Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Анализ протеинурии, почечной инфильтрации лейкоцитов и почечного отложения белков у склонных к волчанке МРЛ/ЛПР мышей

3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63506

⸱

8 июня 2022 г.

 , 
1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

В этой статье

Краткое содержание

Настоящий протокол описывает метод отслеживания прогрессирования волчанки у мышей. Представлены две дополнительные процедуры для характеристики волчаночного нефрита на основе клеточной инфильтрации и отложении белка в почках.

Аннотация

Системная красная волчанка (СКВ) является аутоиммунным заболеванием без известного лечения и характеризуется стойким воспалением во многих органах, включая почки. При таких обстоятельствах почка теряет способность очищать отходы из крови и регулировать концентрацию соли и жидкости, что в конечном итоге приводит к почечной недостаточности. Женщины, особенно детородного возраста, диагностируются в девять раз чаще, чем мужчины. Заболевание почек является основной причиной смертности у пациентов с СКВ. Настоящий протокол описывает быстрый и простой метод измерения уровня выделяемого белка в собранной моче, отслеживая прогрессирование волчанки с течением времени. Кроме того, предусмотрен подход к выделению мононуклеарных клеток почек на основе выбора размера и плотности для исследования почечной инфильтрации лейкоцитов. Кроме того, разработан иммуногистохимический метод для характеристики отложений белка в клубочках и инфильтрации лейкоцитов в тубулоинтерстициальном пространстве. Вместе эти методы могут помочь исследовать прогрессирование хронического воспаления, связанного с почками склонных к волчанке МРЛ / лпр мышей.

Введение

Основной функцией почек является выведение токсических веществ через мочу при сохранении гомеостаза воды и солей1. Эта функция находится под угрозой у пациентов с системной красной волчанкой (СКВ), что приводит к так называемому волчаночному нефриту (ЛН). LN является следствием того, что иммунная система атакует почки, что приводит к постоянному воспалению почек, поэтому она теряет способность очищать отходы из крови и регулировать концентрацию соли и жидкости. Это в конечном итоге приведет к почечной недостаточности, которая может быть фатальной. Во время нефритического процесса циркулирующие В-клетки, Т-клетки и моноциты рекрутируются в почку, секретируя хемокины, цитокины и иммунные комплексообразующие аутоантитела. Это в конечном итоге приводит к повреждению эндотелиальных клеток, мембранным повреждениям, атрофии почечных канальцев и фиброзу2.

MRL / Mp-Faslpr (MRL / lpr) мыши, склонные к волчанке, являются классической моделью мыши, проявляющей волчаноподобные клинические признаки, которые напоминают человеческую СКВ3. Эта модель сыграла важную роль в понимании одной из ведущих причин смертности у пациентов с СКВ, волчаночного нефрита (LN)4. Как у человека, так и у мышей СКВ LN характеризуется постепенным воспалением, вызванным почечным отложением иммунных комплексов, за которым следует активация комплемента, набор воспалительных клеток и потеря функции почек5. Отложение иммунного комплекса является первым шагом к индуцированию производства хемокина и цитокина внутренними почечными клетками, что расширяет воспалительный ответ путем набора иммунных клеток6. Текущий протокол представляет несколько методов для отслеживания прогрессирования почечной недостаточности, которые анализируют инфильтрацию клеток и отложение иммунного комплекса.

Моча, собранная каждую неделю, позволяет обнаружить и визуализировать временное течение протеинурии до, во время и после начала волчанки. Протеинурия как биомаркер может определять биологическую прогрессию ЛН. Другие преимущества этого метода заключаются в том, что он неинвазивный, экономически эффективный и простой в реализации7. Когда почка работает отлично, уровень протеинурии стабильно низкий; однако у мышей MRL/lpr после 8-9-недельного возраста наблюдается постепенное повышение уровня протеинурии, который в конечном итоге достаточно высок, чтобы вызвать почечную недостаточность8. Несколько полосок реагентов и колориметрических реагентов коммерчески доступны для мониторинга проблемы. Однако брэдфордский анализ дешев и очень точен в определении начала протеинурии и течения волчаночного нефрита. Этот анализ является быстрым, и на реагент не влияет присутствие растворителей, буферов, восстановителей и хелатирующих агентов, которые могут быть в вашем образце 9,10,11.

