Методическая статья

Биореактор с визуальным контролем для создания биоинженерной ткани дыхательных путей

DOI:

10.3791/63544

⸱

6 апреля 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Stevens Institute of Technology, 2Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 3Department of Cell Biology, State University of New York Downstate Medical Center, 4Department of Cardiothoracic Surgery, Stanford University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол описывает биореактор с поддержкой визуализации, который позволяет селективно удалять эндогенный эпителий из трахеи крыс и гомогенное распределение экзогенных клеток на поверхности просвета с последующим долгосрочным посевом in vitro клеточно-тканевой конструкции.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Повторное повреждение тканей дыхательных путей может ухудшить функцию легких и вызвать хроническое заболевание легких, такое как хроническая обструктивная болезнь легких. Достижения в области регенеративной медицины и технологий биореакторов предлагают возможности для производства выращенных в лаборатории функциональных тканей и структур органов, которые могут быть использованы для скрининга лекарств, моделирования заболеваний и инженерных замен тканей. Здесь описан миниатюрный биореактор в сочетании с модальностью визуализации, которая позволяет in situ визуализировать внутренний просвет эксплантированной трахеи крысы во время манипуляций с тканями in vitro и культивирования. Используя этот биореактор, протокол демонстрирует селективное удаление эндогенных клеточных компонентов с помощью визуализации при сохранении внутренних биохимических особенностей и ультраструктуры тканевого матрикса дыхательных путей. Кроме того, показаны доставка, равномерное распределение и последующая длительная культивирование экзогенных клеток на децеллюляризированном просвете дыхательных путей с оптическим мониторингом in situ . Результаты подчеркивают, что биореактор под визуальным контролем потенциально может быть использован для облегчения генерации функциональных тканей дыхательных путей in vitro .

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Просветная поверхность дыхательных путей выстлана слоем эпителия, который в основном состоит из мультиреснитильных, клубных, бокаловидных и базальных стволовых клеток 1,2. Эпителиальный слой служит основным защитным механизмом легкого, действуя как биофизический барьер, который защищает подлежащую ткань дыхательных путей от вдыхаемых патогенов, частиц или химических газов. Он защищает ткань дыхательных путей с помощью нескольких механизмов, включая образование межклеточных плотных соединений, мукоцилиарный клиренс и антимикробную и антиоксидантную секрецию 3,4. Дефектный эпителий дыхательных путей связан с разрушительными респираторными заболеваниями, такими как хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ)5, первичная цилиарная дискинезия (PCD)6 и муковисцидоз (CF)7.

Достижения в технологии «легкие на чипе» (LOC) представляют собой возможность изучать развитие легких человека, моделировать различные заболевания легких и разрабатывать новые терапевтические материалы в жестко регулируемых средах in vitro . Например, эпителий дыхательных путей и эндотелий могут быть культивированы на противоположных сторонах тонкой пористой мембраны, чтобы имитировать газообменную легочную ткань, что позволяет точно моделировать заболевание и тестировать лекарства8. Аналогичным образом, модели заболеваний in vitro были созданы для моделирования заболеваний дыхательных путей in vitro, таких как ХОБЛ9 и муковисцидоз10. Однако основной проблемой устройств LOC является повторение сложной трехмерной (3D) архитектуры легочной ткани и динамических матричных взаимодействий между клетками и тканями in vitro11.

В последнее время были разработаны инновационные методологии тканевой инженерии, которые позволяют манипулировать тканями легких ex vivo 12. Используя эти методологии, оголенные аллогенные или ксеногенные тканевые трансплантаты могут быть получены путем удаления эндогенных клеток из легочной ткани с помощью химической, физической и механическойобработки 13. Кроме того, сохраненный нативный тканевый внеклеточный матрикс (ECM) в децеллюляризованных каркасах легких обеспечивает физио-миметические структурные, биохимические и биомеханические сигналы для имплантированных клеток для прикрепления, пролиферации и дифференцировки14,15.

