Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Дактилоскопирование кардиолипина в лейкоцитах масс-спектрометрией для быстрой диагностики синдрома Барта

2.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63552

⸱

23 марта 2022 г.

 ,  ,  , 
1Medical School, Swansea University, 2Department of Basic Medical Sciences, Neuroscience and Sense Organs, University of Bari Aldo Moro

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол показывает, как получить масс-спектрометрический «отпечаток» кардиолипина лейкоцитов для диагностики синдрома Барта. Оценка повышенного соотношения монолизокардиолипина к кардиолипину отличает пациентов с синдромом Барта от контрольных пациентов с сердечной недостаточностью со 100% чувствительностью и специфичностью.

Аннотация

Кардиолипин (CL), димерный фосфолипид, несущий в своей структуре четыре цепи жирных кислот, является липидным маркером митохондрий, в котором он играет решающую роль в функционировании внутренней мембраны. Его метаболит монолизокардиолипин (MLCL) физиологически почти отсутствует в липидном экстракте клеток животных, а его внешний вид является отличительной чертой синдрома Барта (BTHS), редкого и часто неправильно диагностируемого генетического заболевания, которое вызывает тяжелую кардиомиопатию в младенчестве. Метод, описанный здесь, генерирует «кардиолипиновый отпечаток» и позволяет провести простой анализ относительных уровней видов CL и MLCL в клеточных липидных профилях. В случае лейкоцитов требуется только 1 мл крови для измерения соотношения MLCL / CL с помощью матричной лазерной десорбционной ионизации - время полета / масс-спектрометрия (MALDI-TOF / MS) всего в пределах 2 ч от забора крови. Анализ прост и может быть легко интегрирован в рутинную работу клинической биохимической лаборатории для скрининга на BTHS. Тест показывает 100% чувствительность и специфичность для BTHS, что делает его подходящим диагностическим тестом.

Введение

Синдром Барта (BTHS) является редким Х-сцепленным заболеванием, характеризующимся ранней кардиомиопатией, миопатией скелетных мышц, задержкой роста, нейтропенией, вариабельной дисфункцией митохондриальной дыхательной цепи и аномальнойструктурой митохондрий 1,2,3,4,5. BTHS имеет распространенность одного случая на миллион мужчин с в настоящее время менее 250 известными случаями во всем мире, хотя широко признано, что болезнь недодиагностирована 2,6. BTHS является результатом мутаций потери функции гена Tafazzin (TAFAZZIN), локализованного в хромосоме Xq28.12 7,8, вызывающих недостаточное ремоделирование митохондриального фосфолипида кардиолипина (CL), процесс, который обычно приводит к высокосимметричному и ненасыщенному ациловому составу 9,10. CL считается сигнатурным липидом митохондрий, где он является важным компонентом внутренней мембраны, жизненно важным для окислительного фосфорилирования (то есть митохондриального энергетического метаболизма), образования суперкомплексов, импорта белка и участвует в динамике митохондрий, митофагии и апоптозе 11,12,13,14,15,16 . При потере функции TAFAZZIN ремоделирование CL не удается и в митохондриях пациентов с BTHS возникают специфические аномалии фосфолипидов: зрелый уровень CL (CLm) снижается, в то время как повышаются уровни монолизокардиопина (MLCL) и изменяется состав CL ацила (т.е. незрелые виды CL, CLi). Это приводит к резкому увеличению соотношения MLCL/CL17.

Диагностика BTHS часто затруднена, так как расстройство представляет собой чрезвычайно изменчивые клинические и биохимические особенности и может отличаться между пострадавшими лицами из одной семьи и внутри пациента с течениемвремени 3,5. Многие мальчики BTHS показывают очень высокий уровень экскреции с мочой 3-метилглутаконовой кислоты (3-MGCA), но уровень мочи может быть нормальным или только слегка увеличиваться у пациентов с течением времени3. Тем не менее, увеличение 3-MGCA является особенностью различных других митохондриальных и немитохондриальных расстройств, таких как дефицит гидразы 3-метилглютаконил-КоА (дефект AUH), 3-метилглутаконовая ацидурия, дистония-глухота, энцефалопатия, синдром Ли (MEGDEL), синдром Костеффа и дилатационная кардиомиопатия с атаксией (DCMA)синдром 18,19 . Следовательно, плохая специфичность 3-MCGA как маркера BTHS и огромная вариабельность у пациентов делают биохимический диагноз неоднозначным.

