Методическая статья

Внутрижелудочковая доставка лекарств и забор образцов для исследования фармакокинетики и фармакодинамики

2.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63540

⸱

31 марта 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry & Pharmacology, School of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, The University of Melbourne, 2Department of Microbiology, Biomedicine Discovery Institute, Monash University, 3UNC Eshelman School of Pharmacy, University of North Carolina, Chapel Hill

В этой статье

Краткое содержание

Доставка терапевтических препаратов непосредственно в центральную нервную систему является одним из способов обхода гематоэнцефалического барьера. В настоящем протоколе показана внутримозговая инъекция для последующего забора спинномозговой жидкости и органов тела. Это облегчает исследование фармакокинетики и фармакодинамики лекарственных средств на животных моделях для разработки новых методов лечения.

Аннотация

Несмотря на то, что гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) защищает мозг от инородных включений, он также предотвращает проникновение некоторых терапевтических средств в центральную нервную систему (ЦНС) для облегчения заболеваний или инфекций. Препараты вводятся непосредственно в ЦНС у животных и человека для обхода ГЭБ. Настоящий протокол описывает уникальный способ лечения инфекций головного мозга путем внутрижелудочковой доставки антибиотиков, т.е. полимиксинов, антибиотиков последней линии для лечения грамотрицательных бактерий с множественной лекарственной устойчивостью. Был разработан простой протокол стереотаксической хирургии для имплантации направляющей канюли, идущей в боковой желудочек у крыс. После восстановительного периода в течение 24 часов крысам можно сознательно и многократно вводить инъекции через канюлю, которая устанавливается на поводыре. Инъекции могут быть введены вручную в виде болюса или инфузии с помощью микроинжекционного насоса для получения медленной и контролируемой скорости потока. Внутрижелудочковая инъекция была успешно подтверждена с помощью красителя Evans Blue. Спинномозговая жидкость (ликвор) может быть дренирована, а мозг и другие органы могут быть собраны. Этот подход хорошо поддается исследованиям с доставкой лекарственного препарата в ЦНС и последующей оценкой фармакокинетической и фармакодинамической активности.

Введение

Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) является важнейшим защитным механизмом для центральной нервной системы (ЦНС). Селективно-проницаемый анатомический барьер отделяет циркулирующую кровь и ее растворенные вещества от внеклеточной жидкости мозга, тем самым предотвращая попадание большинства молекул в мозг 1,2,3,4, в зависимости от их размера, липофильности5 и наличия активного транспортного механизма 2.

Этот защитный барьер полезен для эффективной регуляции сложного гомеостаза мозга и здоровья ЦНС 4,6. Однако это также затрудняет доставку лекарств для лечения инфекций головного мозга или других заболеваний ЦНС 4,7. Помимо разрушения ГЭБ с помощью различных методов 8,9, основным подходом к обходу ГЭБ является доставка лекарственного препарата непосредственно в мозг путем высвобождения его в спинномозговую жидкость (СМЖ)4. Несмотря на то, что это относительно инвазивная практика, она успешно используется для доставки таргетной терапии пациентам и лабораторным животным. У людей лекарственные препараты могут быть введены во внутрижелудочковую систему или ликвор и впоследствии отобраны с использованием резервуара Ommaya, резервуара, расположенного под кожей головы, прикрепленного к катетеру, вставленному в боковой желудочек10,11. Аналогичные методы были установлены на лабораторных животных, таких как грызуны, для достижения эквивалентных целей. Мышам 12,13,14,15 и крысам16,17 имплантировали микроосмотические насосы для непрерывной доставки лекарств в желудочковую систему или паренхиму мозга. Кроме того, проводили прямые внутримозговые инъекции мышам под наркозом с использованием одноразовой иглы18,19 и находящимся в сознании крысам с помощью хирургически имплантированной канюли 20,21,22,23. Доставка лекарств в ЦНС является бесценным методом для улучшения понимания в различных областях 20,24,25,26,27,28.

Инфекции ЦНС являются одной из таких областей, которая срочно нуждается в новых методах лечения и более глубоком понимании существующих противоинфекционных методов лечения. Инфекции ЦНС, вызванные грамотрицательными бактериями с множественной лекарственной устойчивостью, вызывают особую обеспокоенность7. Полимиксины являются антибиотиками последней линии, которые все чаще используются для лечения инфекций, вызванных этими «супербактериями». При внутривенном введении полимиксинов в соответствии с действующими рекомендациями по дозировке30 их проникновение в ЦНС очень низкое, в то время как более высокие дозы увеличивают риск нефротоксичности. Таким образом, внутривенная терапия полимиксинами малоэффективна для лечения инфекций ЦНС7. Установление безопасного и эффективного режима дозирования для доставки полимиксинов в ЦНС является неотложной неудовлетворенной медицинской потребностью 31,32,33. Таким образом, настоящий протокол был разработан и описан с акцентом на введение антибиотиков непосредственно в спинномозговую жидкость крыс. Тем не менее, его можно использовать для введения любого лекарственного средства, которое не является нейротоксичным и где терапевтические концентрации могут вводиться в небольших объемах (например, до 10 мкл у крыс). Описанные методы также могут быть модифицированы для воздействия на различные области мозга и доставки нескольких инъекций.