Здесь сообщается о системе биореакторов с визуальным контролем, созданной путем объединения технологий LOC и тканевой инженерии, чтобы позволить манипулировать тканями in vitro и культивировать эксплантированные ткани трахеи крыс. Используя этот биореактор тканей дыхательных путей, протокол демонстрирует селективное удаление эндогенных эпителиальных клеток без нарушения нижележащих субэпителиальных клеточных и биохимических компонентов ткани дыхательных путей. Далее мы показываем однородное распределение и мгновенное осаждение вновь посеянных экзогенных клеток, таких как мезенхимальные стволовые клетки (МСК), на оголенный просвет дыхательных путей путем закапывания клеточного раствора коллагена I. Кроме того, с помощью микрооптического устройства визуализации, интегрированного в биореактор, также выполняется визуализация просвета трахеи при удалении эпителия и доставке эндогенных клеток. Далее показано, что трахею и вновь имплантированные клетки можно культивировать в биореакторе без заметной гибели клеток и деградации тканей в течение 4 дней. Мы предполагаем, что платформа биореактора с поддержкой визуализации, метод деэпителизации на основе тонкой пленки и метод доставки клеток, используемый в этом исследовании, могут быть полезны для создания тканей дыхательных путей для моделирования заболеваний in vitro и скрининга лекарств.

Биореактор включает в себя прямоугольную камеру, соединенную с программируемым шприцевым насосом, перфузионный насос и вентилятор для культивирования изолированной трахеи крысы. Биореактор имеет входы и выходы, соединенные с трахеей или камерой культуры тканей, для отдельной подачи реагентов (например, питательных сред) во внутреннее и внешнее пространства трахеи (рисунок 1). Специально разработанная система визуализации может быть использована для визуализации внутренней части трахеи крысиной культуры in vitro на клеточном уровне (рисунок 2). Эндогенный эпителий трахеи удаляется путем закапывания раствора для децеллюляризации на основе моющего средства с последующим вибрационным промыванием дыхательных путей (рисунок 3). Раствор гидрогеля, такой как коллаген I типа, используется в качестве средства доставки для равномерного и мгновенного посева экзогенных клеток через оголенный просвет трахеи (рисунок 4). Все материалы, используемые для построения биореактора и проведения экспериментов, приведены в Таблице материалов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Приведенный ниже протокол по тканям животных был одобрен руководством по благополучию животных и правилами Комитета по уходу и использованию животных (IACUC) в Технологическом институте Стивенса и соответствует руководящим принципам Национального института здравоохранения (NIH) по использованию экспериментальных животных.

1. Проектирование и конструирование биореактора трахеи крыс с визуальным контролем

  1. Проектирование и изготовление биореактора трахеи крыс
    1. Создайте модель автоматизированного проектирования (CAD) камеры биореактора с соответствующей конструкцией, такой как входные отверстия, выпускные отверстия и камера культуры тканей, используя программное обеспечение генератора САПР. Для этого исследования используйте геометрию и размеры, представленные на рисунке 1A-C. Учебник программного обеспечения генератора САПР можно найти в16,17.
    2. Экспортируйте сгенерированную модель САПР в программное обеспечение контроллера с числовым программным управлением (ЧПУ) и вырежьте политетрафторэтилен (PTFE) пластик с помощью станка с ЧПУ для создания камеры биореактора. Учебник по программному обеспечению контроллера ЧПУ можно найти в18.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнение к PTFE, другие пластмассовые материалы, такие как сверхвысокомолекулярный полиэтилен (UHMWPE) и полиэфиримид, могут быть использованы для изготовления культуральной камеры.
    3. Стерилизуйте все компоненты биореактора, такие как адаптеры и винты Luer, чтобы избежать загрязнения тканей и клеток, культивируемых в устройстве. Соберите все компоненты биореактора в основную камеру культуры тканей в чистой среде (рисунок 1А).
  2. Построение устройства визуализации на основе объектива с индексом градиента (GRIN)
    1. Чтобы создать устройство визуализации in situ , вставьте линзу трубки в штабелируемую трубку линзы и закрепите ее с помощью стопорного кольца. Установите трубку объектива в сборе на научную КМОП-камеру с помощью адаптера C-mount.
    2. Используйте программное обеспечение, такое как Micro-Manager, для управления камерой и получения фотографий и видео. Направьте объект, расположенный на большом расстоянии (например, 10 м от камеры) и отрегулируйте расстояние между ламповым объективом и датчиком изображения камеры до тех пор, пока сфокусированное изображение объекта не будет сформировано на экране компьютера используемым программным обеспечением для визуализации.
    3. Установите фильтрующую линзу на двухгранное дихроичное зеркало сверхвысокого разрешения и лазер на устройство с помощью компонентов системы оптического сепаратора, включая сборочный стержень, резьбовую пластину клетки и куб клетки.
    4. Подключите объектив (20x) к устройству. Установите объектив GRIN (диаметр = 500 мкм) на дистальный конец трубки объектива с помощью транслятора XY. Отрегулируйте расстояние между объективом GRIN и объективом для формирования сфокусированных микроскопических изображений (рисунок 2A, B).

