Методическая статья

Амплификация кишечной палочки в микрофлюидном чипе непрерывной ПЦР и ее детектирование с помощью системы капиллярного электрофореза

DOI:

10.3791/63523

⸱

21 ноября 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shanghai Key Lab of Modern Optical System, University of Shanghai for Science and Technology, 2Graduate School of Engineering, Osaka University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе описывается, как построить систему непрерывной полимеразной цепи на основе микрофлюидного чипа и как построить систему капиллярного электрофореза в лаборатории. В ней представлен простой метод анализа нуклеиновых кислот в лабораторных условиях.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это традиционный метод, используемый для амплификации гена-мишени, который играет важную роль в биомолекулярной диагностике. Тем не менее, традиционная ПЦР занимает очень много времени из-за эффективности низкотемпературных вариаций. В данной работе предложена система непрерывной ПЦР (МФ-ПЦР) на основе микрофлюидного чипа. Время амплификации можно значительно сократить, запустив раствор ПЦР в микроканал, размещенный на нагревателях, настроенных на различные температуры. Более того, поскольку капиллярный электрофорез (КЭ) является идеальным способом дифференциации положительных и ложноположительных продуктов ПЦР, была создана система КЭ для достижения эффективного разделения фрагментов ДНК. В данной работе описан процесс амплификации Escherichia coli (E. coli) собственной системой CF-PCR и детектирования продуктов ПЦР с помощью КЭ. Результаты показывают, что ген-мишень E. coli был успешно амплифицирован в течение 10 минут, что указывает на то, что эти две системы могут быть использованы для быстрой амплификации и обнаружения нуклеиновых кислот.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это метод молекулярной биологии, используемый для амплификации определенных фрагментов ДНК, тем самым амплифицируя следовые количества ДНК в сотни миллионов раз. Он широко используется в клинической диагностике, медицинских исследованиях, безопасности пищевых продуктов, судебно-медицинской идентификации и других областях. Процесс ПЦР в основном состоит из трех этапов: денатурация при 90-95 °C, отжиг при 50-60 °C и растяжение при 72-77 °C. Термоциклирование является важной частью процесса ПЦР; однако традиционный ПЦР-амплификатор не только громоздкий, но и неэффективный, ему требуется около 40 минут для завершения 25 циклов. Для преодоления этих ограничений была создана собственная система непрерывной ПЦР (CF-PCR) на основе микрофлюидного чипа. CF-PCR может значительно сэкономить время, загоняя раствор ПЦР в микроканалы, размещенные на нагревателях при различных температурах 1,2,3,4,5.

Поскольку капиллярный электрофорез (КЭ) имеет много преимуществ, таких как высокое разрешение, высокая скорость и отличная воспроизводимость 6,7,8,9,10,11, он стал популярным инструментом в лаборатории для анализа нуклеиновых кислот и белков. Однако большинство лабораторий, особенно в развивающихся странах, не могут позволить себе эту технологию из-за высокой цены прибора CE. В этой статье мы описали протоколы изготовления микрофлюидного чипа CF-PCR и создания универсальной системы CE в лаборатории. Мы также демонстрируем процесс амплификации E. coli с помощью этой системы CF-PCR и обнаружения продуктов ПЦР с помощью системы CE. Следуя процедурам, описанным в этом протоколе, пользователи должны иметь возможность изготавливать микрофлюидные чипы, готовить растворы для ПЦР, создавать систему CF-PCR для амплификации нуклеиновых кислот и настраивать простую систему CE даже с ограниченными ресурсами для разделения фрагментов ДНК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации, относящейся ко всем материалам, реагентам и оборудованию, используемым в этом протоколе.