Настоящий протокол представляет собой простую хирургическую и инъекционную технику, которая обеспечивает эффективную фармакокинетику и распределение лекарств после введения ICV. Операция включает в себя имплантацию направляющей канюли. Поскольку это менее инвазивная процедура, чем имплантация микроосмотической помпы 12,13,14,15,16,17, это усовершенствованный вариант, подходящий для кратковременного введения лекарственных препаратов в спинномозговую жидкость. Этот протокол упрощен и может обеспечить очень высокие показатели выживаемости и стабильную массу тела через 24 часа после операции, что является улучшением по сравнению ссуществующими методами. После операции крысы в сознании получали либо ручную болюсную инъекцию ICV, либо более медленную доставку с использованием микронасоса для снижения пиковых концентраций в плазме. При этом они могли свободно передвигаться в своей клетке. Для установления безопасных и эффективных режимов дозирования лекарственных препаратов образцы ликвора, головного мозга, спинного мозга, почек, плазмы и т.д. были затем использованы для изучения фармакокинетики и распределения лекарственных средств после введения интрацеребровентрикулярного (ICV). Распределение лекарственных препаратов также может быть исследовано визуально, например, с помощью иммуногистохимии или матричной лазерной десорбции/ионизационной масс-спектрометрической визуализации (MALDI-MSI). При необходимости может быть имплантирована двусторонняя канюля, например, для введения лекарственных препаратов, которые в противном случае распространялись бы в одностороннем порядке в обоих полушариях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с Австралийским кодексом по уходу за животными и их использованию в научных целях. Эксперименты были одобрены комитетом по этике Мельбурнского университета (заявка #1914890). Для экспериментов использовались самцы и самки крыс Спрэг-Доули в возрасте 8-14 недель.