2. Выделение трахеи крысы

  1. Продезинфицируйте хирургическую область и стерилизуйте хирургические инструменты с помощью автоклава при 121 °C в течение 30 минут до операции.
  2. Поместите крысу в индукционную камеру и доставьте 2,5% изофлурана в течение 15 минут, используя небольшой испаритель для анестезии животного. Оцените глубину анестезии с помощью педального рефлекса. Для этого крепко ущипните палец ноги и подтвердите, что животное не реагирует на защемление пальца ноги.
  3. После анестезии удалите изофлуран из камеры и введите 1 мл 1000 единиц / мл гепарина через боковую хвостовую вену, чтобы предотвратить свертывание крови в легочной сосудистой системе.
  4. Чтобы усыпить животное, подвергайте животное воздействию 5% изофлурана в течение дополнительных 15-20 мин. Извлеките животное из индукционной камеры и поместите его на хирургическую доску в положении лежа на спине лицом вверх.
  5. Зафиксируйте крысу на хирургической доске, обездвижив ноги и хвост с помощью клейкой ленты. Затем стерилизуйте области шеи и грудной клетки крысы, используя 70% изопропиловый спирт (IPA). Откройте брюшную полость, сделав разрез 3-4 см ножницами в коже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не разрезать кожу глубоко, направив кончики ножниц вверх.
  6. Трансекция нижней полой вены (IVC) с помощью ножниц и подтверждение эвтаназии путем экссангинации.
  7. Выполните трахеотомию, сделав разрез с помощью ножниц в средней линии шеи и обнажив трахею. Выполните торакотомию средней линии, сделав разрез в грудной стенке и разрезав между ребрами, чтобы достичь конца трахеи, соединенного с легким. Затем используйте бицепс и ножницы, чтобы разрезать оба конца трахеи и изолировать трахею.
  8. После выделения промыть трахею, используя 20 мл 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (1x PBS). Перенесите трахею на биореактор с помощью стерилизованных бицепсов. Закрепите два конца трахеи на разъеме Luer с помощью шовной резьбы 4-0.
  9. Подайте 5 мл питательной среды в камеру биореактора с помощью программируемого шприцевого насоса через трубку, подключенную к камере биореактора со скоростью потока 5 мл/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Культуральная среда состоит из модифицированной среды Dulbecco Eagle's (DMEM), рекомбинантного человеческого FGF-основного (0,1 нг/ мл), фетальной бычьей сыворотки (FBS, 10%) и антибиотика-антимикотика (1%).
  10. Плотно закройте крышку биореактора акриловой пластиковой крышкой и винтами. Закройте соединения трубки камеры биореактора с мужскими/женскими пробками Luer, чтобы предотвратить поступление питательной среды в трубку.