Одним из важных аспектов, которые следует учитывать, является инфильтрация клеток в почках. Эти инфильтраты способствуют патогенезу, вызывая секрецию растворимых факторов, таких как цитокины, для усугубления воспаления12. Чтобы лучше понять, какие клеточные популяции присутствуют в инфильтратах, полезным методом является выделение лейкоцитов13. Здесь в качестве примера используется обнаружение почечной инфильтрации В-клеток. Процедура начинается с процесса пищеварения дезоксирибонуклеазой (ДНКаза) и коллагеназой, за которым следует разделение градиента плотности, которое удаляет мусор, эритроциты и плотные гранулоциты. Причина выделения В-клеток (CD19+) и плазматических клеток (CD138+) заключается в том, что волчаночные почки могут концентрировать эти клетки14. Предполагается, что наличие В-клеток в небольших агрегатах в почках может свидетельствовать о клональной экспансии и, следовательно, выработке иммуноглобулина (Ig). Хорошо известно, что плазматические клетки присутствуют в этих агрегатах, а также15. После того, как лейкоциты были выделены, флуоресцентно-активированная клеточная сортировка (FACS) может быть использована для анализа клеток, представляющих интерес, при окрашивании различными флуоресцентно-конъюгированными антителами.

Иммунофлуоресценция является одним из методов иммуногистохимии (IHC), который позволяет флуоресцентную визуализацию белков в образцах почечной ткани толщиной 4 мкм. Другие методы обнаружения IHC зависят от природы аналитов, химии связывания и других факторов16. Иммунофлуоресценция — это метод быстрой идентификации, который подвергает антиген воздействию его аналога антитела, меченного специфическим фторхромом (или флуоресцентным красителем). При возбуждении он производит свет, который может обнаружить флуоресцентный микроскоп. Этот метод может быть использован для наблюдения осаждения комплемента C3 и IgG2a17. Чрезмерная каскадная активация комплемента может быть связана с неконтролируемым иммунным ответом и потерей функции18. Иммунная депонирование антидвухлопчатых аутоантител ДНК (анти-dsDNA) в почках является основной проблемой19, где те, у кого изотип IgG2a, были связаны с LN20. В частности, анти-dsDNA антитела проявляют большую патогенность и сродство к ядерным материалам, образуя иммунные комплексы21. Когда присутствует IgG2a, каскад комплемента, включая C3, активируется для очистки иммунных комплексов22. Маркеры C3 и IgG2a могут быть количественно определены по отдельности или наложены для установления их корреляции.

Примечательно, что измерение креатинина в сыворотке крови является еще одним надежным методом, который можно использовать вместе с микроскопической гематурией и биопсией почек для диагностики LN23. Однако наличие протеинурии является сильным показателем повреждения клубочков. В этом смысле мониторинг уровня протеинурии во время волчанки может обнаружить начало заболевания и дополнить другие методы диагностики волчанки. Кроме того, иммунные комплексы, отложенные в клубочках, могут вызывать воспалительную реакцию, активировать систему комплемента и набирать больше воспалительных клеток. Еще одним примечательным моментом этого протокола является инфильтрация В-клеток в почке. Это, вместе с инфильтрированными Т-клетками, усиливает местные иммунные реакции, которые вызывают повреждение органов. Важно отметить, что классификация LN основана не только на клубочковых морфологических изменениях, наблюдаемых в микроскопии, но и на иммунных отложениях, наблюдаемых при иммунофлуоресценции. Поэтому в данном протоколе предлагаются точные и экономически эффективные методы анализа функции почек в лабораторных условиях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Настоящий протокол одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Virginia Tech. Поскольку болезнь волчанки имеет более высокую заболеваемость у самок, использовались только самки мышей MRL / lpr. Отбор проб начинался в возрасте 4 недель и заканчивался в 15 недель. Мыши были получены из коммерческих источников (см. Таблицу материалов) и были выведены и содержались в определенной среде, свободной от патогенов, в соответствии с институциональными руководящими принципами.

