Этот протокол представляет собой установление глубокой гипотермической остановки кровообращения у крыс, которая может быть применена для исследования синдрома системной воспалительной реакции, ишемии / реперфузионного повреждения, окислительного стресса, нейровоспаления и т. Д.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Установление глубокого гипотермического кровообращения у крыс
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Глубокая гипотермическая остановка кровообращения (DHCA) обычно применяется во время операций по поводу сложных врожденных пороков сердца и дуги аорты. Настоящее исследование направлено на предоставление метода установления DHCA у крыс. Для оценки влияния процесса DHCA на жизненно важные показатели в качестве контроля использовалась модель крыс с нормальным температурным сердечно-легочным шунтированием (CPB) без остановки кровообращения. Как и ожидалось, DHCA привел к значительному снижению температуры тела и среднего артериального давления. Анализ газов крови показал, что DHCA повышает уровень молочной кислоты, но не влияет на рН крови и концентрации гемоглобина, гематокрита, Na+, Cl−, K+ и глюкозы. Кроме того, по сравнению с нормальной температурой CPB у крыс, результаты просвечивающей электронной микроскопии показали умеренное увеличение аутофагосом гиппокампа у крыс DHCA.
Введение
Глубокая гипотермическая остановка кровообращения (DHCA) используется в кардиохирургии с 1953 года1. DHCA включает в себя снижение температуры ядра пациента до глубоко гипотермических уровней (15-22 ° C) до глобального прерывания притока крови к телу2. Остановка кровообращения может обеспечить относительно бескровное операционное поле. Глубокая гипотермия снижает обмен веществ, особенно в головном мозге и миокарде, что является эффективным методом защиты от ишемии3. DHCA обычно применяется во время операций по поводу сложных врожденных пороков сердца, заболевания дуги аорты и даже опухолей почек или надпочечников с тромбом полой вены 4,5. Таким образом, создание животных моделей DHCA обеспечивает важный ориентир для уточнения процедуры и профилактики осложнений в клинических условиях.
Хотя модели могут быть установлены с собаками6, кроликами7 и другими животными, предпочтительно использовать крыс из-за их работоспособности и низкой стоимости. Модель крыс DHCA была впервые описана в 2006 году Jungwirth et al.8. Установлено, что продолжительность остановки кровообращения оказывает влияние на неврологические исходы. С тех пор модели крыс DHCA были широко исследованы. Было уточнено, что DHCA может провоцировать синдром системной воспалительной реакции (SIRS)9. В последующих исследованиях фармакологи обнаружили, что нейровоспаление, связанное с DHCA, индуцированное SIRS, может быть ослаблено ресвератролом10 и триптолидом11. Наша команда также обнаружила, что нейровоспаление, связанное с DHCA, может быть ослаблено путем ингибирования индуцируемого холодом РНК-связывающего белка12. В сердечно-сосудистой системе супероксиддисмутаза оказывает кардиопротекторное действие на травмы ишемии/реперфузии (I/R) во время DHCA13. Эти результаты расширили понимание патофизиологических процессов, связанных с DHCA, и предложили новые направления для улучшения результатов DHCA. Тем не менее, результаты, касающиеся эндотоксемии, окислительного стресса и аутофагии после DHCA, неубедительны. DHCA использует ту же операционную технологию, что и сердечно-легочное шунтирование (CPB)14, но его стратегия управления отличается, и шаги по генерации DHCA различаются в разных командах 8,9,10,11. Настоящее исследование направлено на предоставление метода установления процедуры DHCA у крыс.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Протоколы прошли институциональную проверку и получили одобрение От Институционального комитета по уходу за животными и их использованию, больница Фувай, Китайская академия медицинских наук (FW-2021-0005). Все экспериментальные процедуры были выполнены в соответствии с Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию, опубликованным Национальными институтами здравоохранения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Самцы крыс Sprague-Dawley (вес: 500-600 г, возраст: 12-14 недель) содержались в стандартных лабораторных условиях со свободным доступом к пище и воде. Крысы были случайным образом распределены на две группы (n = 6, каждая группа): группа DHCA и группа CPB нормальной температуры (группа NtCPB).
1. Подготовительные работы
- Стерилизуйте хирургические инструменты (щипцы, ножницы, микрощипы, электрокоагулятор, бритву и др.) перед экспериментом (рисунок 1).
