Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Электрофизиологические методы измерения уровня фотопигмента в фоторецепторах дрозофилы

2.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63514

⸱

2 июня 2022 г.

 ,  , 
1Department of Medical Neurobiology, Faculty of Medicine and the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences (ELSC), Hebrew University

В этой статье

Краткое содержание

Представлен протокол электрофизиологической характеристики бистабильных фотопигментов: (i) использование смещений заряда внутри молекул фотопигмента после поглощения фотонов и их огромного количества в фоторецепторах и (ii) использование различий спектров поглощения состояний фотопигмента родопсина и метарходопсина. Эти протоколы полезны для скрининга мутаций, влияющих на бистабильные фотопигментные системы.

Аннотация

Drosophila G-белок-связанный фотопигмент родопсин (R) состоит из белка (опсина) и хромофора. Процесс активации родопсина инициируется фотонной абсорбционно-индуцирующей изомеризацией хромофора, способствуя конформационным изменениям опсина и приводя ко второму темно-стабильному состоянию фотопигмента (метарходопсин, М). Исследование этого бистабильного фотопигмента с использованием случайного мутагенеза требует простых и надежных методов скрининга мутантных мух. Поэтому было разработано несколько методов измерения снижения функциональных уровней фотопигмента. Один из таких методов использует смещения заряда внутри фотопигмента после поглощения фотонов и огромного количества молекул фотопигмента, экспрессируемых в фоторецепторах. Этот электрический сигнал, называемый ранним рецепторным потенциалом (или ранним рецепторным током), измеряется различными электрофизиологическими методами (например, электроретинограммой и записями целых клеток) и линейно пропорционален функциональным уровням фотопигмента. Преимуществами этого метода являются высокое отношение сигнал/шум, прямое линейное измерение уровней фотопигмента и независимость механизмов фототрансдукции после активации родопсина или метарходопсина. Дополнительный электрофизиологический метод, называемый пролонгированным деполяризующим послепотенциальным (PDA), использует бистабильность фотопигмента Drosophila и абсорбционно-спектральные различия пигментных состояний мух R и M. КПК индуцируется интенсивным синим светом, превращая насыщенное количество родопсина в метародопсин, что приводит к сбою прекращения светового отклика в течение длительного времени в темноте, но оно может быть прекращено превращением метарходопсина в родопсин с использованием интенсивного оранжевого света. Поскольку КПК является надежным сигналом, который требует массивного преобразования фотопигмента, даже небольшие дефекты в биогенезе фотопигмента приводят к легко обнаруживаемому аномальному КПК. Действительно, дефектные мутанты PDA привели к идентификации новых сигнальных белков, важных для фототрансдукции.

Введение

Светоактивированный родопсин (R), который является рецептором, связанным с G-белком (GPCR), состоит из 7 трансмембранных белков (опсин) и хромофора. У Drosophila melanogaster (плодовая муха) поглощение фотонов индуцирует изомеризацию хромофора 11-цис-3-ОН-ретинальной хромофора в all-trans-3-OH-retinal1, способствуя конформационному изменению родопсина на метародопсин (M, рисунок 1A). В отличие от позвоночного родопсина, преобладающая фракция хромофора беспозвоночных не диссоциирует от опсина, в результате чего возникает физиологически активное темно-стабильное пигментное состояние М. В свою очередь, дополнительное поглощение фотонов полностью транс-транс-3-ОН-хромофором сетчатки индуцирует изомеризацию хромофора 2,3, генерируя R-пигментное состояние с 11-цис-3-ОН-ретинальным хромофором. R-состояние представляет собой темный, стабильный и физиологически неактивный фотопигмент. В дополнение к чрезвычайно быстрому пути регенерации фотонов хромофора4, очень похожему на фотопигменты позвоночных, у беспозвоночных существует альтернативный ферментативный медленный путь регенерации хромофора, в котором некоторые из стадий выполняются в клетках сетчатки, окружающих клетки фоторецепторов 5,6.