1. Тест на протеинурию

  1. Соберите мочу, следуя приведенным ниже шагам.
    1. Стерилизуйте капот, распыляя 70% этанола. Поместите на поверхность стерильный пластиковый лист. Подготовьте наконечники, пробирки по 1,5 мл и пипетку, чтобы собрать около 20 мкл жидкости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наконечники и трубки должны быть стерильными и без предварительной обработки.
    2. Возьмите клетку и распылите 70% этанола, прежде чем поместить его внутрь капота.
    3. Одной рукой держите мышь, а другой рукой мягко массируйте вентральную область сверху донизу.
    4. Используйте пробирку или пипетку объемом 1,5 мл для непосредственного сбора мочи, или, если образец падает, соберите ее из пластикового листа. Используйте свежие перчатки, простыни и наконечники для каждого образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если это не сработает, используйте стерильный стакан для изоляции мыши, а затем соберите мочу из стакана после того, как мышь помочится.
    5. Поместите мышь обратно в клетку. Выньте другую мышь и повторите шаги 1.1.3-1.1.4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда очищайте пластиковый лист и стакан с 70% этанолом после сбора образца для каждой мыши. Для статистической значимости необходимо не менее пяти мышей в группе. Образцы мочи могут храниться при -80 °C до использования в течение 12 месяцев.
  2. Количественное определение белков методомБрэдфорда 24.
    1. Позвольте образцам мочи, стандартному альбумину и реагенту Брэдфорда достичь комнатной температуры (RT), храня их вне морозильной камеры в течение 10-20 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Реагент Брэдфорда и стандарт альбумина включены в коммерчески доступный комплект (см. Таблицу материалов). Начальная концентрация стандарта альбумина составляет 2 мг/мл. Последовательные разведения (1:2 шесть раз) необходимо проводить водой.
    2. Добавьте реагент Брэдфорда в 96-луночную пластину (200 мкл/лунку), неразбавленную.
    3. Пипетка 5 мкл неразбавленного образца мочи на лунку и используйте наконечник для пипетки вверх и вниз несколько раз, чтобы правильно перемешать.
    4. Добавьте стандарты (400, 200, 100, 50, 25, 12,5 мг/дл) в двух экземплярах. Оставьте пару колодцев в виде заготовок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление образцов и стандартов должно быть сделано быстро.
    5. Дайте ему постоять 5-10 минут на RT.
    6. Считывайте пластину при 595 нм в считывателе пластин в соответствии с протоколом производителя (см. Таблицу материалов).