Кроме того, было описано более 120 различных мутаций TAFAZZIN, вызывающих расстройство5 , и, следовательно, генетический диагноз может быть сложным, медленным и дорогостоящим. Более того, молекулярный анализ гена TAFAZZIN может привести к ложноотрицательным результатам при наличии мутаций в некодирующих или регулирующих последовательностях3. BTHS может быть однозначно проверен путем определения относительных количеств и распределения (монолизо-)видов CL и подтвержден секвенированием гена TAFAZZIN или наоборот.

Практическим тестом для диагностики является измерение соотношения MLCL/CL методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и анализа электрораспыляемой ионизации/масс-спектрометрии (ESI/MS) в пятне крови20,21. Измерение уровня CL само по себе не является адекватным для диагностики, так как некоторые пациенты имеют почти нормальные уровни CL, но измененное соотношение MLCL / CL. Таким образом, измерение соотношения MLCL/CL имеет 100% чувствительность и специфичность для диагноза BTHS21. Другой проверенный метод, основанный на анализе ВЭЖХ и ESI / MS, был создан на лейкоцитах22, но сложные хроматографические методы разделения ранее извлеченных липидов и дороговизна инструментов ограничивают этот анализ несколькими клиническими лабораториями. Все эти факторы, вместе с отсутствием простого диагностического теста, способствовали недостаточной диагностике состояния.

MALDI-TOF/MS является еще одним валидным инструментом в анализе липидов23,24. Этот аналитический метод может быть использован для непосредственного получения липидных профилей различных биологических образцов, пропуская таким образом этапы экстракции и разделения 25,26,27,28,29, в том числе в тканевых срезах для приложений MS Imaging 30. Учитывая это преимущество, был разработан простой и быстрый метод диагностики BTHS путем профилирования митохондриального КЛ в интактных лейкоцитах с MALDI-TOF/MS28. Выделение лейкоцитов всего из 1 мл цельной крови путем оседания и лизиса эритроцитов является простым и не требует специального оборудования или реагентов. Кроме того, был описан протокол быстрой липидной «мини-экстракции», применимый к мельчайшим количествам лейкоцитов, чтобы гарантировать успешное получение спектров, имеющих более чистые сигналы РС с более высоким отношением сигнал/шум (S/N), чем в спектрах, полученных из интактных лейкоцитов28. Этот дальнейший шаг занимает мало времени и позволяет воспроизводить анализ даже при проведении на инструментах MS с низкой чувствительностью. Таким образом, аналитический метод, описанный здесь, требует минимальной пробоподготовки, поскольку трудоемкое и трудоемкое хроматографическое разделение липидов может быть пропущено, тем самым ускоряя тест.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Образцы крови здоровых доноров и пациентов с сердечной недостаточностью были собраны в поликлинической больнице Бари (Италия), а образцы пациентов с BTHS были получены клиникой BTHS Национальной службы здравоохранения Великобритании в Бристольской королевской больнице для детей (Великобритания). Было получено письменное информированное согласие здоровых доноров, пациентов и родителей (при необходимости) и одобрение соответствующих комитетов по этике.

ПРИМЕЧАНИЕ: Если не использовать немедленно, кровь (в гелевой пробирке K-EDTA) может храниться при 4 °C в течение 24-48 ч.