Дрозофила влечет за собой большие преимущества в качестве модельного организма для изучения фоторецепторов беспозвоночных. В частности, доступность препарата и возможность применения молекулярной генетики сделали дрозофилу мощной модельной системой7. Таким образом, было установлено несколько экспериментальных методов in vivo и ex vivo для изучения фототрансдукции в целом и уровней фотопигмента в частности. Простейший метод in-vivo использует относительно большую внеклеточную зарегистрированную реакцию напряжения на свет глаза дрозофилы. Соответственно, световая стимуляция вызывает реакцию электрического напряжения во всем глазу, которая может быть измерена с помощью записи внеклеточной электроретинограммы (ERG), которая ~ 3 порядка больше, чем реакция ERG на свет глаз позвоночных 8,9. Ответ Drosophila ERG является надежным и легко получаемым, что делает его удобным методом выявления аномалий светового ответа из-за мутаций. Реакция ERG на свет возникает в основном из фоторецепторов, пигментных (глийных) клеток и вторичных нейронов пластинки (см. Рисунок 1B). Основными компонентами ERG являются (i) внеклеточный ответ напряжения фоторецепторов, (ii) переходные процессы «вкл» и «выкл» в начале и конце светового стимула, которые возникают из нейронов ламины (рисунок 2A, вставка, ON, OFF), (iii) медленный ответ клеток глии (рисунок 2A, вставка, стрелки) и (iv) краткий и переходный ответ, в результате смещения заряда при активации фотопигмента, которая предшествует переходному переходуON 10 (рисунок 2C [вставка], D, E). Этот краткий ответ состоит из двух фаз (M1 и M2, рисунок 2C [вставка]) и может быть вызван только чрезвычайно сильной световой стимуляцией, которая одновременно активирует миллионы молекул фотопигмента. Он не наблюдается ни при синей стимуляции (рисунок 2D, синий след), ни у мутантов с сильно сниженными уровнями фотопигмента (рисунок 2E, красный след), но его амплитуда слегка усиливается у мутанта, который отменяет активность ПЛК (рисунок 2E, оранжевый след). Фаза M1 является типичной ERP мухи, возникающей в результате активации M в фоторецепторах. Фаза M1, которая имеет положительную полярность (внутриклеточную), высвобождает нейротрансмиттер нормальным образом в синапсе, инвертирующем знак, и активирует нейроны lamina, которые реагируют на деполяризацию фоторецепторов, генерируя синаптически усиленную фазу M2. Таким образом, фазы М1 и М2 отражают активацию М10,11.

Деполяризация фоторецептора генерирует роговично-положительный переходный процесс «на», возникающий из знаково-инвертирующего синапса между аксоном фоторецептора и монополярными нейронами пластинки10,11 (рисунок 1В). Медленный подъем и распад ЭРГ возникают в результате деполяризации пигментных клеток (рисунок 2А, вставка, стрелки) в основном из-за выброса K+ из фоторецепторных клеток12 через транзиторный рецепторный потенциал (TRP) и TRP-подобные (TRPL) каналы13,14,15. Эти медленные кинетические компоненты в значительной степени маскируют и искажают форму сигнала реакции фоторецептора по сравнению с внутриклеточными или цельноклеточными записями реакции фоторецептора на свет 9,10. Кроме того, при очень сильном освещении может наблюдаться дополнительная переходная реакция, которая предшествует и частично сливается с переходным процессом «on» (рисунок 2C [вставка], D, E). Этот сигнал исходит непосредственно от массивной активации фотопигмента10.

Несколько протоколов светового режима с использованием нейтральной плотности (ND) и цветных фильтров, а также сильных осветительных вспышек были разработаны для исследования глаза в целом и каскада фототрансдукции в частности. Эти протоколы также использовались для исследования свойств фотопигмента.

Протокол интенсивности-отклика измеряет пиковую амплитуду реакции напряжения ERG всего глаза на увеличение интенсивности света (рисунок 2A, B). Этот протокол помогает обнаружить изменения чувствительности фоторецепторных клеток к свету9.

Протокол пролонгированной деполяризации послепотенциала (PDA) использует различия в спектрах поглощения родопсина и метародопсина, что позволяет в дрозофиле массивное фотопигментное преобразование R в его физиологически активное и темно-стабильное промежуточное M-состояние2. В ответе напряжения ERG подается относительно короткий импульс насыщенного света, и результирующая реакция напряжения регистрируется. При этом потолок (обратный потенциал) достигается сигналом деполяризации, поскольку активации доли процента от огромного количества молекул родопсина (~1 х 108) достаточно для достижения потолка. Наличие компонентов фототрансдукции в большом изобилии гарантирует, что этот потолок будет достигнут даже у мутантов со значительным снижением концентрации или тонким сбоем компонентов фототрансдукции. Такая ситуация исключает изоляцию этих мутантов. Pak et al. представили скрининг PDA7 в поисках надежного и показательного теста для изоляции визуальных мутантов. У дрозофилы реакция КПК вызвана генетическим удалением красного экранирующего пигмента, что позволяет превращать фотопигмент, и применением синего света, который преимущественно поглощается родопсином (рисунок 3A) и, таким образом, приводит к большому чистому преобразованию R в состояние фотопигмента M. Окончание фототрансдукции нарушается на уровне фотопигмента большим чистым преобразованием R в M, что, в свою очередь, приводит к устойчивому возбуждению в течение длительного времени после выключения света (рисунок 2C, рисунок 4A [вверху]). В течение периода ОАП фоторецепторы менее чувствительны к последующим тестовым огням и частично десенсибилизированы (инактивированы). PDA обнаруживает даже незначительные дефекты в биогенезе родопсина и проверяет максимальную способность фоторецепторной клетки поддерживать возбуждение в течение длительного периода. Поскольку он строго зависит от наличия высоких концентраций родопсина, он легко оценивается за недостаточное восполнение компонентов фототрансдукции. Примечательно, что экран КПК дал много новых и очень важных визуальных мутантов (рассмотренных в Pak et al.7). Таким образом, мутанты PDA, выделенные Pak et al.7 , по-прежнему чрезвычайно полезны для анализа зрительной системы Drosophila .