- Обеспечьте доступность расходных материалов, которые включают в себя 2-0 шелка, канюлю 16 Г (эндотрахеальный катетер), канюлю 22 Г, самодельную канюлю 16 Г (многоочаговый внутривенный катетер), инъекционные шприцы, марлю и ленту.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для самодельной канюли 16 г используйте скальпель, чтобы вырезать два или три отверстия диаметром 2 мм на кончике канюли, что поможет сделать венозный дренаж более гладким. - Обеспечить наличие севофлурана, 2% лидокаина, физиологического раствора, гепарина (5 МЕ/мл, 250 МЕ/мл), адреналина (40 мкг/мл), норадреналина (20 мкг/мл), гидроксиэтилового крахмала и бикарбоната.
- Убедитесь, что контуры DHCA содержат резервуар (модифицированный из капельницы Мерфи), роликовый насос, теплообменник, мембранный оксигенатор, соединительные трубки и резервуар для воды (рисунок 2). Подключите схему и смешайте 12 мл гидроксиэтилового крахмала с 1 мл гепарина натрия (250 МЕ) и 1 мл физиологического раствора. Загрунтуйте контур 14 мл грунтовочного раствора с помощью плавно вращающегося роликового насоса (10-40 мл/мин).
ПРИМЕЧАНИЕ: Резервуар переформовывается из устройства для переливания крови с помощью капельницы Мерфи. Венозная приточная часть капельницы остается на уровне 10-15 см, а венозная выходная часть остается на уровне 10 см.
2. Анестезия и канюляция
- Обезболивают крыс 2%-3% севофлураном, а затем проверяют на отсутствие конъюнктивального рефлекса и расслабление мышц после того, как крыса потеряет сознание.
ПРИМЕЧАНИЕ: Конъюнктивальный рефлекс относится к мгновенному закрытию века всякий раз, когда касается роговицы. Используйте ватный тампон, чтобы слегка коснуться роговицы. Когда глубина анестезии достаточна, веки не будут закрываться. - Выполняют эндотрахеальную интубацию канюлей 16 Г после исчезновения конъюнктивального рефлекса и отсутствия мышечного сопротивления. Подключите трубку к вентилятору и установите параметры, нажав кнопки на вентиляторе (дыхательный объем: 1,0-1,2 мл / 100 г, частота сердечных сокращений: 80 ударов в минуту [уд/мин], I:E = 1:1, фракция вдыхаемого кислорода: 60%).
- Подложите под крысу электрическое нагревательное одеяло и зафиксируйте крысу скотчем. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость. Сбрить волосы на левой паховой области, правой шейной области и хвосте бритвой. Затем трижды продезинфицируйте кожу йодом и спиртом.
- Проверьте глубину анестезии, прежде чем переходить к следующим шагам. Если частота дыхания выше, чем установленная вентилятором (80 уд/мин), или если есть мышечная ригидность, то увеличивают выходную концентрацию севофлурана.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда глубина анестезии адекватна, дыхательный ритм должен быть синхронизирован с вентилятором, а мышцы должны быть полностью расслаблены без напряжения. Проверяйте глубину анестезии каждые 30 минут, чтобы убедиться, что крыса не испытывает никакого возвращения сознания на протяжении всей процедуры. - Используйте скальпель, чтобы разрезать кожу в левой паховой области (примерно 1 см) и мягко рассечь мышцы и ткани, чтобы обнажить левую бедренную вену и артерию. Отделите артерию тщательно.
- Каннулировать 22 г внутривенного катетера в левую бедренную артерию. Обжиг артерии и катетера с помощью 2-0 шелка (в области канюляции). Используйте физиологический раствор, содержащий гепарин (5 UI / мл), чтобы промыть канюлю, чтобы избежать свертывания. Подключите катетер к датчику давления для контроля артериального давления.
- Отрежьте кожу хвоста (примерно 1,5 см), а затем с помощью скальпеля перережьте поверхностную фасцию хвостовой артерии, чтобы обнажить хвостовую артерию, которая находится в середине хирургического поля.
- Каннулировать хвостовую артерию внутривенным катетером весом 22 г. Обжиг артерии и катетера с помощью 2-0 шелка (в области канюляции). Используйте физиологический раствор, содержащий гепарин (5 UI / мл), чтобы промыть катетер, чтобы избежать свертывания.
