислот, 10 мМ HEPES, 55 мкМ 2-меркаптоэтанола и 100 ЕД/мл пенициллина-стрептомицина (см. Таблицу материалов).
2. Нарезать почки на размер зерна (1-2 мм³ кусочка) и переварить в 5 мл буфера пищеварения, содержащего 1 мг/мл коллагеназы и 0,2 мг/мл ДНКазы I (см. Таблицу материалов) в среде RPMI 1640, содержащей 10 ммоль/л HEPES в течение 1 ч с непрерывным мягким встряхиванием при 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте 1 мл буфера пищеварения в стерильную трубку объемом 2 мл и используйте стерильные ножницы для измельчения почки.
3. Добавьте 10 мл 1x ледяного PBS, содержащего 10 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), и инкубируйте в течение 10 мин на льду. Затем дважды вихрь суспензии.
4. Фильтруйте клеточную суспензию через ситечко 100 мкМ и промывайте 10 мл HBSS-full.
   ПРИМЕЧАНИЕ: HBSS-full содержит 5 мМ ЭДТА, 0,1% BSA и 10 мМ HEPES.
5. Центрифуга при 350 х г в течение 10 мин при РТ.
6. Приготовьте 30%, 37% и 70% стоковой изотонический раствор Перколла (SIP).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Смешайте 1 часть объема 10x PBS и 9 частей тома Percoll для приготовления SIP (см. Таблицу материалов); использовать HBSS-full для разбавления SIP до 30%, 37% и 70% SIP.
7. Повторно суспендировать ячейки в 5 мл 30% SIP и загрузить 37% из 5 мл (сверху) и 70% из 5 мл (снизу), делая SIP градиентом, медленно с помощью пипетки пастера.
8. Центрифуга с Up9 down0 (или тормозом 0) при 1000 x g в течение 30 мин при RT.
9. Соберите лейкоциты с 37%-70% интерфейса и повторно суспендируйте их в 5 мл С10.
10. Центрифуга при 350 х г в течение 10 мин при 4 °C.
11. Повторное суспендирование клеточной гранулы в 3 мл буфера FACS. Ячейки готовы к окрашиванию FACS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер FACS содержит 1x PBS и 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA).
12. Центрифугу при 350 х г в течение 5 мин при 4 °C и выбросьте супернатант (SN), оставив около 50 мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы удалить супернатант, осторожно вылейте или пипеткой раствор подальше от твердого вещества или используйте полуавтоматический вакуум для аспирации супернатанта.
13. Добавьте 50 мкл блока FcR (см. Таблицу материалов) на пробирку (предварительно разбавленную 1/50 в 1x PBS); перемешать и высиживать на льду в темноте в течение 10 мин.
14. Добавьте 2 мл буфера FACS для стирки.
15. Центрифугу при 350 х г в течение 5 мин при 4 °C и отбросьте SN, оставив около 50 мкл.
16. Добавьте 20 мкл соответствующего флуоресцентного красителя (разбавьте 1/100 с 1x PBS, см. Таблицу материалов) и дайте ему постоять 15-30 мин на льду.
17. Добавьте 50 мкл смеси антител¹⁵ на пробирку: CD138-BV711 (1/200 в 1x PBS) и CD45-AF700 (1/200 в 1x PBS) (см. Таблицу материалов).
18. Инкубировать на льду в темноте в течение 15-30 мин и добавить 3 мл буфера FACS.
19. Центрифуга при 350 х г в течение 5 мин при 4 °C и вакуум SN, оставляя около 50 мкл. Resuspend в 200 мкл 1x PBS. Теперь это готово к анализу с помощью проточной цитометрии.