КПК индуцируется у дрозофилы путем насыщения синим светом, что приводит к непрерывной деполяризации в течение длительного времени после смещения света (рисунок 4A [вверху]). После насыщения КПК-индуцирующим синим светом периферические фоторецепторы (R1-6) остаются непрерывно активными в темноте на своей максимальной мощности, достигая насыщения. Дополнительные насыщенные синие огни во время КПК не вызывают никакого дополнительного ответа в клетках R1-6 в течение многих секунд, но вызывают ответ в клетках R7-8, который накладывается на КПК. Наложенные ответы объясняются различными спектрами поглощения фотопигментов, экспрессируемых в этих клетках (R7-8)16. КПК может быть подавлен фотоконверсией M обратно в R с насыщенным оранжевым светом (рисунок 4A [вверху]). Способность КПК доводить фоторецепторные клетки до их максимальной активной емкости, ситуация, которая не может быть достигнута интенсивным белым светом, объясняет, почему он был основным инструментом для скрининга визуальных мутантов дрозофилы. Это связано с тем, что он позволяет обнаруживать даже незначительные дефекты в белках, участвующих в биогенезе нормальных уровней фотопигмента17,18. Были выделены две группы дефектных мутантов PDA: ни инактивационные, ни послепотенциальные (нина) мутанты и инактивация, но не постпотенциальные (ina) мутанты. Фенотип первого представляет собой отсутствие ОАП и связанную с ним инактивацию, возникающую в результате значительного снижения уровней фотопигмента (рисунок 4А [средний]). Фенотип последнего показывает инактивацию, но не темную деполяризацию после синего света из-за все еще неизвестного механизма у мутанта с нормальным уровнем родопсина, но без белков, взаимодействующих с каналами TRP (рисунок 4A [внизу]).

КПК возникает из-за разницы в количестве фотопигмента относительно арестина (ARR2), который связывает и прекращаетактивность M 19,20,21 (рисунок 1A). В фоторецепторах дрозофилы количество фотопигмента примерно в пять раз больше, чем количество ARR219. Таким образом, уровни ARR2 недостаточны для инактивации всех молекул M, генерируемых большой чистой фотоконверсией R в M, оставляя избыток M постоянно активным в темноте 17,19,20,22,23. Этот механизм объясняет устранение ответа ОАП мутациями или каротиноидной депривацией24,25, вызывая снижение уровня фотопигмента, но не влияет на уровни арестина. Кроме того, это объяснение также учитывает фенотипы нулевого мутантного аллеля21 ARR2 (arr23), в котором КПК может быть достигнут при ~10-кратной диммере интенсивности синего света19,20,21 (рисунок 4B,C). КПК не является уникальной особенностью фоторецепторов мух, и она появляется у каждого тестируемого вида, который имеет темный стабильный M со спектром поглощения, отличным от спектра R-состояния, что позволяет достаточную фотоконверсию фотопигмента из состояния R в состояние M. Тщательно исследованным видом, у которого была обнаружена феноменология PDA, является фоторецептор ракушки (Balanus), у которого спектр поглощения R-состояния находится в большей длине волны, чем состояние M2 (рисунок 3B). Соответственно, в отличие от ситуации в мухе, в ракушке оранжево-красный свет индуцирует КПК, в то время как синий свет подавляет КПК2.