3. Удаление эпителия трахеи с помощью визуализации

  1. Чтобы визуализировать просвет трахеи в ярком поле или флуоресцентном виде, поместите биореактор на стадию визуализации (рисунок 3A).
  2. Приготовьте раствор карбоксифлуоресцеина сукцинимидилового эфира (CFSE) (концентрация: 100 мкМ) в наборе для маркировки клеток CFSE, разбавив раствор CFSE 1x PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация исходного раствора CFSE составляет 10 мМ (в диметилсульфоксиде (DMSO)).
  3. Вводят 500 мкл раствора CFSE через трахею через шприцевой насос через трубку, соединенную с канюлей трахеи со скоростью потока 5 мл/мин. Остановите насос, когда раствор CFSE заполнит трахею. Подождите 10 мин, а затем промыть просвет трахеи инфузией 10 мл 1x PBS с помощью шприцевого насоса для удаления остаточного невключенного реагента CFSE.
  4. Вставьте конец дистальной визуализации линзы GRIN в трахею через разъем Luer, прикрепленный к одному концу трахеи. Затем осторожно переместите линзу GRIN внутрь трахеи до тех пор, пока поверхность трахеи не будет сфокусирована, и делайте фотографии и видео в ярком поле или флуоресценции при 20-кратном увеличении.
  5. Для захвата изображений яркого поля в программном обеспечении Micro-Manager выполните следующие действия.
    1. Введите белый свет через куб клетки, чтобы осветить просвет трахеи. Нажмите на значок Live , чтобы отобразить светящуюся поверхность трахеи в режиме реального времени. Используйте параметр «Настройка изображения» > экспозиции (мс), чтобы изменить время экспозиции до требуемого значения. В этом исследовании используемое время воздействия было в диапазоне 10 мс и 50 мс.
    2. Чтобы настроить контрастность и яркость изображений, используйте окно «Масштабирование гистограммы и интенсивности » для перемещения черно-белых стрелок в конечную точку интерактивного дисплея гистограммы. Кроме того, можно использовать опцию Auto Stretch , которая позволяет программному обеспечению автоматически настраивать яркость и контрастность до оптимальных уровней.
    3. Нажмите на значок Snap , чтобы заморозить изображение. Затем используйте Параметр > Экспорт изображений как смещенных , чтобы сохранить изображения в нужном формате. Кроме того, можно использовать параметр «Настройка > ImageJ », чтобы напрямую экспортировать изображение в программное обеспечение ImageJ и сохранить его.
  6. Для получения фотографий и видео в флуоресцентном режиме освещайте просвет трахеи с помощью CFSE-специфического лазерного света (CFSE: длина волны возбуждения: 488 нм, длина волны излучения: 515 нм) через куб клетки. Выполните шаги 3.5.2-3.5.3 для получения изображений. После фото- и видеосъемки аккуратно снимите линзу GRIN с трахеи.
  7. Выполните деэпителизацию, как описано ниже.
    1. Приготовьте 2% раствор для децеллюляризации додецилсульфата натрия (SDS) в дистиллированной (DI) воде. Закапывают 50 мкл SDS через трахею со скоростью потока 6,3 мл/мин, используя шприцевой насос через канюлю трахеи, чтобы получить тонкую пленку раствора моющего средства на просвете трахеи.
    2. Закройте соединения трубк биореактора с помощью мужских/женских пробок Luer и перенесите биореактор в инкубатор. Дайте SDS обитать в трахее в течение 10 мин при 37 °C. Закапывают еще 50 мкл раствора SDS через трахею и инкубируют в течение 10 мин.
    3. Удаляют лизированный эпителий и SDS путем орошения просвета трахеи 500 мкл 1x PBS через шприцевой насос со скоростью потока 10 мл / мин в течение 3x. Поместите биореактор на шейкер и механически вибрируйте биореактор с частотой 20 Гц и амплитудой смещения примерно 0,3 мм, чтобы физически способствовать отсоединению эпителиальных клеток, обработанных SDS, от просвета трахеи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании шейкер был изготовлен на заказ путем сборки динамика сабвуфера, пластинчатого усилителя сабвуфера и акселерометра. Синусоидальная форма сигнала генерировалась компьютером и подавалась в шейкер через усилитель, в то время как отклик шейкера контролировался с помощью акселерометра (рисунок 3B). Кроме того, обычные шейкеры, такие как электромагнитные и инерционные шейкеры, могут быть использованы для содействия отслоению клеток. Для этого установите частоту и ускорение шейкера на 20 Гц и 0,5 g соответственно (что эквивалентно амплитуде смещения 0,3 мм).
    4. Закапывайте 500 мкл 1x PBS дважды через просвет трахеи, чтобы удалить остаточный SDS и клеточный мусор, пока трахея механически вибрирует. После процедуры удаления эпителия оцените клиренс эпителиального слоя путем измерения интенсивности CFSE с помощью устройства визуализации линзы GRIN, как на этапе 3.6 (рисунок 3C).