1. Выделение лейкоцитов путем декстранового осаждения эритроцитов (эритроцитов)

  1. Поместите образцы крови (в K-EDTA) на орбитальный шейкер в течение 10 минут, чтобы смешать кровь.
  2. К 0,9 мл цельной крови в пробирке объемом 1,5 мл добавляют 0,1 мл 20% раствора декстрана (молекулярная масса > 100 кДа, в 0,9% NaCl). Пипетку и рассейте суспензию осторожно 20 раз, избегая пузырьков воздуха, которые в противном случае удерживали бы эритроциты в верхней части трубки. Оставьте эритроциты отстойными в течение примерно 1 ч при комнатной температуре.
  3. Используя шприц, соберите и перенесите желтый супернатант в трубку объемом 15 мл, а затем центрифугу при 400 х г в течение 15 мин при комнатной температуре (без тормоза, ротор качающегося ковша).
  4. Откажитесь от надосадочного вещества и повторно суспендируйте гранулу, содержащую в основном лейкоциты и остаточные эритроциты, в 0,6 мл ледяной бидистиллированной воды (ddH2O).
  5. Через ~15 с добавьте 0,2 мл 0,6 МКл к клеточной суспензии для восстановления правильной осмолярности. Короткий осмотический шок лизирует эритроциты и оставляет лейкоциты нетронутыми. Отрегулируйте конечный объем до 2,5 мл с 1x PBS.
  6. Центрифуга подвески при 400 х г в течение 15 мин при комнатной температуре (без тормоза, поворотный ротор). Откажитесь от надосадочного вещества и снова промыте гранулу лейкоцитов 2,5 мл 1x PBS.
  7. Центрифуга как на шаге 1.6 и выбросьте супернатант. Повторно суспендируют гранулы, содержащие лейкоциты в 200 мкл стерилизованного ddH2O.
    ПРИМЕЧАНИЕ: По опыту авторов, это соответствует содержанию белка в диапазоне от 200 мкг до 400 мкг.
  8. Заморозьте суспензию при -80 °C или непосредственно выполните экстракцию липидов следующим образом.

2. «Мини-экстракция» липидов из изолированных лейкоцитов

  1. Перенос 20 мкл суспензии лейкоцитов (около 20-40 мкг белков) в трубку объемом 1,5 мл и вращение при 16 000 х г в течение 30 с.
  2. Откажитесь от надосадочного вещества, добавьте 10 мкл CHCl3 к оставшейся грануле и пипетку многократно, чтобы способствовать экстракции липидов.
  3. Наконец, добавляют 10 мкл матричного раствора 9-аминоакридина (9-АА) (10 мг/мл 9-АА в 2-пропаноле/ацетонитриле, 60:40 в/об)) к грануле в CHCl3. Пипетку и разогнать многократно, чтобы перемешать.
  4. Раскрутите раствор, содержащий липиды в CHCl3 и 9-AA, при 16 000 х г в течение 30 с, а затем нанесите супернатант в виде капель 0,35 мкл (три реплики для каждого образца) на мишень MALDI (пластину образца), подлежащую анализу (метод осаждения «высушенных капель»).
  5. Дайте каплям высохнуть на воздухе не менее 10-15 мин.

3. Липидный анализ maldi-TOF/MS

  1. Получение масс-спектров образцов в трех экземплярах на масс-спектрометре MALDI-TOF.
  2. После калибровки с липидными эталонами (см. Таблицу материалов) установите анализы в режим отрицательных ионов и оптимизируйте диапазон обнаружения m/z от 200 Th до 2000 Th для анализа малых молекул.
  3. Держите флюенс лазера на 5% выше порога (CL и MLCL), чтобы иметь S / N (не менее 2).
  4. Получение спектров в режиме рефлектора с помощью замедленной импульсной экстракции. Для каждого массового спектра в среднем 2000 одиночных лазерных снимков (сумма 4 х 500). Примените закрытое матричное подавление до 400 Th для предотвращения насыщения детектора.