1. Стереотаксическая хирургия канюляции бокового желудочка

  1. Во время операции используйте хлопчатобумажные наконечники и хирургические простыни.
  2. Подготовьте следующие условия для проведения операции.
    1. Установите стереотаксическую рамку, систему доставки анестезии, лекарства, химикаты и вспомогательные материалы (см. Таблицу материалов). Очистите стереотаксическую раму, волоконно-оптический источник света, ручную дрель и т. д. 80% этанолом.
    2. Для стерилизации замочите направляющую канюлю 22 G и связанную с ней пустышку канюлю (см. Таблицу материалов) в 80% этаноле.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Производитель предварительно вырезал направляющую 22 G и фиктивную канюлю до длины ~4 мм ниже пьедестала.
    3. Простерилизуйте хирургические инструменты (см. Таблицу материалов) с помощью термостерилизатора в течение 20 с, а затем распылите 80% этанола. Поместите стерилизованные инструменты на стерильную простыню.
    4. Подготовьте ящик для восстановления (ящик для содержания крыс, выстланный пеленкой), половина которого должна быть размещена над грелкой.
  3. Проведите операцию.
    1. Вкрутите очищенную этанолом направляющую канюлю 22 G в держатель канюли на стереотаксической раме.
    2. Поместите крысу в индукционную камеру (300 мм x 200 мм, см. Таблицу материалов) и введите анестезию 5% изофлураном в концентрации кислорода 1 л/мин.
    3. После того, как крыса будет глубоко обезболена (педальный рефлекс отсутствует), переместите крысу в стереотаксическую рамку и уменьшите количество изофлурана до 2%-3% за 1 л/мин кислорода для поддержания через носовой конус. Зацепите зубы за прикусочную планку и осторожно натяните носовой конус на нос - осторожно потяните крысу назад, чтобы убедиться, что она надежно закреплена.
    4. Нанесите защитную смазку для глаз на оба глаза, чтобы избежать пересыхания.
    5. Вводите карпрофен (5 мг/кг), бупренорфин (0,05 мг/кг) в физиологическом растворе и 3 мл физиологического раствора подкожно (в/к) для облегчения боли и восстановления после операции.
    6. Сожмите пальцы ног, чтобы проверить педальный рефлекс. Если отсутствует, зафиксируйте череп крысы в рамке. Поместите одну ушную планку в ушной канал и затяните. Повторите с другой стороны.
    7. Сдвиньте ушные накладки в сторону, чтобы убедиться, что цифры, указанные на ушных накладках, одинаковы с обеих сторон. Голова не должна двигаться при надавливании на череп.
    8. Выбрейте макушку с помощью машинки для стрижки. Сотрите волосы салфеткой и солевым раствором. При необходимости повторно нанесите смазку для глаз на оба глаза, чтобы избежать пересыхания.
    9. Промокните кожу головы 4% хлоргексидином и спиртовым раствором препарата для кожи, используя стерильные ватные тампоны для каждого шага (см. Таблицу материалов). Начните с центра черепа и двигайтесь по кругу наружу, пока вся поверхность не будет очищена.
    10. Введите ~150 мкл ропивакаина (1%) в.к. (см. Таблицу материалов) в предполагаемое место разреза.
    11. Лезвием скальпеля сделайте разрез 10-15 мм по средней линии головы, от промежутка глаз до основания черепа.
    12. Используйте ватные кончики и скальпель, чтобы соскоблить соединительную ткань и обнажить череп.
    13. Опустите стерильный ватный кончик в 3% раствор перекиси водорода и нанесите его на поверхность черепа. Подождите 5 с, чтобы химическое вещество вступило в реакцию с кожей, а затем очистите участок сухой ватной палочкой.
    14. Нанесите 3% перекись водорода во второй раз. Это сделает линии швов черепа более четкими. Подождите 10 с, чтобы химическое вещество вступило в реакцию с кожей, а затем очистите участок сухой ватной палочкой. Умойтесь солевым раствором и высушите чистым ватным наконечником.
    15. Аккуратно нанесите небольшое количество геля Super etch на ватный наконечник, а затем нанесите его на поверхность черепа. Это создает более пористую поверхность для прилипания стоматологического цемента.
    16. Нанесите обильное количество физраствора на череп, чтобы смыть супертравлку, и высушите его чистым ватным наконечником.
    17. Определите брегму и отметьте ее с помощью фломастера.
    18. Просверлите углубление для анкерного винта в месте, которое не будет препятствовать размещению направляющей канюли.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если правый боковой желудочек канюлирован, просверлить в левом полушарии и сзади относительно желудочка.
    19. Держите сверло под углом ~75°-80° к черепу и медленно просверлите углубление глубиной примерно в половину толщины черепа. Используйте солевой раствор на ватном наконечнике, чтобы стереть костную пыль.
    20. Осторожно вставьте винт, крепко удерживая его в углублении щипцами и вкручивая его в череп с помощью отвертки, избегая поломки черепа. После каждого полного оборота проверяйте, плотно ли сидит винт.
    21. Убедитесь, что череп плоский. С помощью подвижных рычагов рамы расположите направляющую канюлю так, чтобы она касалась черепа в точке брегмы. Обнулите DV (дорсально-вентральный), представляющий координаты плоскости Z, нажатием кнопки на мониторе управления кадром.