2. Выделение клеток почек

  1. Усыплите мышь с CO2 (скорость потока: 30%-70% объем/мин, для достижения потери сознания или смерти) в камере с последующим вывихом шейки матки. Приступают к рассечению, чтобы собрать обе почки. Поместите полторы почки в ледяную среду C10. Поместите другую половину почки в ОКТ (шаг 3.1.1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: C10 производится с RPMI 1640, дополненным 10% фетальной бычьей сывороткой, 1 мМ пирувата натрия, 1% 100x MEM заменимых аминокислот, 10 мМ HEPES, 55 мкМ 2-меркаптоэтанола и 100 ЕД/мл пенициллина-стрептомицина (см. Таблицу материалов).
  2. Нарезать почки на размер зерна (1-2 мм3 кусочка) и переварить в 5 мл буфера пищеварения, содержащего 1 мг/мл коллагеназы и 0,2 мг/мл ДНКазы I (см. Таблицу материалов) в среде RPMI 1640, содержащей 10 ммоль/л HEPES в течение 1 ч с непрерывным мягким встряхиванием при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте 1 мл буфера пищеварения в стерильную трубку объемом 2 мл и используйте стерильные ножницы для измельчения почки.
  3. Добавьте 10 мл 1x ледяного PBS, содержащего 10 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), и инкубируйте в течение 10 мин на льду. Затем дважды вихрь суспензии.
  4. Фильтруйте клеточную суспензию через ситечко 100 мкМ и промывайте 10 мл HBSS-full.
    ПРИМЕЧАНИЕ: HBSS-full содержит 5 мМ ЭДТА, 0,1% BSA и 10 мМ HEPES.
  5. Центрифуга при 350 х г в течение 10 мин при РТ.
  6. Приготовьте 30%, 37% и 70% стоковой изотонический раствор Перколла (SIP).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смешайте 1 часть объема 10x PBS и 9 частей тома Percoll для приготовления SIP (см. Таблицу материалов); использовать HBSS-full для разбавления SIP до 30%, 37% и 70% SIP.
  7. Повторно суспендировать ячейки в 5 мл 30% SIP и загрузить 37% из 5 мл (сверху) и 70% из 5 мл (снизу), делая SIP градиентом, медленно с помощью пипетки пастера.
  8. Центрифуга с Up9 down0 (или тормозом 0) при 1000 x g в течение 30 мин при RT.
  9. Соберите лейкоциты с 37%-70% интерфейса и повторно суспендируйте их в 5 мл С10.
  10. Центрифуга при 350 х г в течение 10 мин при 4 °C.
  11. Повторное суспендирование клеточной гранулы в 3 мл буфера FACS. Ячейки готовы к окрашиванию FACS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер FACS содержит 1x PBS и 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA).
  12. Центрифугу при 350 х г в течение 5 мин при 4 °C и выбросьте супернатант (SN), оставив около 50 мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы удалить супернатант, осторожно вылейте или пипеткой раствор подальше от твердого вещества или используйте полуавтоматический вакуум для аспирации супернатанта.
  13. Добавьте 50 мкл блока FcR (см. Таблицу материалов) на пробирку (предварительно разбавленную 1/50 в 1x PBS); перемешать и высиживать на льду в темноте в течение 10 мин.
  14. Добавьте 2 мл буфера FACS для стирки.
  15. Центрифугу при 350 х г в течение 5 мин при 4 °C и отбросьте SN, оставив около 50 мкл.
  16. Добавьте 20 мкл соответствующего флуоресцентного красителя (разбавьте 1/100 с 1x PBS, см. Таблицу материалов) и дайте ему постоять 15-30 мин на льду.
  17. Добавьте 50 мкл смеси антител15 на пробирку: CD138-BV711 (1/200 в 1x PBS) и CD45-AF700 (1/200 в 1x PBS) (см. Таблицу материалов).
  18. Инкубировать на льду в темноте в течение 15-30 мин и добавить 3 мл буфера FACS.
  19. Центрифуга при 350 х г в течение 5 мин при 4 °C и вакуум SN, оставляя около 50 мкл. Resuspend в 200 мкл 1x PBS. Теперь это готово к анализу с помощью проточной цитометрии.