4. Как рассчитать соотношение (MLCL + CLi)/CLm

  1. Запустите программное обеспечение прибора MALDI-TOF/MS (см. Таблицу материалов) для анализа полученных спектров.
  2. С помощью команды Открыть откройте диалоговое окно Spectrum Browser , которое позволяет выбрать и загрузить интересующий спектр.
  3. В строке меню нажмите на иконки Smooth Mass Spectrum и Subtract Mass Spectrum Baseline.
  4. Нажмите файл > Экспорт > mass Spectrum и выберите формат ASCII для экспорта спектра в виде таблицы с двумя столбцами с парами точек данных: m/z (x) и интенсивность (y). Скопируйте и вставьте координаты в программу для работы с электронными таблицами (*.xls).
  5. Повторите шаги с 4.2 по 4.4 для трех частей каждого анализируемого образца, вставив координаты в тот же программный файл электронной таблицы, как показано на рисунке 1 (шаг 1).
  6. Следуя x-диапазонам, показанным на рисунке 1 (шаг 2) для каждого перечисленного вида, рассчитайте сумму значений y1, y2 и y3 (трипликатов) с помощью функции СУММ , чтобы получить пиковую площадь (рисунок 1; Шаг 3).
  7. Выполните среднее значение тройных значений площади с помощью функции СРЗНАЧ (рисунок 1; Шаг 3).
  8. Поместите средние значения площади для каждого вида в столбец, как показано на рисунке 1 (шаг 2).
  9. Чтобы рассмотреть только первый изотополог вида CLm 72:7, как в28, рассчитайте изотопную коррекцию для перекрытия между изотопологом M + 2 CLm 72:8 и моноизотопным пиком CLm 72:7, как показано на рисунке 1 (шаг 4).
  10. Наконец, рассчитайте соотношение (MLCL + CLi)/CLm, как показано на рисунке 1 (шаг 5).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом исследовании был описан простой и быстрый метод выделения лейкоцитов из 1 мл цельной крови и получения дактилоскопии CL методом MALDI-TOF/MS (см. Рисунок 2). На рисунке 3 показано сравнение репрезентативной дактилоскопии CL лейкоцитов, полученной от контрольных субъектов и мальчиков BTHS, в диапазоне масс CL и MLCL (m/z). В таблице 1 перечислены виды CL и MLCL, обнаруженные в этих масс-спектрах.

Дефект...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Синдром Барта является врожденной ошибкой метаболизма и изменяющим жизнь состоянием, которое, вероятно, будет недодиагностировано 2,6. Как упоминалось ранее, способствующим фактором может быть отсутствие простого диагностического теста. Здесь был описан простой и быстрый метод измерения соотношения MLCL/CL по MALDI-TOF/MS в лейкоцитах для скрининга BTHS. Кроме того, масс-спектрометры MALDI-TOF широко распространены среди клинических лабораторий по всему миру...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Все авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарны людям с BTHS и их семьям за участие в нашем исследовании. Мы благодарим Фонд синдрома Барта США и Фонд синдрома Барта Великобритании за их поддержку и помощь в сборе образцов крови на ежегодном собрании в Бристоле. Это исследование финансировалось Фондом синдрома Барта США, Barth Italia Onlus и Apulia Region.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,1′,2,2′-тетрадеканоил кардиолипинAvanti Polar Lipids750332стандарт липидов для калибровки MALDI-TOF
1,1′ 2,2′-тетра- (9Z-октадеценоил) кардиолипинAvanti Polar Lipids710335Стандарт липидов для калибровки MALDI-TOF
1,2-ди- (9Z-гексадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламинAvanti Polar Lipids878130Стандарт липидов для калибровки MALDI-TOF
1,2-дитетрадканоил-sn-глицеро-3-фосфатAvanti Polar Lipids830845Стандарт липидов для калибровки MALDI-TOF
1,2-дитетрадеканоил-snglycero-3-фосфо-(1′-rac-глицерин)Avanti Polar Lipids840445Стандарт липидов для калибровки MALDI-TOF
1,2-дитетрадеканоил-sn-глицеро-3-фосфо-L-серинAvanti Полярные липиды840033стандарт липидов для калибровки MALDI-TOF
2-пропанол, реагент ACS, ≥ 99,5%Merck Life Science S.r.l.
9-аминоакридина гемигидрат, 98%Acros Organics134410010
ацетонитрил, реагент ACS и GE; 99,5%Merck Life Science S.r.l.
Хлороформ, реагент ACS и т.д.; 99,8 %Merck Life Science S.r.l.
Декстран от Leuconostoc spp. Mr 450,000-650,000Merck Life Science S.r.l.31392
Flex Analysis 3.3обеспечениеBruker Daltonics
MALDI-TOF масс-спектрометр Microflex LRFBruker Daltonics
Microsoft ExcelOfficeSoftware
OmniPur 10X PBS Жидкий концентратMerck Life Science S.r.l.6505-OP
Хлорид калия, реагент ACS, 99,0-100,5%Merck Life Science S.r.l.P3911
Хлорид натрия, реагент ACS, ≥ 99,0%Merck Life Science S.r.l.С9888
190764360457319988 Программное Microsoft