4. Подготовка ткани трахеи к дальнейшим анализам

  1. Чтобы подтвердить удаление эпителия, выполните дальнейшие анализы тканей, такие как окрашивание гематоксилином и эозином (H & E), трихром, пентахром и иммуноокрашивание. Для этого удаляют трахею из биореактора и фиксируют ее в 30 мл 4% нейтрального буферного раствора параформальдегида в 1x PBS (pH = 7,4) при 4 °C в течение ночи.
  2. Обезвоживайте и встраивайте фиксированную ткань трахеи, выполнив следующие шаги.
    1. После фиксации промыть ткань трахеи 10 мл 1x PBS, перевести трахею в 30 мл 70% спирта и держать при 4 °C в течение ночи. Разрежьте трахею на небольшие цилиндрические срезы (~5 мм) острым лезвием и вставьте участки ткани во встраиваемые в ткань кассеты (длина х ширина х высота: 4 см х 2,5 см х 0,5 см). Держите два участка трахеи в каждой кассете.
    2. Обезвоживать срезы в серии растворов изопропилового спирта (МПА) - 85%, 90%, 95%, 100% - в течение 1 ч в 30 мл каждого раствора. Удалите предыдущее решение перед добавлением следующего решения.
    3. По завершении погружают кассеты в 30 мл расчистного агента (например, ксилола) на 2 ч, чтобы полностью вытеснить раствор IPA из срезов ткани. Выполните этот шаг в вытяжке с надлежащей вентиляцией.
    4. Погрузите кассеты в парафин на 2 ч, а затем вставьте их в парафин при 4 °C на ночь. Затем разрезайте парафиновые ткани на тонкие участки (5-8 мкм) с помощью микротомового устройства для H&E, трихрома, пентахрома и иммуноокрашивания.
  3. Для подготовки тканей к сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) анализу зафиксируют трахею в 30 мл 2,5% раствора глутаральдегида в 1x PBS (pH = 7,4) при 4 °C в течение ночи. Затем обезвоживайте фиксированную ткань трахеи для SEM, выполнив следующие шаги.
    1. После фиксации промыть ткань трахеи 10 мл 1x PBS. Разрежьте ткань трахеи продольно на небольшие полуцилиндровые срезы (длина: ~5 мм) ножницами и вставьте участки ткани в кассеты.
    2. Обезвоживать срезы в серии растворов АПА - 35%, 50%, 70%, 85%, 95% и 100% - в течение 10 мин в 30 мл каждого раствора. Удалите предыдущее решение перед добавлением следующего решения.
    3. Выполняют метод сушки на основе гексаметилдисилазана (HMDS) путем погружения тканей в следующие растворы: 100% IPA: HMDS (2: 1; v / v) в течение 10 мин, затем 100% IPA: HMDS (1: 2; v / v) в течение 10 мин и, наконец, 100% HMDS на ночь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: HMDS токсичен. Работайте под вытяжным кожухом на всех этапах сушки.
    4. Удалите ткани из раствора HMDS и дайте им высохнуть под вытяжкой в течение 1 ч. Установите секцию на алюминиевые заглушки с помощью углеродной двусторонней проводящей ленты или серебряной проводящей пасты для визуализации SEM.