1. Изготовление микрофлюидного чипа CF-PCR

  1. Нагрейте кремниевую пластину до 200 °C в течение 25 минут, чтобы удалить влагу.
  2. Дозируйте 1 мл фоторезиста SU-8-2075 на дюйм пластины. Отжим его на кремниевой пластине с помощью машины для нанесения отжима при 500 об/мин в течение 5-10 с ускорением 100 об/мин, а затем при 2 000 об/мин в течение 30 с ускорением 500 об/с.
  3. Выпекайте кремниевую пластину при температуре 65 °C в течение 3 минут, затем при температуре 95 °C в течение 15 минут.
  4. Установите 150 - 215 мДж/см² в качестве энергии экспозиции для фотолитографического аппарата и выгравируйте разработанный рисунок на фоторезисте с помощью фотолитографической маски. Поместите кремниевую пластину и маску, готовые к экспонированию.
  5. После выдержки выпекайте кремниевую пластину при температуре 65 °C в течение 2 минут, а затем при температуре 95 °C в течение 7 минут.
  6. Погрузите кремниевую пластину в раствор проявителя, чтобы удалить излишки фоторезиста, и выньте его, когда микроканалы станут видны (рис. 1). Используйте изопропанол, чтобы смыть остатки раствора проявителя.
  7. Смешайте преполимер полидиметилсилоксана (ПДМС) и отвердитель в соотношении 10:1. Вылейте смешанный раствор PDMS в реплику формы и затвердейте при 80 °C в течение 60 минут.
  8. Приклейте микрофлюидный чип PDMS к предметному стеклу после активации с помощью плазменного очистителя и как можно скорее затвердейте при 80 °C в течение 30 минут (рис. 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Внешние размеры чипа составляют 80,0 мм × 30,0 мм × 0,4 мм. В микрофлюидном чипе имеется 40 змеевидных каналов (100 мкм × 1,46 мм × 100 мкм, ширина × длина × глубина).

2. Приготовление ПЦР-раствора

  1. Полностью разморозьте реагенты перед конфигурацией. Используйте вихревой смеситель и центрифугу, чтобы убедиться, что реагенты хорошо перемешаны.
  2. Подготовьте центрифужную пробирку, добавив следующие компоненты в следующем порядке: 33,75 мкл воды, 1,0 мкл матрицы ДНК, 0,5 мкл праймера, 5,0 мкл буфера, 4,0 мкл смеси dNTP, 1,5 мкл Tween 20, 3,5 мкл PVP и, наконец, 0,25 мкл ДНК-полимеразы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь используется матрица ДНК E. coli. Праймеры для E. coli и компоненты ПЦР-раствора перечислены в таблице 1 и таблице 2 соответственно.
  3. Перемешайте раствор путем вихряния.

3. Построение системы CF-PCR

  1. Подготовьте два керамических нагревателя с положительным температурным коэффициентом (PTC), два твердотельных реле, два ПИД-регулятора температуры, два датчика температуры и шнур питания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер керамических нагревателей PTC зависит от размера микрофлюидной стружки; длина должна быть больше, чем длина стружки - длина-ширина-высота используемых здесь керамических нагревателей PTC составляет 10 см x 2 см x 0,4 см.
  2. Подключите нагреватель к твердотельному реле.
  3. Подключите твердотельное реле к ПИД-регулятору температуры.
  4. Прикрепите датчик датчика температуры к нижней части двух нагревателей и подсоедините клемму к ПИД-регулятору температуры.
  5. Соедините два твердотельных реле последовательно и подключите шнур питания.
  6. Напечатайте на 3D-принтере паз для двух нагревателей и держите нагреватели в одной плоскости (см. Дополнительный файл 1 для файлов STL, необходимых для 3D-печати).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте воздушный зазор 12 мм между двумя нагревателями.
  7. Поместите микрофлюидный чип на два нагревателя.
  8. Подготовьте шприцевой насос и шприц, закрепите шприц на шприцевом насосе, соедините силиконовую трубку (внутренний диаметр 0,8 мм [ID]) со шприцем и подсоедините стальную иглу (внутренний диаметр 0,7 мм) к верхней части силиконовой трубки (рисунок 3).
  9. Вставьте стальную иглу во входное отверстие микрофлюидной стружки.
  10. Поместите наконечник пипетки на выходе чипа для сбора продуктов ПЦР.