Протокол раннего рецепторного потенциала (ERP) использует смещение заряда, происходящее во время активации R или M. Зрительный пигмент является неотъемлемой частью поверхностной мембраны сигнального отсека как позвоночных, так и беспозвоночных мембран3. Соответственно, процесс активации, при котором молекулы фотопигмента изменяются из одного промежуточного состояния в другое, сопровождается смещением заряда 4,26. Поскольку молекулы фотопигмента электрически выровнены параллельно емкости мембраны4, быстрое синхронизированное конформационное изменение порождает быстрое поляризационное изменение поверхностной мембраны, которое у мух происходит в сигнальном отсеке, состоящем из стека из ~ 30 000-50 000 микроворсинок, называемых рабдомером. Эта поляризация затем пассивно разряжается через мембранную емкость клеточного тела до тех пор, пока клеточная мембрана не будет одинаково поляризована. ERP - это внеклеточная запись смещения заряда. Внутриклеточный зарегистрированный ERP проявляет внеклеточную ERP, интегрированную константой времени клеточной мембраны 4,27,28. Ток, активируемый визуальным смещением заряда пигмента, также может быть измерен в записях29,30 напряжения цельных ячеек (рисунок 5A-D), с основным преимуществом (в записях раннего рецепторного тока (ERC)) минимизации влияния емкости мембраны на кинетику сигнала.

В разделе протокола описывается, как выполнять измерения ERG из Drosophila eye9 и измерения ERC с помощью полноклеточных записей из изолированной ромматидии Drosophila 31,32. Мы также описываем конкретные протоколы, которые используются для исследования фототрансдукции в целом и фотопигментов в частности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Измерение зависимости интенсивности реакции, длительной деполяризующей афпотенциальной (PDA) и раннего рецепторного потенциала (ERP) с помощью электроретинограммы