5. Однородное распределение экзогенных клеток по оголенному просвету трахеи

  1. Подготовьте деэпителизированную трахею крысы, используя протокол на шаге 3. Оттаивайте замороженные мезенхимальные стволовые клетки (МСК) в течение 30 с на водяной бане с температурой 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании мы использовали мезенхимальные стволовые клетки (МСК) в качестве модельной клетки, чтобы показать распределение экзогенных клеток на деэпителиализованной трахее. В идеале, эпителиальные клетки первичных дыхательных путей, базальные клетки или индуцированные плюрипотентные клетки человека (iPSCs) могут использоваться для целей регенерации эпителия.
  2. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и приготовьте клеточный раствор с концентрацией 5 х 106 клеток/мл. Метят клетки флуоресцентно, инкубируя клетки с 2 мл раствора CFSE (концентрация: 100 мкМ) при комнатной температуре в течение 15 мин. Промыть клетки 5 мл 1x PBS в течение 3x и повторно суспендировать клетки в свежей питательной среде в конечной концентрации 3 x 107 клеток/мл.
  3. Готовят раствор гидрогеля предварительного геля в качестве средства для доставки клеток. Для этого исследования используйте коллаген I в качестве средства доставки для клеток МСК и следуйте инструкциям производителя по приготовлению предварительного геля. Например, для получения 3,6 мг/мл коллагенового предварительного геля смешайте одну часть охлажденного нейтрализационного раствора с девятью частями коллагена крысиного хвоста в стерильной трубке объемом 1,5 мл. Затем аккуратно пипетируйте смесь вверх и вниз для адекватного перемешивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другие биосовместимые гидрогели могут быть использованы вместо коллагена I в соответствии с исследованием и потребностями пользователя.
  4. Как только раствор гидрогеля приготовлен, быстро добавьте клетки к раствору с желаемой концентрацией (например, 5 х 106 клеток/мл). Для получения однородной клеточно-гидрогелевой смеси смешайте клетки и раствор геля путем аккуратного пипетирования микропипеткой.
  5. Прикрепите один конец трахеи внутри биореактора к программируемому шприцевому насосу через разъем Luer. Подайте 5 мл свежей питательной среды при 37 °C в камеру биореактора для покрытия наружной поверхности трахеи с помощью шприцевого насоса со скоростью потока 5 мл /мин.
  6. Введите болюс 10 мкл клеточно-гидрогелевой смеси в деэпителиализованную трахею внутри биореактора с помощью шприцевого насоса со скоростью потока 5 мл/мин для создания слоя клеточного гидрогеля на просвете трахеи (рисунок 4).
  7. После инъекции клетки поместите биореактор в стерильный инкубатор клеточных культур при 37 °C и 5% CO2 для гелеобразования. Для коллагена I гелеобразование происходит через 30 мин.
  8. Чтобы визуализировать распределение имплантированных клеток, стерилизуйте линзу GRIN путем протирания 70% IPA или этанолом и поместите биореактор на стадию визуализации. Делайте фотографии и видео как в ярко-полевом, так и в флуоресцентном режимах по мере необходимости.
  9. После 30 мин посева клеток вводят 1 мл питательной среды в просвет трахеи с помощью шприцевого насоса со скоростью потока 1 мл/мин.
  10. Культивируйте клеточную трахею внутри биореактора в инкубаторе при 37 °C в течение желаемого времени. Для длительного культивирования обновляйте питательную среду в просвете трахеи и камере биореактора каждые 24 ч. Во время клеточной культуры сохраняйте среду внутри просвета статичной и изменяйте ее каждые 24 ч, в то время как среда вне трахеи непрерывно перфузится однонаправленным потоком со скоростью 5 мл/мин.
  11. После культивирования клеток в течение определенного периода времени (например, 1 и 4 дня в этом исследовании) удалите трахею из биореактора. Используйте ножницы, чтобы разрезать трахею продольно на две полуцилиндровые секции (т.е. верхнюю и нижнюю секции) на 1 и 4 день культуры in vitro , чтобы обнажить внутренние поверхности для мониторинга роста клеток и расчета плотности клеток. Используйте обычный флуоресцентный микроскоп для визуализации клеток на внутренних поверхностях.
  12. Чтобы получить изображения с помощью программного обеспечения Micro-Manager, выполните шаги 3.5 и 3.6. Используйте фильтр флуоресцеина изотиоцианата (FITC) для визуализации клеток, меченных CFSE, в режиме флуоресценции. Анализируйте изображения, полученные флуоресцентным микроскопом, и рассчитывайте плотность клеток на верхней и нижней секциях с помощью программного обеспечения ImageJ. Чтобы рассчитать количество ячеек и плотность ячеек, выполните следующие действия.
    1. Откройте изображение в программном обеспечении ImageJ и преобразуйте его в двоичное изображение (16-битное) с помощью Image > Type > 16-bit. Задайте масштаб изображения с помощью шкалы с помощью функции «Анализ > «Задать масштаб».