ПРИМЕЧАНИЕ: При канюляции внутривенного катетера левая рука удерживает артерию / вену щипцами, а правая рука прокалывает артерию / вену иглой внутри катетера, а затем вводит канюлю в артерию. - Отрежьте кожу на правой яремной вене (примерно 2 см), а затем отделите мышцу и ткань, чтобы обнажить вену. Вставьте самодельный многоочаговый внутривенный катетер весом 16 г в правую наружную яремную вену и осторожно поместите его в правую нижнюю полую вену или правое предсердие.
ПРИМЕЧАНИЕ: Левая бедренная вена и артерия находятся под поверхностью левой паховой области. Вена толще артерии, а цвет крови артерий ярко-красный. Правая яремная вена находится посередине правого шейного отдела; когда кожа разрезана и мышцы разделены, можно увидеть вену (примерно 0,3-0,4 см шириной). Когда кончик катетера коснется правого предсердия, волна артериального давления будет колебаться. Затем, немного оттянув катетер назад, кончик катетера окажется в верхней полой вене. - Вводят гепарин натрия (500 МЕ/кг) через правую наружную вену. Накройте каждую канюлированную область влажной марлей, чтобы избежать загрязнения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поставьте коробку под операционный стол, чтобы поднять ее примерно на 40 см.
3. Инициация DHCA
- Сначала соедините контур DHCA с катетером в хвостовой артерии и поддерживайте скорость потока насоса на уровне 1-2 мл / мин. Затем соедините резервуар с катетером в правой наружной яремной вене. Убедитесь, что в резервуаре всегда есть уровень крови около 1 см.
- Включите бак для воды и сначала установите температуру воды на уровне 37 °C.
- После того, как артериальное давление стабилизируется, осторожно увеличьте поток насоса до 80-100 мл / кг / мин, чтобы перекачать кровь.
4. Охлаждение
- Установите температуру в помещении около 20 °C. Положите кубики льда в одноразовые перчатки, а затем положите их на голову и бока крысы. Отрегулируйте температуру резервуара в режиме реального времени в соответствии с ректальной температурой крыс.
- Соберите 0,1 мл крови из левой бедренной артерии и поместите ее на газовую машину крови для анализа газов крови. Изменяйте соответствующие параметры вентилятора соответствующим образом в соответствии с результатами анализа газов крови (например, PaCO2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Частота сердечных сокращений и кровяное давление могут измениться, и скорость потока насоса должна быть соответствующим образом скорректирована. Градиент температуры между резервуаром для воды и крысой должен быть менее 10 °C. Убедитесь, что температура может быть снижена до 15-20 °C в течение 30 минут. Нормальный диапазон PaCO2 составляет 35-45 мм рт.ст. Если результаты анализа газов крови показывают более низкий PaCO2, можно уменьшить дыхательный объем и наоборот.
5. Глубокая гипотермическая остановка кровообращения
- Когда ректальная температура опустится до 15-20 °C, смените одноразовые перчатки (содержащие лед) для обеспечения поддержания глубокого переохлаждения во время остановки кровообращения.
- Остановите роликовый насос, поддерживайте резервуар в контакте с окружающей средой и медленно сливайте кровь из наружной яремной вены в резервуар.
- Обратите внимание на форму сигнала артериального давления. Когда кровяное давление и частота сердечных сокращений равны 0, остановите дренаж и держите резервуар закрытым. Выключите вентилятор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность остановки кровообращения варьируется в зависимости от цели эксперимента.
6. Разминка и реперфузия
- Снимите все одноразовые перчатки и увеличьте температуру в помещении до 25 °C. Восстановите вентиляцию мембранного оксигенатора, сохраняя при этом обрезание венозной дренажной трубки. Включите роликовый насос, чтобы убедиться, что кровь в резервуаре медленно возвращается в тело крысы.
- Включите вентилятор. Как только уровень крови в водоеме останется на уровне 1 см, ослабьте дренажную трубку, и медленно сливайте кровь из правого предсердия в водоем.