  1. Подходящие условия выращивания для приготовления меланогастера D.
    1. Выращивайте D. melanogaster мух в бутылках, содержащих стандартную желтую кукурузу, содержащую пищу, в инкубаторе, поддерживаемом при температуре 24 ° C и в 12-часовом цикле темного / светлого
    2. Держите флаконы с мухами в темноте не менее чем за 24 часа до начала эксперимента.
  2. Общая настройка
    1. Подготовьте записывающие пипетки, вытянув 1 мм x 0,58 мм (O.D x I.D) заполненные волокном боросиликатные стеклянные капилляры (рисунок 6L, O). Сопротивление пипеток должно составлять 5-10 МОм; можно использовать любой подходящий съемник.
    2. Покройте два серебряных провода AgCl2, вставив серебряный провод 0,25 мм в раствор 3 M KCl, подключенный к специально изготовленному источнику питания 5 В.
    3. Вставьте каждую покрытую серебряную проволоку в держатели электродов (рисунок 6N).
    4. Заполните стеклянный капилляр отфильтрованным раствором Рингера (см. таблицу 1) с помощью шприца с удлиненным наконечником (рисунок 6M).
    5. Вставьте проволочный электрод в стеклянный капилляр. Убедитесь, что раствор внутри капилляра находится в контакте с серебряной проволокой.
    6. Вставьте держатели электродов (рисунок 7P, N) в два электродных микроманипулятора (рисунок 7G).
  3. Процедура подготовки мухи к электрическим записям
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сохранить муху в условиях, адаптированных к темноте, используйте только тусклое освещение красным светом во время следующих шагов.
    1. Обезболить мух в бутылке газом CO2 с помощью системы шпалы (рисунок 6A, B) и вылить их в контейнер для спального места.
    2. Выберите одну муху и осторожно держите ее за крыло с помощью острого пинцета. Накройте остальных мух чашкой Петри.
    3. Поместите муху на держатель мухи в правильной ориентации, лежа на боку, спиной к руке (рисунок 6P).
    4. Включите блок питания паяльника. Установите значение тока ~2,25 А. Этот ток должен нагревать платино-иридиевую нить 0,25 мм до ~55-56 °C (см. Дополнительный файл).
    5. Поместите каплю воска с низкой температурой плавления (~55-56 °C) на паяльник (рисунок 6F).
    6. Используя пинцет, поднимите муху с крыльев и закрепите ее крылья на держателе мухи (рисунок 6I) с помощью паяльника.
    7. С помощью паяльника соедините спинку мухи с поверхностью подставки воском (рисунок 6P).
    8. Опустите кончик паяльника на точку соединения ножек и расплавите воск, чтобы покрыть все ножки вместе (рисунок 6P).
    9. Поместите небольшую каплю воска между головой и спиной в область шеи (рисунок 6P).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте особенно осторожны, чтобы избежать перегрева головки мухи. Убедитесь, что муха правильно закреплена и не может двигаться во время эксперимента; незначительные движения могут создавать артефакты в записях. Убедитесь, что отверстия трахеи (дыхательные отверстия) в грудной клетке и брюшной полости не покрыты воском.
    10. Поместите держатель мухи (рисунок 7Q) в темную клетку Фарадея на магнитном блоке (рисунок 7I) и убедитесь, что муха находится примерно в 5 мм от конца световода (рисунок 7L).
    11. Поместите записывающий электрод (рисунок 7P) над глазом мухи и наземный электрод (рисунок 7N) над верхней частью спины мухи с помощью микроманипуляторов.
    12. Вставьте заземляющий электрод в заднюю часть мухи с помощью микроманипуляторов.
    13. Вставьте записывающий электрод во внешнюю периферию глаза мухи, предпочтительно, используя микроманипуляторы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После введения электрода в глаз будет наблюдаться небольшая ямочка; потяните электрод вверх, не удаляя его из глаза, пока ямочка не исчезнет. Электроды также могут быть погружены в небольшие капли электродного желе, нанесенного на туловище и глаз.
  4. Протокол "интенсивность-реакция"