3. Иммунофлуоресцентное окрашивание

  1. Выполните выборку образцов.
    1. Вставьте половину почки в небольшой пластиковый криомольд с соединением оптимальной температуры резания (OCT) (см. Таблицу материалов).
    2. Добавьте сухой лед в коробку из пенополистирола (см. Таблицу материалов) и аккуратно положите криомольд поверх сухого льда. Убедитесь, что криомолды расположены ровно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для затвердевания соединения OCT требуется 3-4 мины, чтобы затвердеть и побелеть.
    3. Выньте криомольд и заверните его в алюминиевую фольгу. Храните при температуре -80 °C до дальнейшего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Его можно хранить при температуре -80 °C в течение не менее 1 года.
  2. Выполните секционирование и фиксацию образца.
    1. Разрежьте образцы на 4 мкм секции, подождите не менее 2-3 ч, чтобы высохнуть, а затем зафиксируйте холодным ацетоном (при 4 °C) в течение 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны при использовании ацетона, который требует специализированной химической вытяжки.
    2. После фиксации горок сушить на воздухе в течение 0,5-1 ч и хранить их непродолжительное время при -20 °C или длительное время при -80 °C.
  3. Окрашивайте образцы.
    1. Зафиксируйте слайды в холодном ацетоне на 5-10 мин.
    2. Дайте секциям нагреться до RT. Используйте ручку PAP (см. Таблицу материалов) вокруг секции и дайте ей высохнуть.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ногтевая эмаль также может быть использована. Этот шаг предотвращает разбавление антител от плавания по всему слайду.
    3. Поместите слайды в 1x Tris-буферный физиологический раствор (TBS) в банку Coplin (см. Таблицу материалов) на 20 минут, положите банку на шейкер и аккуратно встряхните.
    4. Вылейте 1x TBS и наполните банку 1x TBS, 5% BSA и 0,1% Tween 20. Инкубировать в течение 20 мин на шейкере, аккуратно встряхнуть.
    5. Выньте горки и вытрите нижнюю часть горок насухо. При необходимости вытряхните горки насухо. Добавьте в раздел 100 мкл конъюгированных антител25 C3-FITC (1/100) и IgG2a-PE (1/100) (см. Таблицу материалов). Инкубировать на РТ в увлажненной камере в течение 1 ч.
    6. Промыть секцию 3 раза в 1x TBS, 5% BSA и 0,1% Tween 20 в течение 10 мин на шейкере.
    7. Встряхните, высушите горки и смонтируйте секцию с антизатухающим реагентом (см. Таблицу материалов), затем крышкой.
    8. Храните слайды при температуре 4 °C до просмотра под микроскопом (например, конфокальным микроскопом или микроскопом системы визуализации). Количественно оценивайте изображения с помощью программного обеспечения и вычитайте фоновые сигналы при сравнении интенсивности флуоресценции между областями.
    9. Для анализа изображений с помощью программного обеспечения ImageJ (см. Таблицу материалов) наметьте нужную область.
    10. Установите стандартные параметры, щелкнув «Анализировать», затем «Установить измерения и измерить площадь», чтобы получить результаты.
    11. Перенесите данные, полученные из окон измерения, в электронную таблицу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшая область может быть выбрана из изображения в качестве фона; он не должен иметь флуоресценции.
    12. После этого нажмите «Анализировать», чтобы измерить регион и снова перенести данные в предыдущую электронную таблицу.
    13. Повторите шаги 3.3.11-3.3.12 для нескольких регионов.
    14. Вычислите среднюю флуоресценцию как скорректированную флуоресценцию клеток (CCF) = Интегрированная плотность - (Выбранная область ячейки x Средняя фоновая флуоресценция).
    15. Рассчитайте для каждого региона и проанализируйте данные с помощью графического и статистического программного обеспечения (см. Таблицу материалов).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Протокол использует несколько методов для оценки МРЛ/лпр мышей на волчаночный нефрит. Во-первых, описана процедура изучения повышенного уровня протеинурии из-за дисфункции почек с течением времени. Как показано на рисунке 1, самок мышей лечили пероральным приемом 200 мкл фосфатно-буферного физиологического раствора (1x PBS) в качестве контрольной группы и пробиотика Lactobacillus reuteri в качестве группы лечения в концентрации 109 КОЕ/мл два раза в неделю. Лечение начало...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

ЛН является основной причиной смертности у пациентов с СКВ, и факторы, усугубляющие заболевание, остаются неясными. Применение этого протокола заключается в характеристике функции почек с использованием нескольких методов, включая измерение протеинурии, анализ FACS изолированных лейкоцитов почек и иммунофлуоресцентное окрашивание замороженных участков почек.

Один важный момент, который следует учитывать при сборе мочи, заключается в том, что необходимо соответствовать времени суток и месту сбо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что конфликта интересов нет.