    22. Поднимите направляющую канюлю (22 G и 4 мм в длину) с помощью подвижных рычагов рамы и переместите ее в лямбду. Опустите его так, чтобы он касался поверхности черепа, и снова обратите внимание на дисплей DV.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разница между DV при брегме и DV при лямбде должна быть менее 0,2 мм. При необходимости отрегулируйте носовой конус соответствующим образом, т.е. перемещайте голову крысы вверх или вниз по мере необходимости, и повторите измерения.
    23. Переместите направляющую канюлю обратно в положение bregma и обнулите все три координаты: DV, AP (передне-заднюю) и ML (медиально-латеральную), нажимая кнопки на мониторе.
    24. Переместите направляющую канюлю в заранее установленные координаты по выбору.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для канюляции правого бокового желудочка у взрослой крысы массой 300-350 г использовали следующие координаты: -0,7 мм AP, -1,4 мм ML и -4,00 мм DV (такая же длина, как и направляющая канюля).
    25. Отметьте окончательное положение канюли, раскрасив конец канюли маркером, а затем опустите его вниз к поверхности черепа, чтобы коснуться и отметить положение.
    26. Просверлите отверстие диаметром 2,3 мм для направляющей канюли 22 G, удерживая вал сверла в прямом вертикальном положении, т. е. под углом 90° к черепу. Будьте осторожны, чтобы медленно и поступательно продвигаться вглубь черепа, т.е. избегайте сверления тканей мозга.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости опустите канюлю в отверстие с помощью мобильного стереотаксического манипулятора, чтобы проверить, можно ли успешно установить канюлю или требуется дополнительное сверление.
    27. После того, как канюля будет опущена в мозг, поднимите ее обратно вверх, осторожно нанесите суперклей на нижнюю часть пластиковой пьедестала канюли и опустите канюлю обратно в отверстие с помощью подвижного рычага стереотаксической рамы.
    28. Оставьте на месте, чтобы клей схватился.
    29. Во время ожидания смешайте стоматологический растворитель и порошок (см. Таблицу материалов) в лодке для взвешивания. Насыпьте порошок стоматологического цемента в лодку для взвешивания, с помощью шприца объемом 1 мл добавьте ~300 мкл растворителя и перемешайте с помощью того же шприца, пока он не загустеет и не станет пригодной для использования консистенцией. При необходимости добавьте больше порошка для повышения вязкости или больше растворителя для снижения вязкости.
    30. Освободите канюлю от держателя канюли с помощью специального винта и осторожно поднимите рычаг.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Канюля должна быть приклеена к черепу под углом 90°.
    31. Нанесите свежий стоматологический цемент на обнаженный череп, набрав его в одноразовый шприц объемом 1 мл и наложив вокруг канюли. Избегайте попадания стоматологического цемента на кожу или в отверстие канюли. Дайте ему застыть в течение нескольких секунд, в зависимости от его консистенции.
    32. Когда стоматологический цемент станет гуще, с помощью шпателя нанесите больше стоматологического цемента и сформируйте окончательное крепление головки, полностью покрывающее винт.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не закрывать слишком большую часть канюли, чтобы фиктивная канюля все еще могла быть прикручена. Удалите излишки зубного цемента с кожи.
    33. Вставьте стерильную пустышку канюли, когда стоматологический цемент высохнет и станет твердым.
    34. Выключите изофлуран, освободите ушные планки, извлеките крысу из рамы и поместите ее в реанимационный бокс.
    35. Как только животное выздоровеет ~15-30 минут, поместите его в чистый бокс.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После операции крысы должны содержаться в одном доме. Рассмотрите возможность замены стандартных решетчатых крышек клеток, где бункер для корма опускается в клетку, на специальные высоко поднятые решетчатые крышки, чтобы свести к минимуму риск вмешательства в крепление для головы. В качестве альтернативы заблокируйте все части клетки, которые находятся намного ниже высоты выращивания животного.
    36. Заполните контрольный список мониторинга и осуществляйте мониторинг в соответствии с рекомендациями по мониторингу, изложенными в протоколе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подумайте о том, чтобы положить несколько пищевых гранул на пол для более удобного доступа. Если это не мешает эксперименту, дополнительное обезболивание может быть обеспечено сладкой пищей вместо дополнительных послеоперационных инъекций, например, бупренорфином, смешанным со сладкой ореховой шоколадной пастой 35,36,37. В этом случае часть той же сладости была предоставлена в качестве вознаграждения до и после операции, чтобы избежать пищевой нефобии при облегчении боли. Ореховая паста может быть нанесена на ленту, прикрепленную к стенке клетки.
    37. Запаситесь большим количеством фиктивных канюль, чем направляющих канюль или инъекционных канюль, так как они могут затеряться среди подстилки клетки для животных, если они случайно оторвутся. В случае такого случая замените канюлю на новую, стерильную пустышку-пустышку.