    1. Поместите оранжевый фильтр (590 кромочный фильтр) перед ксеноновой лампой высокого давления. Используйте большой (шесть порядков) фильтр нейтральной плотности (ND).
    2. Подождите 60 с в темноте и дайте световой импульс 5 с.
    3. Замените ND-фильтр менее затухающим ND-фильтром с шагом в один порядок.
    4. Подождите 60 с в темноте и дайте второй световой импульс 5 с.
    5. Повторите шаги 1.4.1.-1.4.4, постепенно увеличивая интенсивность света с помощью менее затухающих ND-фильтров (последний импульс должен генерироваться без ND-фильтра вообще). Убедитесь, что серия ND-фильтров используется в правильном направлении, начиная с большого затухания и достигая низкого затухания.
  5. Протокол PDA (этот протокол может быть выполнен только на белоглазых мухах)
    1. Подайте световой импульс максимальной интенсивности 5 с с помощью оранжевого фильтра (590 краевой фильтр, чтобы преобразовать максимальный фотопигмент в состояние R).
    2. Замените оранжевый фильтр широкополосным синим (BP450/40 нм) фильтром и дайте три световых импульса 5 с максимальной интенсивностью.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Также можно давать длинный непрерывный импульс синего света максимальной интенсивности до тех пор, пока не будет достигнута устойчивая характеристика напряжения.
    3. Подождите 60 с в темноте, замените синий фильтр предыдущим оранжевым фильтром и дайте два световых импульса по 5 с с интервалом 60 с.
  6. ERP/M-потенциальный протокол для измерения фоторавновешенного спектра M (этот протокол может быть выполнен только на белоглазых мухах10,25)
    1. Дают непрерывный синий (полоса пропускания (BP) 450/40 нм) световой импульс до достижения стационарного отклика напряжения, который преобразует максимальное количество фотопигмента из состояния R в состояние M ячеек R1-6.
    2. Дают кратковременную (<3 мс) интенсивную вспышку света длиной волны между 350-700 нм (известный спектр поглощения фотопигмента R1-6 ячеек) с помощью узких (~20 нм) полосовых фильтров и измеряют пиковую амплитуду фазы M1 потенциального отклика M (которая отражает поглощение метарходопсина на этой конкретной длине волны при фоторавнового равновесии10,25).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для синхронной активации большого пула молекул фотопигмента требуется короткая, интенсивная вспышка света, чтобы содержание фотонов было упаковано в течение короткого периода времени. Потенциал M состоит из двух компонентов: M1 (отрицательная фаза роговицы), которая отражает смещение заряда метарходопсина в фоторецепторе, и M2 (положительная фаза роговицы11,33), которая отражает усиленный ответ M1 фоторецепторов в пластине 9,10,11 . Каждый из этих компонентов может быть идентифицирован и измерен. Однако предпочтительнее измерить потенциал М1, поскольку он является прямым линейным проявлением уровней М. Если используется М2, убедитесь, что его амплитуда находится в линейном диапазоне, используя легкую каротиноидную депривацию24,25.
    3. Снова дайте непрерывный синий (BP450/40 нм) световой импульс, за которым последует короткая (<1 мс) интенсивная световая вспышка другой длины волны.
    4. Повторяйте этот протокол до тех пор, пока не будет покрыт весь спектр поглощения М при фоторавновешении.

2. Протокол ERC для измерения спектра действия R и M состояний R1-6 ячеек с использованием записей напряжения-зажима цельной ячейки

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробный протокол использования записей зажима напряжения на целых ячейках см. в Katz et al.34. M-потенциал использует ERG для измерения активации M-состояния только потому, что вклад R-состояния подавляется емкостью мембраны. Напротив, ERC измеряет активацию состояний R (положительный ERC) и M (отрицательный ERC), поскольку записи напряжения-зажима устраняют эффект емкости мембраны (см. Введение).