Благодарности

Мы благодарим Центр проточной цитометрии, Лабораторию гистопатологии, Центр визуализации Фралина в Политехническом институте Вирджинии и Государственный университет за техническую поддержку. Эта работа поддерживается различными NIH и внутренними грантами.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10x Трис-буферный физиологический раствор (TBS)Thermo Fisher ScientificJ60764. K2
2-меркаптоэтанолThermo Fisher Scientific21985-023
Античеловек/мышь C3ЦедарланCL7632F
Анти-мышь CD138 BV711Биолегенда142519
Антимышиный CD45 AF700Биолегенда103127
Бычья сыворотка АльбуминСигма-ОлдричA9418-100G
Коллагеназа DSigma-Aldrich11088882001
Конфокальный микроскоп LSM 880ZeissLSM 880
Coplin jarFisher Scientific50-212-281
CryomoldFisher ScientificNC9511236
Градиент плотности средаGE Healthcare17-1440-02Percoll
DEPC-Обработанная водаThermo Fisher ScientificAM9906
ДНКаза ISigma-AldrichD4527
dsDNA-ECInvivoGentlrl-ecDNA
Этилендиаминтетрауксусная кислотаFisher ScientificS311-500EDTA
EVOS M5000 Система визуализации для микроскопаThermo Fisher ScientificAMF5000
FACS Fusion Cell SorterBD BiosciencesFACS Fusion
Фетальная бычья сыворотка - премиум, термоинактивированнаяR& D системыS11150H
Fisherbrand 96-луночные полистирольные пластиныFisher Scientific12-565-501
Graphpad призмаGraphPadN/A
Hank' s Сбалансированный раствор солиThermo Fisher Scientific14175-079
HEPESThermo Fisher Scientific15630-080
Программное обеспечение ImageJНациональные институты здравоохраненияN/A
Lactobacillus reuteri Kandler et al.ATCC23272
MEM заменимые аминокислотыThermo Fisher Scientific11140-050
MRL/MpJ-Fas lpr/J Mice (MRL/lpr)Jackson Lab485
Лак для ногтейН/Д/ДЛюбой обычный магазин
O.C.T компаундTisse-Tek4583
PAP ручкаSigma-AldrichZ377821
Peel-A-Way Одноразовые закладные формыPolysciencesR-30
Пенициллин-стрептомицинThermo Fisher Scientific15140-122
Фосфат-солевой буфер (PBS)Thermo Fisher Scientific70011069
Pierce 20x TBS BufferThermo Fisher Scientific28358
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Набордля анализаThermo Fisher Scientific23236Стандартный альбумин в комплекте
ProLon Gold Antifade MountantThermoFisherP36934
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32BD Biosciences553141блок FcR
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11875-093
Пируват натрияThermo Fisher Scientific11360-070
SpectraMax M5Molecular DevicesН/ДПрограммное обеспечение SoftMax Pro 6.1
Стерильные клеточные фильтры 100 & микро; MFisher Scientific22363549
Tween 20Fisher ScientificBP337-500
Ванкомицина гидрохлоридGoldbioV-200-1
Zombie AquaBiolegend423102флуоресцентный краситель для анализа проточной цитометрии
Н