2. Инъекции ICV

  1. Приготовьте лекарственное средство и носитель, например, 30 мг/мл полимиксина В (см. Таблицу материалов) в 0,9% стерильном физиологическом растворе. Поддерживайте объем инъекции в пределах 5-10 мкл у взрослых крыс с массой тела в пределах 300-400 г.
  2. Не позднее чем через 24 часа после операции взвесьте крысу и транспортируйте ее в процедурный кабинет.
  3. Рассчитайте объем инъекции, используя массу тела крысы.
  4. Снимите крышку клетки и открутите муляж канюли.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крысы обычно сидят неподвижно, когда осторожно держат их в клетке, и не нуждаются в сдерживании. Кухонное полотенце можно использовать для любопытной или нервной крысы или для щекотания скул.
  5. Для болюсной инъекции прикрепите трубку PE-50 (см. Таблицу материалов) длиной не менее 40 см к газонепроницаемому микрошприцу объемом 10 мкл, натянув один конец трубки на неподвижную или съемную иглу на шприце и обеспечив плотное прилегание. Прикрепите установленную канюлю инжектора к другому концу трубки.
    1. Наберите необходимую сумму через канюлю. Вставьте канюлю в направляющую до упора и введите ее. После того, как вся жидкость будет введена, удерживайте поршень шприца на месте еще как минимум минуту, чтобы избежать обратного потока.
  6. Для более медленной доставки вводите лекарства с помощью микроинъекционного насоса (см. Таблицу материалов).
    1. Сначала используйте фильтрованную воду и одноразовый шприц объемом 1 мл с иглой для забора 23 г, чтобы полностью заполнить трубку PE-50. Затем извлеките одноразовый шприц из иглы для забора и замените его микрошприцем.
    2. Оттяните 1-3 μл, чтобы получился небольшой, но заметный пузырь воздуха. Затем, наберите необходимое количество препаратов. При желании отметьте пузырьки воздуха маркером, чтобы улучшить видимость потока лекарств. Зафиксируйте шприц на помпе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в правильности настроек используемого препарата и оборудования, т.е. установите скорость доставки и внутренний диаметр используемого шприца в соответствии с инструкцией пользователя.
  7. После того, как вся жидкость будет введена, остановите насос, если он не остановится автоматически. Оставьте вставленную иглу еще как минимум на минуту, чтобы избежать обратного потока.
  8. Медленно снимите канюлю инжектора и прикрутите направляющую канюлю.
  9. Очистите оборудование, втягивая и выбрасывая этанол и деионизионную воду по три раза каждое.