  1. Преобразуйте фотопигмент в нужное состояние (R или M). Для преобразования R в M, во-первых, адаптируйте мух с помощью короткой (<1 мс) адаптивной синей (BP450/40 нм) вспышки. Для преобразования M в R дайте короткую адаптивную оранжевую (OG590 краевой фильтр) вспышку.
  2. Дайте короткую вспышку света (<1 мс) длины волны между 350-700 нм и измерьте максимальную отрицательную или положительную амплитуду отклика ERC, которая отражает поглощение M / R на этой конкретной длине волны.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для синхронной активации большого пула молекул фотопигмента требуется короткая, интенсивная вспышка света для упаковки содержимого фотонов за короткий промежуток времени. Максимальное преобразование фотопигмента из R в M синей вспышкой может достигать ~80% от общего количества молекул фотопигмента из-за перекрытия в спектре поглощения R и M (рисунок 3A). Поэтому на длинах волн ниже ~ 550 нм ERC имеет два компонента: отрицательную фазу, которая отражает реакцию метарходопсина, и положительную фазу, которая отражает реакцию оставшегося родопсина. ERC линейно зависит от интенсивности света (рисунок 5D). Соответственно, чтобы получить спектральную чувствительность R и M состояний, каждая фаза ERC должна быть нормализована на различных длинах волн для равной энергии29.
  3. Повторите шаги 2.1.-2.2. использование вспышек различной длины волны.
  4. Построение нормализованного положительного и отрицательного ERC в зависимости от длины волны.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сильная вспышка света индуцирует массивный ток через светочувствительные каналы, что приводит к метаболической нагрузке на фоторецептор, что, в свою очередь, вызывает открытие светонезависимого канала. ERC накладывается на этот конститутивный ток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Рисунок 2 иллюстрирует надежность и простоту использования метода ERG. Он надежен, потому что он записывается в практически неповрежденной мухе с помощью простой техники внеклеточной записи напряжения, которая требует простой электрофизиологической установки. Надежность проявляется получением записей световых откликов с относительно большими амплитудами (в милливольтовом диапазоне) даже тогда, когда мутации сильно уменьшают или искажают световой отклик. Поэтому даже неопытный экспериментатор...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Основным преимуществом использования препарата фоторецептор Drosophila является его доступность, легкость и точность световой стимуляции, и, самое главное, способность применять силу молекулярной генетики7. Обширные генетические исследования установили дрозофилу как чрезвычайно полезную модельную систему для генетического вскрытия сложных биологических процессов7. Относительно простая структура генома дрозофилы (состоящая только из четырех хромосо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантами Израильского научного фонда (ISF) и Американо-израильского двустороннего научного фонда (BSF). Благодарим Анатолия Шапочникова за конструкцию воскового нагревателя нити.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 мл шприц с удлиненным наконечникомРисунок 6M
1 грубый пинцетDumont #5, стандартный0,1 мм x 0,06 мм, длина 110 мм, Inox (Рисунок 6H)
2 конденсорные линзы
Аналого-цифровой преобразовательMolecular DeviceDigidata 1200Возможная замена: любой digidata от молекулярных приборов (например 1440A) -Рисунок 7C
УсилительПочти идеальная электроникаВозможная замена: Warner instruments- IE251A или IE-210 (поставляется с головным устройством)- Рисунок 7D
Антивибрационный столNewportVW-3036-OPT-01Рисунок 7H
КапиллярыГарвардский аппаратКапилляры из боросиликатного стекла1 мм x 0,58 мм (Рисунок 6O)
Clampexобеспечениемолекулярного устройства
2
Источник холодного светаSchottKL1500 LC>DРисунок 6C
Деликатные стеклоочистителиKimtechKimwipes (Рисунок 6K)
ДержательПодходит для капиллярного наружного диаметра 1 мм (Рисунок 6N, Рисунок 7N и Рисунок 7P)
Клетка ФарадеяСамодельныйэлектромагнитный шумозащитный экран и черная передняя шторка (Рисунок 7K)
Фильтр (цвет)SchottOG590, фильтр по краямРисунок 7S
Фильтр (цвет)SchottBP450/40 нмРисунок 7S
Фильтр (цвет)Блейзеры550 нмРисунок 7S
Фильтр (цвет) для холодного источника светаSchottRG630Рисунок 6C
Фильтр (тепло)SchottKG3Рисунок 7S
Фильтры (нейтральные фильтр плотности)Chroma6,5,4,3,2,1,0.5,0.3Рисунок 7S
Система ламп вспышкиHoneywellРисунок 7U
Система спального места с инжекторомInject + maticРисунок 6A-B
Источник питания лампыPTILPS-220Рисунок 7W
Детектор светаСамодельныйфототранзистор (Рисунок 7O)
СветоводДиаметр 3 мм, длина 1,3 м (Рисунок 7L,M)
ИсточникБезозоновая лампа высокого давления 75 Вт Ксеноновая (работает на 50 Вт), возможная замена: Cairn research- OptoLED (Рисунок 7R)
Низкотемпературный плавильный воскДомашнее производствоСостоит из смеси пчелиного воска (Tm≈ 62 ° C) и парафин в соотношении ~3:1 для достижения температуры плавления ~55– 56 ° C (Рисунок 6J)
Магнитный стенд для мухСамодельныйРисунок 6I и Рисунок 7Q
Система предусилителя микроэлектродов с головной сценойПочти идеальная электроникаТестер импеданса (Рисунок 7G)
Микроманипулятор (механический грубый)Tritech Research, NarishigeM-2
Микроманипулятор (механический тонкий)Leitz MicrosystemsLeitz Механический микроманипуляторРисунок 7F
pCLAMPМолекулярное устройствоПрограммное обеспечение
Петри60 мм
Генератор импульсовAMPIMaster 8Рисунок 7A
Крем Redux для электрокардиографииParkerLaboratories Redux Electrolyte Crè me
Отвертка затвораUniblitz, Vincent AssociatesVCM-D1 Одноканальная унистабильнаяРисунок 7V
Система затворовUniblitz, Vincent AssociatesLS2 2 мм Унистабильные ставниРисунок 7V
Серебряная проволокаWarner Instruments0.25– Диаметр 1 мм, необходимо хлорировать
Паяльник состоит из платино-иридиевой нитидиаметром 0,25 мм (Рисунок 6F)
Стереоскопический зум-микроскопNikonSMZ-2BРисунок 6D
Стереоскопический зум-микроскопWildWild M5С 6, 12, 25 и 50 настройками увеличения (Рисунок 7E)
Шприцевые фильтрыMillex22 &; m Фильтр PVDF
Вертикальный съемник для дозатораSutter/ NarishigeМодель P-97/PP-830Используйте вертикальный или горизонтальный съемник, по желанию (Рисунок 6L)
Нагреватель восковой нитидомашнего изготовленияСмотрите рисунок S1 (Рисунок 6E-G)
Ксеноновая система вспышек. Rapp OptoElectronicJML-C2Рисунок 7X
Программное CO электрода света Чашка Dr