3. Иммунофлуоресцентное окрашивание

1. Выполните выборку образцов.
   1. Вставьте половину почки в небольшой пластиковый криомольд с соединением оптимальной температуры резания (OCT) (см. Таблицу материалов).
   2. Добавьте сухой лед в коробку из пенополистирола (см. Таблицу материалов) и аккуратно положите криомольд поверх сухого льда. Убедитесь, что криомолды расположены ровно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для затвердевания соединения OCT требуется 3-4 мины, чтобы затвердеть и побелеть.
   3. Выньте криомольд и заверните его в алюминиевую фольгу. Храните при температуре -80 °C до дальнейшего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Его можно хранить при температуре -80 °C в течение не менее 1 года.
2. Выполните секционирование и фиксацию образца.
   1. Разрежьте образцы на 4 мкм секции, подождите не менее 2-3 ч, чтобы высохнуть, а затем зафиксируйте холодным ацетоном (при 4 °C) в течение 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны при использовании ацетона, который требует специализированной химической вытяжки.
   2. После фиксации горок сушить на воздухе в течение 0,5-1 ч и хранить их непродолжительное время при -20 °C или длительное время при -80 °C.
3. Окрашивайте образцы.
   1. Зафиксируйте слайды в холодном ацетоне на 5-10 мин.
   2. Дайте секциям нагреться до RT. Используйте ручку PAP (см. Таблицу материалов) вокруг секции и дайте ей высохнуть.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ногтевая эмаль также может быть использована. Этот шаг предотвращает разбавление антител от плавания по всему слайду.
   3. Поместите слайды в 1x Tris-буферный физиологический раствор (TBS) в банку Coplin (см. Таблицу материалов) на 20 минут, положите банку на шейкер и аккуратно встряхните.
   4. Вылейте 1x TBS и наполните банку 1x TBS, 5% BSA и 0,1% Tween 20. Инкубировать в течение 20 мин на шейкере, аккуратно встряхнуть.
   5. Выньте горки и вытрите нижнюю часть горок насухо. При необходимости вытряхните горки насухо. Добавьте в раздел 100 мкл конъюгированных антител²⁵ C3-FITC (1/100) и IgG2a-PE (1/100) (см. Таблицу материалов). Инкубировать на РТ в увлажненной камере в течение 1 ч.
   6. Промыть секцию 3 раза в 1x TBS, 5% BSA и 0,1% Tween 20 в течение 10 мин на шейкере.
   7. Встряхните, высушите горки и смонтируйте секцию с антизатухающим реагентом (см. Таблицу материалов), затем крышкой.
   8. Храните слайды при температуре 4 °C до просмотра под микроскопом (например, конфокальным микроскопом или микроскопом системы визуализации). Количественно оценивайте изображения с помощью программного обеспечения и вычитайте фоновые сигналы при сравнении интенсивности флуоресценции между областями.
   9. Для анализа изображений с помощью программного обеспечения ImageJ (см. Таблицу материалов) наметьте нужную область.
   10. Установите стандартные параметры, щелкнув «Анализировать», затем «Установить измерения и измерить площадь», чтобы получить результаты.
   11. Перенесите данные, полученные из окон измерения, в электронную таблицу.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшая область может быть выбрана из изображения в качестве фона; он не должен иметь флуоресценции.
   12. После этого нажмите «Анализировать», чтобы измерить регион и снова перенести данные в предыдущую электронную таблицу.
   13. Повторите шаги 3.3.11-3.3.12 для нескольких регионов.
   14. Вычислите среднюю флуоресценцию как скорректированную флуоресценцию клеток (CCF) = Интегрированная плотность - (Выбранная область ячейки x Средняя фоновая флуоресценция).
   15. Рассчитайте для каждого региона и проанализируйте данные с помощью графического и статистического программного обеспечения (см. Таблицу материалов).

Протокол использует несколько методов для оценки МРЛ/лпр мышей на волчаночный нефрит. Во-первых, описана процедура изучения повышенного уровня протеинурии из-за дисфункции почек с течением времени. Как показано на рисунке 1, самок мышей лечили пероральным приемом 200 мкл фосфатно-буферного физиологического раствора (1x PBS) в качестве контрольной группы и пробиотика Lactobacillus reuteri в качестве группы лечения в концентрации 109 КОЕ/мл два раза в неделю. Лечение началось в 3 недели и закончилось в 15 недель. Группа мышей, получавшая L. reuteri , имела более агрессивное прогрессирование протеинурии, чем контрольная группа.

Рисунок 1: Обнаружение уровня белка в моче мышей MRL/lpr с течением времени. n = 5 мышей в группе. Статистика была выполнена с помощью простого теста линейной регрессии. *P < 0,05, **P < 0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

На рисунке 2 показан анализ FACS изолированных лейкоцитов почек. Мышей в этом эксперименте лечили ванкомицином (2 г/л) или ванкомицином плюс E. coli dsDNA (80 мкг). Ванкомицин давали вместе с питьевой водой в течение указанного периода времени. Пероральный прием бактериальной ДНК вводили мышам, получавшим ванкомицин, один раз в неделю в течение четырех недель подряд в возрасте 4, 5, 6 и 7 недель. Ожидалось , что дцДНК E. coli вызовет почечную инфильтрацию плазматических клеток, что приведет к нарушению функции почек, но существенной разницы обнаружено не было.

Рисунок 2: Анализ плазматических клеток в изолированных лейкоцитах почек. (А) Последовательная стратегия гаширования: общие клетки, одиночные клетки, живые клетки, клетки CD45+ и, наконец, клетки CD138+ . (B) Процентное содержание плазматических клеток после лечения ваном (Ванкомицином) или ван + ДНК (Ванкомицин + E. coli dsDNA) в течение 3 недель (n ≥ 5 мышей на группу). Статистической значимости ('ns') не наблюдалось. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

На рисунке 3 показано иммунофлуоресцентное окрашивание комплемента C3 и IgG2a на женских участках почек MRL/lpr. В этом эксперименте сравнивали влияние факторов окружающей среды на почечное осаждение C3 и IgG2a. Домашних мышей разводили на животноводческом объекте в течение нескольких поколений, и их сравнивали с недавно купленными мышами у продавца. Иммуногистохимический анализ не показал никакой разницы между различными объектами.

Рисунок 3: Обнаружение комплемента C3 и IgG2a в участках почек с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания. (A) Репрезентативные изображения участков почек, окрашенных анти-C3-FITC (зеленый) и анти-IgG2a-PE (красный). (B) Сравнение скорректированной флуоресценции клеток (CCF) между двумя группами (n ≥ 5 мышей в группе). Шкала = 100 мкМ. Статистической значимости ('ns') не наблюдалось. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Авторы заявляют, что конфликта интересов нет.