4. Построение системы CE

  1. Использовать высоковольтный источник питания для создания электрического поля импульсного поля; Обратите внимание на положительный и отрицательный электроды.
  2. Используйте ртутную лампу в качестве источника света и отфильтруйте длину волны возбуждения от ртутной лампы через фильтр.
  3. Поместите капилляр на предметный столик микроскопа.
  4. Соберите флуоресцентное излучение с помощью объектива, а затем зафиксируйте его с помощью фотоумножителя R928 (ФЭУ). Наблюдайте за микроскопом и капилляром. Включайте свет в условиях темного помещения; Возбуждающий свет собирается объективом.
  5. Используйте программное обеспечение LABVIEW собственной разработки для управления источником питания и завершения сбора данных (описано в шагах 6.3-6.6). Смотрите https://github.com/starliyan/labview/blob/main/CZE20170723.vi.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты проводились в темной комнате, а схема системы CE показана на рисунке 4.

5. Запустите ПЦР-раствор

  1. Предварительно установите температуру нагревателей системы CF-PCR на уровне 65 °C и 95 °C.
  2. Поместите микрофлюидный чип на два нагревательных блока.
  3. Вставьте кончик силиконовой пробирки в центрифужную пробирку, содержащую 50 мкл раствора ПЦР (с шага 2.3). Потяните за поршень шприца, чтобы медленно извлечь раствор. Зафиксируйте шприц на шприцевом насосе. Вставьте стальную иглу во входное отверстие микрофлюидной стружки.
  4. Установите расход насоса на 10 мкл/мин и нажмите кнопку запуска , чтобы протолкнуть раствор в микроканале на входе микрочипа.
  5. Соберите продукты ПЦР на выходе из микрофлюидного чипа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Промойте канал сверхчистой водой до и после ПЦР для удаления примесей.

6. Обнаружение продуктов ПЦР с помощью собственной системы CE

  1. Подготовьте капилляр общей длиной 8 см и эффективной длиной 6 см.
  2. Приготовьте разделительный буфер, смешав 100 мкл 1% гидроксиэтилцеллюлозы (HEC, w/v), 2 мкл 100x SYBR Green I и 98 мкл сверхчистой воды для получения 0,5% HEC (w/v), содержащего 1x SYBR Green I.
  3. Заполните капилляр подготовленным буфером сепарации с помощью вакуумного насоса.
  4. Введите напряжение впрыска (800 В) и время впрыска (2,0 с) в программном интерфейсе, нажмите кнопку запуска и дождитесь электродинамического введения продуктов ПЦР в капилляр при 100 В/см (2,0 с).
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе продукты ПЦР помещаются на отрицательный электрод, а буфер помещается на положительный электрод.
  5. Введите напряжение постоянного тока (800 В) в программном интерфейсе, нажмите кнопку запуска и запустите электрофорез при напряженности электрического поля 100 В/см.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе как положительные, так и отрицательные электроды помещаются с буфером.
  6. Нажмите кнопку «стоп » после того, как все фрагменты ДНК будут разделены в капилляре.
  7. Промывайте капилляр стерилизованной водой в течение 1 мин после каждого запуска.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 5 представлена электроферограмма продуктов ПЦР и ДНК-маркеров. След (Рисунок 5А) – это результат КЭ амплифицированного продукта МФ-ПЦР, след (Рисунок 5В) – результат КЭ продукта, амплифицированного путем термоциклирования, а след (Рисунок 5С) – результат КЭ 100.н. лестницы ДНК. Сначала мы амплифицировали ген-мишень E. coli в системе CF-PCR; раствор ПЦР занимал ~10 мин, 30 с от входа ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