Ссылки

  1. Tsokos, G. C. Systemic Lupus Erythematosus. New England Journal of Medicine. 365 (22), 2110-2121 (2011).
  2. Davidson, A., Aranow, C. Lupus nephritis: lessons from murine models. Nature Reviews Rheumatology. 6 (1), 13-20 (2010).
  3. Maldonado, M. A., et al. The role of environmental antigens in the spontaneous development of autoimmunity in MRL-lpr mice. Journal of Immunology. 162 (11), 6322-6330 (1999).
  4. Lech, M., Anders, H. J. The pathogenesis of lupus nephritis. Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1357-1366 (2013).
  5. Bagavant, H., Fu, S. M. Pathogenesis of kidney disease in systemic lupus erythematosus. Current Opinion in Rheumatology. 21 (5), 489-494 (2009).
  6. Li, Q. Z., et al. Identification of autoantibody clusters that best predict lupus disease activity using glomerular proteome arrays. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3428-3439 (2005).
  7. Aragón, C. C., et al. Urinary biomarkers in lupus nephritis. Journal of Translational Autoimmunity. 3, 100042(2020).
  8. Mu, Q., et al. Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota. Microbiome. 5 (1), 73(2017).
  9. Lu, T. -S., Yiao, S. -Y., Lim, K., Jensen, R. V., Hsiao, L. -L. Interpretation of biological and mechanical variations between the Lowry versus Bradford method for protein quantification. North American Journal of Medical Sciences. 2 (7), 325-328 (2010).
  10. Lamb, E. J., MacKenzie, F., Stevens, P. E. How should proteinuria be detected and measured. Annals of Clinical Biochemistry. 46, Pt 3 205-217 (2009).
  11. Viswanathan, G., Upadhyay, A. Assessment of proteinuria. Advances in Chronic Kidney Disease. 18 (4), 243-248 (2011).
  12. Hsieh, C., et al. Predicting outcomes of lupus nephritis with tubulointerstitial inflammation and scarring. Arthritis Care & Research. 63 (6), 865-874 (2011).
  13. Hill, G. S., Delahousse, M., Nochy, D., Mandet, C., Bariéty, J. Proteinuria and tubulointerstitial lesions in lupus nephritis. Kidney International. 60 (5), 1893-1903 (2001).
  14. Chang, A., et al. In situ B cell-mediated immune responses and tubulointerstitial inflammation in human lupus nephritis. Journal of Immunology. 186 (3), 1849-1860 (2011).
  15. Schrezenmeier, E., Jayne, D., Dörner, T. Targeting B Cells and plasma cells in glomerular diseases: translational perspectives. Journal of the American Society of Nephrology. 29 (3), 741(2018).
  16. Fitzgibbons, P. L., et al. Principles of analytic validation of immunohistochemical assays: Guideline from the college of American pathologists pathology and laboratory quality center. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 138 (11), 1432-1443 (2014).
  17. Lewis, M. J., Botto, M. Complement deficiencies in humans and animals: links to autoimmunity. Autoimmunity. 39 (5), 367-378 (2006).
  18. Watanabe, H., et al. Modulation of renal disease in MRL/lpr mice genetically deficient in the alternative complement pathway factor B. Journal of Immunology. 164 (2), 786-794 (2000).
  19. Yin, Z., et al. IL-10 regulates murine lupus. Journal of Immunology. 169 (4), 2148-2155 (2002).
  20. Singh, R. R., et al. Differential contribution of IL-4 and STAT6 vs STAT4 to the development of lupus nephritis. Journal of Immunology. 170 (9), 4818-4825 (2003).
  21. van Bavel, C. C., Fenton, K. A., Rekvig, O. P., vander Vlag, J., Berden, J. H. Glomerular targets of nephritogenic autoantibodies in systemic lupus erythematosus. Arthritis & Rheumatism. 58 (7), 1892-1899 (2008).
  22. Zuniga, R., et al. Identification of IgG subclasses and C-reactive protein in lupus nephritis: the relationship between the composition of immune deposits and FCgamma receptor type IIA alleles. Arthritis & Rheumatism. 48 (2), 460-470 (2003).
  23. Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine. International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).
  24. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1), 248-254 (1976).
  25. Cabana-Puig, X., et al. Phenotypic drift in lupus-prone MRL/lpr Mice: potential roles of micrornas and gut microbiota. Immunohorizons. 6 (1), 36-46 (2022).
  26. Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine. International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).
  27. Kienzle, N., Young, D., Zehntner, S., Bushell, G., Sculley, T. B. DNaseI treatment is a prerequisite for the amplification of cDNA from episomal-based genes. Biotechniques. 20 (4), 612-616 (1996).
  28. Park, J. G. -, et al. Immune cell composition in normal human kidneys. Scientific Reports. 10 (1), 15678(2020).
  29. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
  30. Okutucu, B., Dınçer, A., Habib, Ö, Zıhnıoglu, F. Comparison of five methods for determination of total plasma protein concentration. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (5), 709-711 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Анализ протеинуриилейкоцитарная инфильтрация почекотложение белков в почкахмышипредрасположенные к развитию волчанкисистемная красная волчанкамононуклеарные клетки почекиммуногистохимическое окрашиваниевыделение методом градиента Percollпроточная цитометриягломерулярное отложение белков
Анализ протеинурии, почечной инфильтрации лейкоцитов и почечного отложения белков у склонных к волчанке МРЛ/ЛПР мышей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.