- Включите нагревательную лампу, грелку и бак для воды. Сначала установите температуру резервуара для воды на 25 °C, а затем своевременно отрегулируйте температуру на выходе в соответствии с ректальной температурой крысы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нагревательная лампа должна быть направлена на крупные кровеносные сосуды в грудной полости крысы, и ее следует держать на определенном расстоянии, чтобы избежать ожога тканей. Обратите внимание на разницу температур между температурой на выходе и ректальной температурой крысы (<10 °C). При необходимости проверяют газ крови, а затем соответствующим образом корректируют параметры вентилятора, вводят бикарбонат, электролиты и т.д. - Снимите нагревательную лампу после того, как ректальная температура вернется к 34 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг, как продолжение быстрого процесса повторного нагрева, должен быть медленным. На этом этапе параметры оборудования испарителя севофлурана, механического вентилятора и роликового насоса могут быть восстановлены до уровней в начале CPB.
7. Отлучение от КПБ
- Медленно и постепенно уменьшайте расход роликового насоса и регулируйте скорость венозного дренажа до тех пор, пока скорость потока не уменьшится до 1 мл/мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая регулировка расхода должна соблюдаться в течение 3-5 мин. - Поддерживайте контакт резервуара с окружающей средой (снимая крышку резервуара). Настаивают оставшуюся кровь в контуре со скоростью потока 1 мл/мин.
- Остановите мембранную оксигенацию и роликовый насос.
- Усыпить крысу после периода искусственной вентиляции легких под глубоким наркозом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это терминальная процедура. Продолжительность между отлучением от CPB и эвтаназией варьируется в зависимости от различных протоколов исследования. Не забудьте продезинфицировать раны йодом и спиртом, а затем покрыть каждую канюлированную область влажной марлей, чтобы избежать загрязнения перед эвтаназией. Увеличивают выходную концентрацию севофлурана для увеличения глубины анестезии.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Как и контрольная группа, крысы с нормальной температурой CPB (NtCPB) без остановки кровообращения показали стабильное среднее артериальное артериальное давление (MAP) и температуру тела в течение всей процедуры, в то время как MAP крыс DHCA снижался во время остановки сердца (p < 0,01, рисунок 3A). Температура крыс DHCA быстро снижалась во время фазы охлаждения и постепенно восстанавливалась во время фазы согревания. При отлучении крыс от контуров DHCA температура крыс DHCA верн...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Каннуляция является наиболее фундаментальной процедурой для установления DHCA у крыс. Перед канюляцией замачивание артерии 0,5 мл 2% лидокаина облегчит канюляцию. После каннуляции необходима гепаринизация 500 МЕ/кг гепарина через наружную яремную вену, чтобы избежать образования микротромбов17. Мы неоднократно обнаруживали, что эта доза гепарина может достичь цели активированного времени свертывания (ACT) >480 с. Период согревания является самой сложной частью. Потребовалось более 60 мину...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы благодарят Лян Чжана за помощь в сборе видеоданных во время эксперимента. Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (номер гранта: 82070479) и Фондами фундаментальных исследований для центральных университетов (номер гранта: 3332022128).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Теплообменник | Xi' An Xijing Medical Appliance Co., Ltd | Animal-M | |
| Dongguan Kewei Medical Instrument Co., Ltd. | Монитор Micro-M | ||
| Chengdu Techman Co., Ltd | BL-420s Роликовый | ||
| насос | Changzhou Prefluid Technology Co., Ltd | BL100 | |
| SD Rat | HFK Bioscience Co., Ltd. | / | |
| Севофлуран | Maruishi Pharmaceutical Co. Ltd | H20150020 | |
| Shaver Hangzhou Huayuan Pet Products Co., Ltd. | / | ||
| Испаритель | SPACECABS/ | ||
| Вентилятор | Shanghai Alcott Biotech Co., Ltd | ALC-V8S | |
| Бак для воды | Maquet Critical Care AB | Jostra HCU20-600 |
Ссылки
- Lewis, F. J., Taufic, M. Closure of atrial septal defects with the aid of hypothermia; experimental accomplishments and the report of one successful case. Surgery. 33 (1), 52-59 (1953).
- Miler, R. D., et al. Miller's Anesthesia., eighth edition. , Saunders. Philadephia, US. (2015).
- Gocoł, R., et al. The role of deep hypothermia in cardiac surgery. International Journal of Environmental Research and Public Health. 18 (13), 7061(2021).