    2. Отрегулируйте пороговое значение изображения, чтобы выделить структуры клеток для подсчета. Используйте image > Adjust > Threshold. Используйте Анализ > Анализ частиц для подсчета количества ячеек. Рассчитайте плотность ячеек, разделив количество ячеек на площадь поверхности изображения.
  13. Чтобы оценить жизнеспособность после посева клеток, используйте набор жизнеспособности клеток. Для этого исследования инкубируют ткань трахеи и клетки в биореакторе при 37 °C в течение 6 ч и окрашивают клетки 4 мМ кальциина-AM и 2 мМ этидия гомодимера-1 в 1 мл 1x PBS при комнатной температуре в течение 15 мин.
  14. После промывки 1x PBS визуализируйте клетки с помощью флуоресцентного микроскопа. Подсчитайте живые и мертвые клетки, выполнив действия, описанные в шаге 5.12. Рассчитайте жизнеспособность клеток как процент живых клеток (окрашенных кальцеином-AM) на общее количество клеток (как живых, так и мертвых клеток).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метод визуализации in situ на основе линзЫ GRIN может позволить визуализацию внутреннего просвета трахеи in situ (рисунок 5A). С помощью этого метода визуализации можно получить как ярко-полевые, так и флуоресцентные изображения нативной и деэпителизированной трахеи (рисунок 5B,C). Флуоресцентный сигнал не наблюдался от нативной трахеи до маркировки CFSE (рисунок 5Bii). Однако, когда эпителий трахе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой работе мы создали биореактор с визуальным контролем, который может позволить (i) мониторинг просвета трахеи in situ после удаления клеток и доставки экзогенных клеток и (ii) долгосрочную культуру in vitro ткани трахеи, засеянной клетками. Используя этот специально разработанный биореактор, мы продемонстрировали (i) селективное удаление эндогенных эпителиальных клеток из просвета трахеи с помощью моющего средства и промывания дыхательных путей с помощью вибрации и (ii) равномерное распределение эк...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было частично поддержано Исследовательской программой Фонда Американского торакального общества, Фондом здравоохранения Нью-Джерси и Национальным научным фондом (CAREER Award 2143620). и Национальные институты здравоохранения (P41 EB027062) - G.V.N.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1&раз; PBSGibco, Thermo Fisher Scientific10-010-031
3-портовый разъемWorld Precision Instruments14048-20
4-портовый разъемWorld Precision Instruments14047-10
АкселерометрSTMicroelectronicsIIS3DWBTR
ахроматический дублетThorlabsAC254-150-A-ML
Алюминий штифтовый корешокTED PELLA16111
Антибиотик-антимикотикThermo Fisher Scientific15240062
Сборочный стерженьThorlabsER1
Винты с кнопочной головкойMcMaster-Carr91255A274
Клетка кубическаяThorlabsC4W
Углеродная двусторонняя проводящая лентаTED PELLA16073
Набор этикеток CFSEAbcamab113853
Citrisolv (очищающий агент)Decon1061
C-mount адаптерThorlabsSM1A9
Collagen IAdvanced BioMatrix5153
Проводящая жидкая серебряная краскаTED PELLA16034
Дихроичное зеркалоSemrockDI03-R488Длины волн отраженного лазера:  473.0 +- 2 нм 488.0 +3/-2 нм
модифицированный Eagle от Dulbecco' s среднийGibco, Thermo Fisher Scientific11965118
Внутренняя люэровская переборка к шлангу Адаптер для заусенцевCole-ParmerEW-45501-30
Внутренний люэр для трубкиCole-ParmerEW-45508-03
Соединитель люэра с женским на мужскойCole-ParmerZY-45508-80
Фетальная бычья сывороткаGibco, Thermo Fisher Scientific10082147
Фильтрующий объективChroma Technology CorpET535/50M
Флуоресцентный микроскопNikonEclipse E1000 - D
Fusion 360Autodesk
Hex гайкаMcMaster-Carr91813A160
Гексаметилдисилазан (HMDS)Fisher ScientifcAC120585000
Imaging fiberSELFOC, NSG группаобъектив
GRIN ЛазерныйоптодвигательMDL-D-488-150mW
Линзовые трубкиThorlabsSM1L40
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen)Thermo Fisher ScientificL3224
MACH 3 Программное обеспечение для управления ЧПУНовомодные решения
Объектив ОбъективOlympusUCPLFLN20X
Перистальтический насосCole ParmerL/S стандартная цифровая насосная система
Рекомбинантный человеческий FGF-basicPeproTech100-18B
Стопорное кольцоThorlabsSM1RR
Scientific CMOS камераPCO PandaPanda PCO 4.2
Додецилсульфат натрияVWR97064-472
Solidworks ( 2019)Dassault Systè mes
Штабелируемая трубка объективаThorlabsSM1L10
Сабвуферная пластина усилительDayton AudioSPA250DSP
Сабвуфер динамикDayton AudioRSS21OHO-4Диаметр диафрагмы: 21 см
Шприцевой насосWorld Precision InstrumentsAL-4000
Пластина с резьбовым каркасомThorlabsCP33
Резьбовой адаптер ЛюэраCole-ParmerEW-45513-81
Тубусный объективThorlabsAC254-150-A-ML
Трубка TygonCole-Parmer13-200-110
XY ПереводчикThorlabsCXY1