3. Спинномозговая жидкость и забор образцов тканей

  1. Транспортируйте крысу в процедурный кабинет.
  2. Поместите крысу в индукционную камеру и вводите анестезию 5% изофлураном в дозе 2 л/мин кислорода до тех пор, пока дыхание не замедлится (~ 5 мин).
  3. Переместите крысу в стереотаксическую рамку и поддерживайте тот же уровень глубокой анестезии через носовой конус.
  4. Проверьте наличие педального рефлекса. Если отсутствует, зафиксируйте череп в раме с помощью ушных планок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть более простая стереотаксическая рамка без дисплея, закругленных ушных планок или подвижных кронштейнов. Это процедура, не требующая восстановления; Единственная необходимая функция – это любые штанги для ушей.
  5. Используя носовой конус, наклоните нос крысы вниз примерно на 45°, чтобы открыть шею в удобное рабочее положение.
  6. С помощью маленьких, тупых, изогнутых ножниц прощупайте череп и двигайтесь кзади к концу черепа. В этом положении разрежьте самый внешний мышечный слой прямо через среднюю линию шеи, примерно 2-3 см в длину. Аккуратно разрежьте все остальные мышечные слои.
    1. Используйте небольшой пружинный ретрактор, чтобы удерживать рану в открытом состоянии и обеспечивать хорошую видимость. Разрежьте до тех пор, пока не станет видна большая мембрана цистерны. Используйте ватный наконечник, чтобы аккуратно удалить остатки кожи.
  7. Если кровотечение возникло, используйте марлю для очистки и остановки кровотечения.
  8. При необходимости используйте небольшие полоски свернутой ткани и поместите ее вокруг цистерны, чтобы кровь не загрязнила спинномозговую жидкость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы подтвердить успех инъекции с использованием красителя, введите 2-3 мкл 1,1% красителя Evans Blue (см. Таблицу материалов) крысе, находящейся под наркозом, перед сбором ликвора с помощью встроенной канюли и одноразового шприца объемом 1 мл.
  9. Чтобы подготовить инструмент для экстракции ликвора, наполните шприц ~500 μл фильтрованной воды, прикрепите иглу для извлечения 23 г и натяните трубку на иглу. Прикрепите вытянутую стеклянную пипетку к другому концу трубки.
  10. Чтобы извлечь спинномозговую жидкость, медленно введите вытянутую пипетку в открытую большую цистерну.
    ПРИМЕЧАНИЕ: СМЖ будет медленно и пассивно поступать в пипетку и активно набираться с помощью шприца. Если краситель вводится внутри, спинномозговая жидкость будет окрашена в синий цвет (Рисунок 1).
  11. Добавьте ликвор в пробирку с маркировкой и сразу же положите ее на сухой лед. В этом случае спинномозговая жидкость может храниться при температуре -80 °C.
  12. Соберите любую другую интересующую ткань для анализа. Для плазмы соберите не менее 3 мл сердечной крови.
    1. Положите крысу под глубоким наркозом на спину и откройте грудную полость, чтобы обнажить сердце. Используйте кровоостанавливающее средство, чтобы зажать грудную клетку, и поместите его на горло животного, чтобы улучшить видимость. С помощью тканевых щипцов с крючками удерживайте правый желудочек и введите одноразовый шприц объемом 5 мл с иглой 18 G в левый желудочек параллельно перегородке. Медленно наберите кровь в шприц. После того, как было собрано 3-5 мл крови, извлеките иглу из сердца.
  13. Извлеките иглу из шприца и поместите ее в острую емкость. Перелейте кровь в гепаринизированные пробирки и вращайте при температуре 2,739 x g и 4 °C в течение 15 минут, прежде чем собрать надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 200 μL и заморозьте на сухом льду.
  14. Усыпьте крысу, удалив сердце ножницами. Отключите подачу изофлурана.
  15. Соберите любые другие органы брюшной полости, представляющие интерес, такие как почки или селезенка. Определите орган, удерживайте интересующий орган тканевыми щипцами с крючками, поднимите его и разрежьте любые крепления. Поместите орган в пробирку с этикеткой и заморозьте на сухом льду.
  16. Чтобы удалить мозг, обезглавьте животное острыми большими ножницами, разрезав у основания черепа. Снимите крепление для головы вручную. Разрежьте оставшуюся кожу, покрывающую череп.
  17. С помощью диссекторных ножниц разрежьте череп по средней линии от основания до лямбды, т. е. разрежьте надзатылочную кость пополам. С помощью гемостата возьмите половинку и отложите ее в сторону. Повторите с другой стороны, чтобы полностью обнажить мозжечок.
  18. Приступайте к разрезу по сагиттальному шву вверх до лобной кости. Используйте кровоостанавливающее средство, чтобы удалить каждую из теменных костей. При необходимости разрежьте лобную кость дальше и удалите больше кости, чтобы обнажить обонятельные луковицы.
  19. Держите голову вверх ногами и аккуратно подденьте мозг шпателем, отделив его от зрительного нерва и тройничного нерва, перерезав их шпателем. Соберите мозг в пробирку и заморозьте на сухом льду.
  20. Желудочки мозга будут окрашены в синий цвет, если краситель будет введен внутри. Используйте одноразовое лезвие, чтобы разрезать мозг в месте инъекции (Рисунок 2A, B) и ~1 см сзади (Рисунок 2C), чтобы исследовать распределение красителя в желудочках.
  21. Чтобы удалить спинной мозг, обнажите позвоночный столб, разрезав кожу по средней линии спинной поверхности крысы. Иссекайте позвоночный столб, сделав двусторонний разрез вокруг него и разрезав его поперечно на каудальном конце поясничного отдела спинного мозга.
  22. Разрежьте пластинку с двух сторон вдоль столба с помощью ножниц до тех пор, пока не обнажится весь спинной мозг. Поднимите спинной мозг с одного конца, например, рострального конца, и извлеките его, рассекая спинномозговые нервы в каудальном направлении до тех пор, пока все нервы не будут перерезаны. Соберите спинной мозг в трубку и заморозьте на сухом льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Взвесьте все пробирки до и после забора органов для анализа данных. При необходимости и целесообразности промывание желудочковой системы может быть произведено после сбора ликвора и до забора мозга для удаления остаточных лекарственных средств в желудочковых компартментах. С помощью шприца объемом 1 мл, наполненного физиологическим раствором, прикрепленного к трубке, и канюли инжектора вставьте его в направляющую канюлю. Введите 2-3 мл физиологического раствора. Солевой раствор должен выходить из отверстия в цистерне магна. Направляющие канюли, фиктивные канюли и винты можно использовать повторно, замочив их в ацетоне на 24 часа, а затем замочив и очистив их медицинским моющим средством и водой. После высыхания остаточный зубной цемент можно удалить с помощью тонких щипцов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Представленный хирургический протокол является весьма успешным: обученные хирурги достигают >99,8% выживаемости, а животные демонстрируют стабильную массу тела после операции в 1-й день по сравнению с их дооперационным весом в 0-й день (среднее ± SD 315,8 г ± 42,1 г в 0-й день и 314,1 г ± 43,0 г в 1-й день, рис. 3).