Ссылки

  1. Barth, P. G., et al. X-linked cardioskeletal myopathy and neutropenia (Barth syndrome): respiratory-chain abnormalities in cultured fibroblasts. Journal of Inherited Metabolic Disease. 19 (2), 157-160 (1996).
  2. Steward, C. G., et al. syndrome (X linked cardiac and skeletal myopathy, neutropenia, and organic aciduria): rarely recognised, frequently fatal [abstract]. Archives of Disease in Childhood. 89, 48(2004).
  3. Clarke, S. L. N., et al. Barth syndrome. Orphanet Journal of Rare Diseases. 8, 23(2013).
  4. Zegallai, H. M., Hatch, G. M. Barth syndrome: cardiolipin, cellular pathophysiology, management, and novel therapeutic targets. Molecular and Cellular Biochemistry. 476 (3), 1605-1629 (2021).
  5. Taylor, C., et al. Clinical presentation and natural history of Barth Syndrome: An overview. Journal of Inherited Metabolic Disease. 45 (1), 7-16 (2022).
  6. Miller, P. C., Ren, M., Schlame, M., Toth, M. J., Phoon, C. A. Bayesian analysis to determine the prevalence of Barth syndrome in the pediatric population. The Journal of Pediatrics. 217, 139-144 (2020).
  7. Bione, S., et al. A novel X-linked gene, G4.5. is responsible for Barth syndrome. Nature Genetics. 12 (4), 385-389 (1996).
  8. Whited, K., Baile, M. G., Currier, P., Claypool, S. M. Seven functional classes of Barth Syndrome mutation. Human Molecular Genetics. 22 (3), 483-492 (2013).
  9. Schlame, M., Ren, M., Xu, Y., Greenberg, M. L., Haller, I. Molecular symmetry in mitochondrial cardiolipins. Chemistry and Physics of Lipids. 138 (1-2), 38-49 (2005).
  10. Schlame, M., Xu, Y. The function of Tafazzin, a mitochondrial phospholipid-lysophospholipid acyltransferase. Journal of Molecular Biology. 432 (18), 5043-5051 (2020).
  11. Schlame, M., Rua, D., Greenberg, M. L. The biosynthesis and functional role of cardiolipin. Progress in Lipid Research. 39 (3), 257-288 (2000).
  12. Mileykovskaya, E., Dowhan, W. Cardiolipin membrane domains in prokaryotes and eukaryotes. Biochimica et Biophysica Acta. 1788 (10), 2084-2091 (2009).
  13. Claypool, S. M., Koehler, C. M. The complexity of cardiolipin in health and disease. Trends in Biochemical Sciences. 37 (1), 32-41 (2011).
  14. Ren, M., Phoon, C. K., Schlame, M. Metabolism and function of mitochondrial cardiolipin. Progress in Lipid Research. 55, 1-16 (2014).
  15. Paradies, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M., Petrosillo, G. Role of cardiolipin in mitochondrial function and dynamics in health and disease: Molecular and pharmacological aspects. Cells. 8 (7), 728(2019).
  16. Acoba, M. G., Senoo, N., Claypool, S. M. Phospholipid ebb and flow makes mitochondria go. The Journal of Cell Biology. 219 (8), 03131(2020).
  17. Schlame, M., et al. Phospholipid abnormalities in children with Barth syndrome. Journal of the American College of Cardiology. 42 (11), 1994-1999 (2003).
  18. Wortmann, S. B., et al. Inborn errors of metabolism with 3-methylglutaconic aciduria as discriminative feature: proper classification and nomenclature. Journal of Inherited Metabolic Disease. 36 (6), 923-928 (2013).