- Zhu, P., et al. The role of deep hypothermic circulatory arrest in surgery for renal or adrenal tumor with vena cava thrombus: A single-institution experience. Journal of Cardiothoracic Surgery. 13 (1), 85(2018).
- Poon, S. S., Estrera, A., Oo, A., Field, M. Is moderate hypothermic circulatory arrest with selective antegrade cerebral perfusion superior to deep hypothermic circulatory arrest in elective aortic arch surgery. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 23 (3), 462-468 (2016).
- Giuliano, K., et al. Inflammatory profile in a canine model of hypothermic circulatory arrest. Journal of Surgical Research. 264, 260-273 (2021).
- Wang, Q., et al. Hyperoxia management during deep hypothermia for cerebral protection in circulatory arrest rabbit model. ASAIO Journal. 58 (4), 330-336 (2012).
- Jungwirth, B., et al. Neurologic outcome after cardiopulmonary bypass with deep hypothermic circulatory arrest in rats: Description of a new model. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 131 (4), 805-812 (2006).
- Engels, M., et al. A cardiopulmonary bypass with deep hypothermic circulatory arrest rat model for the investigation of the systemic inflammation response and induced organ damage. Journal of Inflammation. 11, 26(2014).
- Chen, Q., Sun, K. P., Huang, J. S., Wang, Z. C., Hong, Z. N. Resveratrol attenuates neuroinflammation after deep hypothermia with circulatory arrest in rats. Brain Research Bulletin. 155, 145-154 (2020).
- Chen, Q., Lei, Y. Q., Liu, J. F., Wang, Z. C., Cao, H. Triptolide improves neurobehavioral functions, inflammation, and oxidative stress in rats under deep hypothermic circulatory arrest. Aging. 13 (2), 3031-3044 (2021).
- Liu, M., et al. A novel target to reduce microglial inflammation and neuronal damage after deep hypothermic circulatory arrest. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 159 (6), 2431-2444 (2020).
- Pinto, A., et al. The extracellular isoform of superoxide dismutase has a significant impact on cardiovascular ischaemia and reperfusion injury during cardiopulmonary bypass. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 50 (6), 1035-1044 (2016).
- Hirao, S., Masumoto, H., Itonaga, T., Minatoya, K. A recovery cardiopulmonary bypass model without transfusion or inotropic agents in rats. Journal of Visualized Experiments. (133), e56986(2018).
- Ha, J. Y., Kim, J. S., Kim, S. E., Son, J. H. Simultaneous activation of mitophagy and autophagy by staurosporine protects against dopaminergic neuronal cell death. Neuroscience Letters. 561, 101-106 (2014).
- Yamamoto, A., Yue, Z. Autophagy and its normal and pathogenic states in the brain. Annual Review of Neuroscience. 37, 55-78 (2014).
- You, X. M., et al. Rat cardiopulmonary bypass model: Application of a miniature extracorporeal circuit composed of asanguinous prime. Journal of Extra-Corporeal Technology. 37 (1), 60-65 (2005).
- Chen, Q., Lei, Y. Q., Liu, J. F., Wang, Z. C., Cao, H. Beneficial effects of chlorogenic acid treatment on neuroinflammation after deep hypothermic circulatory arrest may be mediated through CYLD/NF-κB signaling. Brain Research. 1767, 147572(2021).
- Li, Y. A., et al. Differential expression profiles of circular RNAs in the rat hippocampus after deep hypothermic circulatory arrest. Artificial Organs. 45 (8), 866-880 (2021).
- Linardi, D., et al. Slow versus fast rewarming after hypothermic circulatory arrest: effects on neuroinflammation and cerebral oedema. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 58 (4), 792-780 (2020).
- Engelman, R., et al. The Society of Thoracic Surgeons, The Society of Cardiovascular Anesthesiologists, and The American Society of ExtraCorporeal Technology: Clinical practice guidelines for cardiopulmonary bypass--Temperature management during cardiopulmonary bypass. Annals of Thoracic Surgery. 100 (2), 748-757 (2015).
- Jenke, A., et al. AdipoRon attenuates inflammation and impairment of cardiac function associated with cardiopulmonary bypass-induced systemic inflammatory response syndrome. Journal of the American Heart Association. 10 (6), 018097(2021).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