Перед сбором спинномозговой жидкости инъекция 1,1% красителя Evans Blue в имплантированную канюлю может помочь в качестве подтверждения того, что и...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Исследователи и клиницисты используют инъекции ICV для обхода защитного механизма ГЭБ и доставки лекарств непосредственно в ЦНС 12,18,19,21,24. Настоящая работа представляет собой полный протокол ICV для эффективной доставки лекарственных препаратов в ЦНС и экстракции ликвора для фармакокинетического анализа. В начале эксперим...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Авторы благодарят Центр биомедицинских наук о животных при Мельбурнском университете за предоставление и уход за животными. Это исследование было поддержано исследовательским грантом от Национального института аллергии и инфекционных заболеваний Национального института здравоохранения (R01 AI146241, GR и TV). JL является главным научным сотрудником Австралийского национального совета по медицинским исследованиям в области здравоохранения (NHMRC). Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института аллергии и инфекционных заболеваний или Национального института здравоохранения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
АцетонTerumo,Япония SS+01T
5 мл шприцыTerumo, ЯпонияSS+05S
АцетонMerck, Германия67641
Стендовые защитные листыHalyard, США2765-C
BetadineMundipharma, Нидерланды1015695
бупренорфин; TemgesicClifford Hallam Healthcare, Австралия1238366
CarprofenZoetis, Австралия10001132
ChlorhexidineTasman Chemicals, Австралия890401
суперсалфетки Chux (или эквивалентные)Chux, Австралиян/давтоклавные машинки
стрижкин/д/д
Ватные палочкиLP Italiana, Италия112191автоклавный
порошок стоматологического цемента (порошок самоотверждения Vertex)Henry Schein, СШАVX-SC500GVD5
Растворитель стоматологического цемента (жидкость для самоотверждения Vertex)Henry Schein, СШАVX-SC250MLLQ
Одноразовые иглы: 18 G, 26 G, 30 GTerumo,Япония NN+2525RL
Одноразовые хирургические лезвияWestlab, Австралия663-255
Диссекторные ножницыF.S.T.14082-09
Муляж канюлиBio Scientific, АвстралияC313DC/SPCобрезан до 4,05 по размеру направляющей канюли
Этанол 80%Merck,Австралия 10107
Синий краситель ЭванаSigmaE2129 - 50G
Смазка для глазClifford Hallam Healthcare, Австралия2070491
Фломастер для наконечникаSharpie, СШАD-4236
Волоконно-оптический источник светан/дн/д
Сплющенная игла (18 G) или аналогичная для нанесения суперклеян/д/д
Стеклянные пипетки, тянутыеHirschmann Laborgeraete, Германия9100175
Стеклянный шприц 10 мклHamilton, США701 LT и 1701 LT
Guide канюлиBio Scientific, АвстралияC313G/SPC22 г, разрез на 4 мм ниже пьедестала для канюляции бокового желудочка у взрослых крыс Sprague Dawley
Гемостат
Стерилизатор шариковInotech,Швейцария IS-250
Грелкан/д/д
Перекись водорода 3%Perrigo, Австралия11383
Индукционная камера (Perspex 300 мм x 200 мм)н/дн/ Канюля
для инжектораBio Scientific, АвстралияC313I/SPCразрезана по размеру канюли 4 мм + проекция 0,5 мм
ИзофлуранClifford Hallam Healthcare, Австралия2093803
Испаритель изофлурана и соответствующая система очисткин/дн/д
Весовые лодки среднего размеран/дн/д
Металлический шпательMet-App, Австралияn/a
Micro шприцевой насосNew Era, СШАNE-300
MicrodrillRWD Life Science Co, Китай87001
Polymyxin BBeta Pharma, Китай86-40302
Protein LoBind tubes, 0,5 млEppendorf, ГерманияZ666491
ропивакаин 1%; NaropinAstraZeneca, ВеликобританияPS09634
ножницы, большиеF.S.T.14511-15
Ножницы, маленькиеF.S.T.14079-10
Отверткан/д/д
ВинтыMr. Specs, Австралиян/д
Стереотаксическая рамаRWD Life Science Co, Китайн/дНеобходимые компоненты: крысиные ушные планки, зубной стержень, носовой конус для анестезии, кронштейн с цифровым считыванием (X, Y, Z) и держатель канюли
Стерильный физиологический раствор 0,9%Baxter, СШАAHB1323
Супер травление (37% фосфорной кислоты) гельSDI Limited, Австралия8100045
СуперклейUHU, Германиян/д
Тканевые щипцы с крючкамиF.S.T.11027-12
Трубка, PE-50Bio Scientific, АвстралияC313CT
для н н н н