Ссылки

  1. Vogt, K., Kirschfeld, K. Chemical identity of the chromophores of fly visual pigment. Naturwissenschaften. 77, 211-213 (1984).
  2. Hillman, P., Hochstein, S., Minke, B. Transduction in invertebrate photoreceptors: role of pigment bistability. Physiological Reviews. 63 (2), 668(1983).
  3. Hamdorf, K. Handbook of Sensory Physiology. Comparative Physiology and Evolution of Vision in Invertebrates. Autrum, H. 7, Springer-Verlag. 145-224 (1979).
  4. Gagné, S., Roebroek, J. G., Stavenga, D. G. Enigma of early receptor potential in fly eyes. Vision Research. 29 (12), 1663-1670 (1989).
  5. Pak, W. L., Shino, S., Leung, H. T. PDA (prolonged depolarizing afterpotential)-defective mutants: the story of nina's and ina's--pinta and santa maria, too. Journal of Neurogenetics. 26 (2), 216-237 (2012).
  6. Wang, X., Wang, T., Jiao, Y., von, L. J., Montell, C. Requirement for an enzymatic visual cycle in Drosophila. Current Biology. 20 (2), 93-102 (2010).
  7. Pak, W. L. Drosophila in vision research. The Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (12), 2340-2357 (1995).
  8. Pak, W. L. Neurogenetics, Genetic Approaches to the Nervous System. Breakfield, X. , Elsevier, North-Holland. 67-99 (1979).
  9. Minke, B. Light-induced reduction in excitation efficiency in the trp mutant of Drosophila. The Journal of General Physiology. 79, 361-385 (1982).
  10. Minke, B., Kirschfeld, K. Fast electrical potentials arising from activation of metarhodopsin in the fly. The Journal of General Physiology. 75 (4), 381-402 (1980).
  11. Stephenson, R. S., Pak, W. L. Heterogenic components of a fast electrical potential in Drosophila compound eye and their relation to visual pigment photoconversion. The Journal of General Physiology. 75 (4), 353-379 (1980).
  12. Agam, K., et al. Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (15), 5748-5755 (2000).
  13. Hardie, R. C., Minke, B. The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors. Neuron. 8, 643-651 (1992).
  14. Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL. Cell. 85 (5), 651-659 (1996).
  15. Phillips, A. M., Bull, A., Kelly, L. E. Identification of a Drosophila gene encoding a calmodulin-binding protein with homology to the trp phototransduction gene. Neuron. 8, 631-642 (1992).
  16. Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. Isolation of light-induced response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila. Journal of Comparative Physiology. 98, 345-355 (1975).
  17. Selinger, Z., Doza, Y. N., Minke, B. Mechanisms and genetics of photoreceptors desensitization in Drosophila flies. Biochimica et Biophysica Acta. 1179, 283-299 (1993).
  18. Minke, B. The history of the prolonged depolarizing afterpotential (PDA) and its role in genetic dissection of Drosophila phototransduction. Journal of Neurogenetics. 26 (2), 106-117 (2012).
  19. Satoh, A. K., et al. Arrestin translocation is stoichiometric to rhodopsin isomerization and accelerated by phototransduction in Drosophila photoreceptors. Neuron. 67 (6), 997-1008 (2010).
  20. Byk, T., Bar Yaacov, M., Doza, Y. N., Minke, B., Selinger, Z. Regulatory arrestin cycle secures the fidelity and maintenance of the fly photoreceptor cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 1907-1911 (1993).
  21. Dolph, P. J., et al. Arrestin function in inactivation of G protein-coupled receptor rhodopsin in vivo. Science. 260, 1910-1916 (1993).
  22. Belusic, G., Pirih, P., Stavenga, D. G. Photoreceptor responses of fruitflies with normal and reduced arrestin content studied by simultaneous measurements of visual pigment fluorescence and ERG. Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 196 (1), 23-35 (2010).
  23. Stavenga, D. G., Hardie, R. C. Metarhodopsin control by arrestin, light-filtering screening pigments, and visual pigment turnover in invertebrate microvillar photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 197 (3), 227-241 (2011).
  24. Stark, W. S., Zitzmann, W. G. Isolation of adaptation mechanisms and photopigment spectra by vitamin A deprivation. Journal of Comparative Physiology. 105, 15-27 (1976).
  25. Minke, B., Kirschfeld, K. The contribution of a sensitizing pigment to the photosensitivity spectra of fly rhodopsin and metarhodopsin. The Journal of General Physiology. 73, 517-540 (1979).
  26. Cone, R. A., Cobbs, W. H. Rhodopsin cycle in the living eye of the rat. Nature. 221 (5183), 820-822 (1969).
  27. Murakami, M., Pak, W. L. Intracellularly recorded early receptor potential of the vertebrate photoreceptors. Vision Research. 10 (10), 965-975 (1970).
  28. Hodgkin, A. L., Obryan, P. M. Internal recording of the early receptor potential in turtle cones. The Journal of Physiology. 267 (3), 737-766 (1977).
  29. Yasin, B., et al. Ectopic expression of mouse melanopsin in Drosophila photoreceptors reveals fast response kinetics and persistent dark excitation. Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3624-3636 (2017).
  30. Hardie, R. C. Photolysis of caged Ca 2+ facilitates and inactivates but does not directly excite light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 15, 889-902 (1995).
  31. Hardie, R. C. Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing Papers of a Biological Character. Royal Society (Great Britain). 245, 203-210 (1991).
  32. Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. A Drosophila mutant defective in extracellular calcium-dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization. Nature. 354, 230-232 (1991).
  33. Pak, W. L., Lidington, K. J. Fast electrical potential from a long-lived, long-wavelength photoproduct of fly visual pigment. The Journal of General Physiology. 63 (6), 740-756 (1974).
  34. Katz, B., Gutorov, R., Rhodes-Mordov, E., Hardie, R. C., Minke, B. Electrophysiological method for whole-cell voltage clamp recordings from drosophila photoreceptors. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (124), e55627(2017).
  35. Selinger, Z., Minke, B. Inositol lipid cascade of vision studied in mutant flies. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 53, 333-341 (1988).
  36. Minke, B., Kirschfeld, K. Microspectrophotometric evidence for two photoconvertible states of visual pigments in the barnacle lateral eye. The Journal of General Physiology. 71, 37-45 (1978).
  37. Ranganathan, R., Harris, W. A., Zuker, C. S. The molecular genetics of invertebrate phototransduction. Trends in Neurosciences. 14, 486-493 (1991).
  38. Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2. The Journal of Physiology. 524, 179-194 (2000).
  39. Dimitracos, S. A., Tsacopoulos, M. The recovery from a transient inhibition of the oxidative metabolism of the photoreceptors of the drone (Apis mellifera). Journal of Experimental Biology. 119, 165-181 (1985).
  40. Agam, K., Frechter, S., Minke, B. Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca 2+ and protein dephosphorylation. Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

whole cell
Электрофизиологические методы измерения уровня фотопигмента в фоторецепторах дрозофилы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.