И ПЦР, и КЭ являются двумя популярными биотехнологиями в анализе нуклеиновых кислот. В данной статье описывается амплификация E. coli и выявление продуктов ПЦР с помощью систем CF-PCR и CE, разработанных собственными силами. Ген-мишень E. coli был успешно амплифицирован в течение 10 мин из-за высокой скорости теплопередачи. Фрагменты ДНК размером менее 1500.н. были разделены в течение 8 минут (рис. 5). Большим преимуществом этих двух методов является то, что они могут значи...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявлять.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Работа выполнена при поддержке Комиссии по науке и технологиям муниципалитета Шанхая, Китай (No 19ZR1477500 и No 18441900400). Выражаем благодарность за финансовую поддержку со стороны Шанхайского университета науки и технологий (No2017KJFZ049).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
100.о. ДНК-лестницаTakara Bio Inc.3422A
10x Быстрый буфер ITakara Bio Inc.RR070A
10x TBEBeijing Solarbio Science & Технология Ко., Лтд.Проявитель T1051
Alfa Aesar, СШАL15459
смесь dNTP (2,5 μ M)Takara Bio Inc.RR070A
EC-FSangon Biotech, Шанхай, Китай
EC-RSangon Biotech, Шанхай, Китай
HEC, 1300KSigma-Aldrich, США9004-62-0
изопропанолАладдин, Шанхай, Китай67-63-0
микроскопOlympus, ЯпонияBX51
фотолитография НБСП;SUSS MicroTec, ГерманияMJB4
Hamamatsu Photonics, ЯпонияR928
фоторезистMicroChem, СШАSU-8 2075
ПИД-регуляторы температуры Шанхай, Китай ПлазменныйXH-W2023
 Harrick PlasmaPDC-32G-2
поливинилпирролидон (PVP)Аладдин, Шанхай, КитайP110608
насосHarvard ApparatusPHD2000
силиконовых трубок BIO-RAD,США7318210
твердотельные релеKZLTD, КитайKS1-25LA
SpeedSTAR HS ДНК Полимераза Такара Био Инк.RR070A
стальная иглаzhongxinqiheng,Сучжоу,Китай
SYBR ЗЕЛЕНЫЙ figure-materials-1Solarbio, Пекин, Китайдатчики температуры SY1020
EasyShining Technology, Чэнду, КитайTCM-M207
Шаблон (E. coli)Takara Bio Inc.AK601
Tween 20Аладдин, Шанхай, КитайT104863
напряжение электропитания Медина, штат Нью-Йорк, СШАTREK МОДЕЛЬ 610E
Фотоумножитель очиститель

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, Z., et al. All-in-one microfluidic device for on-site diagnosis of pathogens based on an integrated continuous flow PCR and electrophoresis biochip. Lab on a Chip. 19 (16), 2663-2668 (2019).
  2. Crews, N., Wittwer, C., Gale, B. Continuous-flow thermal gradient PCR. Biomedical Microdevices. 10 (2), 187-195 (2008).
  3. Li, Z., et al. Design and fabrication of portable continuous flow PCR microfluidic chip for DNA replication. Biomedical Microdevices. 22 (1), 5(2019).
  4. Kim, J. A., et al. Fabrication and characterization of a PDMS-glass hybrid continuous-flow PCR chip. Biochemical Engineering Journal. 29 (1-2), 91-97 (2006).
  5. Shen, K., Chen, X., Guo, M., Cheng, J. A microchip-based PCR device using flexible printed circuit technology. Sensors and Actuators B: Chemical. 105 (2), 251-258 (2005).
  6. Harstad, R. K., Johnson, A. C., Weisenberger, M. M., Bowser, M. T. Capillary Electrophoresis. Analytical Chemistry. 88 (1), 299-319 (2016).
  7. Redman, E. A., Mellors, J. S., Starkey, J. A., Ramsey, J. M. Characterization of intact antibody drug conjugate variants using microfluidic capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (4), 2220-2226 (2016).
  8. Britz-Mckibbin, P., Kranack, A. R., Paprica, A., Chen, D. D. Quantitative assay for epinephrine in dental anesthetic solutions by capillary electrophoresis. Analyst. 123 (7), 1461-1463 (1998).
  9. Maeda, H., et al. Quantitative real-time PCR using TaqMan and SYBR Green for Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, tetQgene and total bacteria. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 39 (1), 81-86 (2003).
  10. Hajba, L., Guttman, A. Recent advances in column coatings for capillary electrophoresis of proteins. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 38-44 (2017).
  11. Kleparnik, K. Recent advances in combination of capillary electrophoresis with mass spectrometry: methodology and theory. Electrophoresis. 36 (1), 159-178 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Escherichia coli

Похожие статьи