Ссылки

  1. Goldmann, E. E. Vitalfärbung am Zentralnervensystem. Beitrag zur Physio-Pathologie des Plexus chorioideus und der Hirnhäute. Königl. Akademie der Wissenschaften. , Berlin. (1913).
  2. Koziara, J. M., Lockman, P. R., Allen, D. D., Mumper, R. J. The blood-brain barrier and brain drug delivery. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 6 (9-10), 2712-2735 (2006).
  3. Davson, H. Review lecture. The blood-brain barrier. The Journal of Physiology. 255 (1), 1-28 (1976).
  4. Pandit, R., Chen, L., Götz, J. The blood-brain barrier: Physiology and strategies for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 165-166, 1-14 (2020).
  5. Oldendorf, W. H., Hyman, S., Braun, L., Oldendorf, S. Z. Blood-brain barrier: Penetration of morphine, codeine, heroin, and methadone after carotid injection. Science. 178 (4064), 984-986 (1972).
  6. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  7. Velkov, T., Dai, C., Ciccotosto, G. D., Cappai, R., Hoyer, D., Li, J. Polymyxins for CNS infections: Pharmacology and neurotoxicity. Pharmacology & Therapeutics. 181, 85-90 (2018).
  8. Martin, J. A., Maris, A. S., Ehtesham, M., Singer, R. J. Rat Model of blood-brain barrier disruption to allow targeted neurovascular therapeutics. Journal of Visualized Experiments. (69), e50019(2012).
  9. KrolI, R. A., Neuwelt, E. A., Neuwelt, E. A. Outwitting the blood-brain barrier for therapeutic purposes: Osmotic opening and other means. Neurosurgery. 42 (5), 1083-1099 (1998).
  10. Wei, B., Qian, C., Liu, Y., Lin, X., Wan, J., Wang, Y. Ommaya reservoir in the treatment of cryptococcal meningitis. Acta Neurologica Belgica. 117 (1), 283-287 (2017).
  11. Zubair, A., Jesus, O. D. Ommaya reservoir. StatPearls [Internet]. , StatPearls Publishing. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK559011/ (2021).
  12. DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. Journal of Visualized Experiments. (75), e50326(2013).
  13. Ajoy, R., Chou, S. -Y. Studying the hypothalamic insulin signal to peripheral glucose intolerance with a continuous drug infusion system into the mouse brain. Journal of Visualized Experiments. (131), e56410(2018).
  14. Sajadi, A., Provost, C., Pham, B., Brouillette, J. Neurodegeneration in an animal model of chronic amyloid-beta oligomer infusion is counteracted by antibody treatment infused with osmotic pumps. Journal of Visualized Experiments. (114), e54215(2016).
  15. Rauschenberger, L., Knorr, S., Volkmann, J., Ip, C. W. Implantation of osmotic pumps and induction of stress to establish a symptomatic, pharmacological mouse model for DYT/PARK-ATP1A3 dystonia. Journal of Visualized Experiments. (163), e61635(2020).
  16. Cooper, J. D., Heppert, K. E., Davies, M. I., Lunte, S. M. Evaluation of an osmotic pump for microdialysis sampling in an awake and untethered rat. Journal of Neuroscience Methods. 160 (2), 269-275 (2007).
  17. Sharma, R. K., et al. Microglial cells impact gut microbiota and gut pathology in angiotensin II-induced hypertension. Circulation Research. 124 (5), 727-736 (2019).
  18. Kim, H. Y., Lee, D. K., Chung, B. -R., Kim, H. V., Kim, Y. Intracerebroventricular injection of amyloid-β peptides in normal mice to acutely induce alzheimer-like cognitive deficits. Journal of Visualized Experiments. (109), e53308(2016).
  19. Fukushima, A., Fujii, M., Ono, H. Intracerebroventricular treatment with resiniferatoxin and pain tests in mice. Journal of Visualized Experiments. (163), e57570(2020).
  20. Niaz, N., et al. Intracerebroventricular injection of histamine induces the hypothalamic-pituitary-gonadal axis activation in male rats. Brain Research. 1699, 150-157 (2018).
  21. Yokoi, H., Arima, H., Murase, T., Kondo, K., Iwasaki, Y. Intracerebroventricular injection of adrenomedullin inhibits vasopressin release in conscious rats. Neuroscience Letters. 216 (1), 65-70 (1996).
  22. Savci, V., Gürün, S., Ulus, I. H., Kiran, B. K. Intracerebroventricular injection of choline increases plasma oxytocin levels in conscious rats. Brain Research. 709 (1), 97-102 (1996).
  23. Sunter, D., Hewson, A. K., Dickson, S. L. Intracerebroventricular injection of apelin-13 reduces food intake in the rat. Neuroscience Letters. 353 (1), 1-4 (2003).
  24. Moreau, C., et al. Intraventricular dopamine infusion alleviates motor symptoms in a primate model of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 139, 104846(2020).
  25. Calvo, P. M., de la Cruz, R. R., Pastor, A. M. A single intraventricular injection of VEGF leads to long-term neurotrophic effects in axotomized motoneurons. eNeuro. 7 (3), (2020).
  26. Choi, C. R., Ha, Y. S., Ahn, M. S., Lee, J. S., Song, J. U. Intraventricular or epidural injection of morphine for severe pain. Neurochirurgia. 32 (6), 180-183 (1989).
  27. Zhong, L., Shi, X. -Z., Su, L., Liu, Z. -F. Sequential intraventricular injection of tigecycline and polymyxin B in the treatment of intracranial Acinetobacter baumannii infection after trauma: A case report and review of the literature. Military Medical Research. 7 (1), 23(2020).
  28. Gross, P. M., Weaver, D. F. A new experimental model of epilepsy based on the intraventricular injection of endothelin. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 22, Suppl 8 282-287 (1993).
  29. Nang, S. C., Azad, M. A. K., Velkov, T., Zhou, Q. Rescuing the last-line polymyxins: Achievements and challenges. Pharmacological Reviews. 73 (2), 679-728 (2021).
  30. Tsuji, B. T., et al. International Consensus Guidelines for the Optimal Use of the Polymyxins: Endorsed by the American College of Clinical Pharmacy (ACCP), European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID), Infectious Diseases Society of America (IDSA), International Society for Anti-infective Pharmacology (ISAP), Society of Critical Care Medicine (SCCM), and Society of Infectious Diseases Pharmacists (SIDP). Pharmacotherapy. 39 (1), 10-39 (2019).
  31. Velkov, T., Roberts, K. D., Nation, R. L., Thompson, P. E., Li, J. Pharmacology of polymyxins: New insights into an "old" class of antibiotics. Future Microbiology. 8 (6), 711-724 (2013).
  32. Nation, R. L., et al. Dosing guidance for intravenous colistin in critically-ill patients. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 64 (5), 565-571 (2017).
  33. Nation, R. L., Velkov, T., Li, J. Colistin and polymyxin B: Peas in a pod, or chalk and cheese. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 (1), 88-94 (2014).
  34. Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. Journal of Visualized Experiments. (59), e3528(2012).
  35. Molina-Cimadevila, M. J., Segura, S., Merino, C., Ruiz-Reig, N., Andrés, B., de Madaria, E. Oral self-administration of buprenorphine in the diet for analgesia in mice. Laboratory Animals. 48 (3), 216-224 (2014).
  36. Goldkuhl, R., Hau, J., Abelson, K. S. P. Effects of voluntarily-ingested Buprenorphine on plasma corticosterone levels, body weight, water intake, and behaviour in permanently catheterised rats. In Vivo. 24 (2), Athens, Greece. 131-135 (2010).
  37. Hestehave, S., Munro, G., Pedersen, T. B., Abelson, K. S. P. Antinociceptive effects of voluntarily ingested Buprenorphine in the hot-plate test in laboratory rats. Laboratory Animals. 51 (3), 264-272 (2017).
  38. Faesel, N., Schünemann, M., Koch, M., Fendt, M. Angiotensin II-induced drinking behavior as a method to verify cannula placement into the cerebral ventricles of mice: An evaluation of its accuracy. Physiology & Behavior. 232, 113339(2021).
  39. Elsevier. Neurotoxicity. Neurotoxicity | Elsevier Enhanced Reader. , (2021).
  40. Vuillemenot, B. R., Korte, S., Wright, T. L., Adams, E. L., Boyd, R. B., Butt, M. T. Safety evaluation of CNS administered biologics-study design, data interpretation, and translation to the clinic. Toxicological Sciences: An Official Journal of the Society of Toxicology. 152 (1), 3-9 (2016).
  41. Cerebrospinal fluid dynamics and intracranial pressure elevation in neurological diseases. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6456952/ (2021).
  42. Nau, R., Sörgel, F., Eiffert, H. Penetration of drugs through the blood-cerebrospinal fluid/blood-brain barrier for treatment of central nervous system infections. Clinical Microbiology Reviews. 23 (4), 858-883 (2010).
  43. Quagliarello, V. J., Ma, A., Stukenbrok, H., Palade, G. E. Ultrastructural localization of albumin transport across the cerebral microvasculature during experimental meningitis in the rat. The Journal of Experimental Medicine. 174 (3), 657-672 (1991).
  44. Reinhardt, V. Common husbandry-related variables in biomedical research with animals. Laboratory Animals. 38 (3), 213-235 (2004).
  45. Morton, L. D., Sanders, M., Reagan, W. J., Crabbs, T. A., McVean, M., Funk, K. A. Confounding factors in the interpretation of preclinical studies. International Journal of Toxicology. 38 (3), 228-234 (2019).
  46. Bailey, J. Does the stress of laboratory life and experimentation on animals adversely affect research data? A critical review. Alternatives to laboratory animals: ATLA. 46 (5), 291-305 (2018).
  47. Moberg, G. P., Mench, J. A. The Biology of Animal Stress: Basic Principles and Implications for Animal Welfare. , CABI. (2000).
  48. Russel, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique principles. , Methuen & Co LTD. (1959).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Видео скоро будет доступно

Похожие статьи