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. The Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
  2. Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cell 3D cultures for in vitro lung model studies. Scientific Reports. 9 (1), 500(2019).
  3. Gohy, S., Hupin, C., Ladjemi, M. Z., Hox, V., Pilette, C. Key role of the epithelium in chronic upper airways diseases. Clinical and Experimental Allergy. 50 (2), 135-146 (2020).
  4. Ganesan, S., Comstock, A. T., Sajjan, U. S. Barrier function of airway tract epithelium. Tissue Barriers. 1 (4), 24997(2013).
  5. De Rose, V., Molloy, K., Gohy, S., Pilette, C., Greene, C. M. Airway epithelium dysfunction in cystic fibrosis and COPD. Mediators of Inflammation. 2018, 1309746(2018).
  6. Horani, A., Ferkol, T. W. Advances in the genetics of primary ciliary dyskinesia: Clinical implications. Chest. 154 (3), 645-652 (2018).
  7. Berical, A., Lee, R. E., Randell, S. H., Hawkins, F. Challenges facing airway epithelial cell-based therapy for cystic fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 10, 74(2019).
  8. Shrestha, J., et al. Lung-on-a-chip: the future of respiratory disease models and pharmacological studies. Critical Reviews in Biotechnology. 40 (2), 213-230 (2020).
  9. Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
  10. Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. , (2021).
  11. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
  12. Gilpin, S. E., Wagner, D. E. Acellular human lung scaffolds to model lung disease and tissue regeneration. European Respiratory Review. 27 (148), 180021(2018).
  13. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).
  14. Gilpin, S. E., Charest, J. M., Ren, X., Ott, H. C. Bioengineering lungs for transplantation. Thoracic Surgery Clinics. 26 (2), 163-171 (2016).
  15. Calle, E. A., Leiby, K. L., Raredon, M. B., Niklason, L. E. Lung regeneration: steps toward clinical implementation and use. Current Opinion in Anaesthesiology. 30 (1), 23-29 (2017).
  16. Planchard, D. Engineering Design with SOLIDWORKS 2022: A Step-by-Step Project Based Approach Utilizing 3D Solid Modeling. , SDC Publications. (2022).
  17. Coward, C. A Beginner's Guide to 3D Modeling: A Guide to Autodesk Fusion 360. , No Starch Press. (2019).
  18. Meza, G., Carpio, C. D., Vinces, N., Klusmann, M. 2018 IEEE XXV International Conference on Electronics, Electrical Engineering and Computing (INTERCON. , 1-4 (2018).
  19. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  20. Tchoukalova, Y. D., Hintze, J. M., Hayden, R. E., Lott, D. G. Tracheal decellularization using a combination of chemical, physical and bioreactor methods. The International Journal of Artificial Organs. 41 (2), 100-107 (2017).
  21. Partington, L., et al. Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds. Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).
  22. Balestrini, J. L., et al. Production of decellularized porcine lung scaffolds for use in tissue engineering. Integrative Biology. 7 (12), 1598-1610 (2015).
  23. Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. Decellularized matrices in regenerative medicine. Acta Biomaterialia. 74, 74-89 (2018).
  24. Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
  25. Huang, S. X. L., et al. The in vitro generation of lung and airway progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 10 (3), 413-425 (2015).
  26. Kim, J., O'Neill, J. D., Dorrello, N. V., Bacchetta, M., Vunjak-Novakovic, G. Targeted delivery of liquid microvolumes into the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11530-11535 (2015).
  27. Kim, J., O'Neill, J. D., Vunjak-Novakovic, G. Rapid retraction of microvolume aqueous plugs traveling in a wettable capillary. Applied Physics Letters. 107 (14), 144101(2015).
  28. O'Neill, J. D., et al. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. The Annals of Thoracic Surgery. 96 (3), 1046-1056 (2013).
  29. Sengyoku, H., et al. Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung. Organogenesis. 14 (2), 94-106 (2018).
  30. Walters, M. S., et al. Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity. Respiratory Research. 14 (1), 135(2013).
  31. O'Neill, J. D., et al. Cross-circulation for extracorporeal support and recovery of the lung. Nature Biomedical Engineering. 1 (3), 0037(2017).
  32. Guenthart, B. A., et al. Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform. Nature Communications. 10 (1), 1985(2019).
  33. Chen, J., et al. Non-destructive vacuum-assisted measurement of lung elastic modulus. Acta Biomaterialia. 131, 370-380 (2021).
  34. Dorrello, N. V., et al. Functional vascularized lung grafts for lung bioengineering. Science Advances. 3 (8), 1700521(2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in situ

Похожие статьи