  19. Ikon, N., Ryan, R. O. On the origin of 3-methylglutaconic acid in disorders of mitochondrial energy metabolism. Journal of Inherited Metabolic Disease. 39 (5), 749-756 (2016).
  20. Kulik, W., et al. Bloodspot assay using HPLC-tandem mass spectrometry for detection of Barth syndrome. Clinical Chemistry. 54 (2), 371-378 (2008).
  21. Vaz, F. M., et al. An improved functional assay in blood spot to diagnose Barth syndrome using the monolysocardiolipin/cardiolipin ratio. Journal of Inherited Metabolic Disease. 45 (1), 29-37 (2022).
  22. Bowron, A., et al. Diagnosis of Barth syndrome using a novel LC-MS/MS method for leukocyte cardiolipin analysis. Journal of Inherited Metabolic Disease. 36 (5), 741-746 (2013).
  23. Sun, G., et al. Matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometric analysis of cellular glycerophospholipids enabled by multiplexed solvent dependent analyte-matrix interactions. Analytical Chemistry. 80 (19), 7576-7585 (2008).
  24. Leopold, J., Popkova, Y., Engel, K. M., Schiller, J. Recent developments of useful MALDI matrices for the mass spectrometric characterization of lipids. Biomolecules. 8 (4), 173(2018).
  25. Angelini, R., Babudri, F., Lobasso, S., Corcelli, A. MALDI-TOF/MS analysis of archaebacterial lipids in lyophilized membranes dry-mixed with 9-aminoacridine. The Journal of Lipid Research. 51 (9), 2818-2825 (2010).
  26. Angelini, R., et al. Lipidomics of intact mitochondria by MALDI-TOF MS. The Journal of Lipid Research. 53 (7), 1417-1425 (2012).
  27. Angelini, R., Vormieter, G., Corcelli, A., Fuchs, B. A fast method for the determination of PC/LPC ratio in intact horse serum by MALDI-TOF-MS: an easy-to-follow lipid biomarker of inflammation. Chemistry and Physics of Lipids. 183, 169-175 (2014).
  28. Angelini, R., et al. Cardiolipin fingerprinting of leukocytes by MALDI-TOF/MS as a screening tool for Barth syndrome. The Journal of Lipid Research. 56 (9), 1787-1794 (2015).
  29. Lobasso, S., et al. A lipidomic approach to identify potential biomarkers in exosomes from melanoma cells with different metastatic potential. Frontiers in Physiology. 12, 748895(2021).
  30. Angelini, R., et al. Visualizing cholesterol in the brain by on-tissue derivatization and quantitative mass spectrometry imaging. Analytical Chemistry. 93 (11), 4932-4949 (2021).
  31. Greco, V., et al. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical proteomics. Expert Review of Proteomics. 15 (8), 683-696 (2018).
  32. Duncan, M., DeMarco, M. L. MALDI-MS: Emerging roles in pathology and laboratory medicine. Clinical Mass Spectrometry (Del Mar, Calif). 13, 1-4 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Фингерпринтинг кардиолипиналипидный профиль лейкоцитовдетектирование монолизокардиолипинаMALDI-TOF МСлипидные биомаркерыген TAFAZZINклиническая биохимияэкстракция липидов
Дактилоскопирование кардиолипина в лейкоцитах масс-спектрометрией для быстрой диагностики синдрома Барта
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.