Методическая статья

Использование инъекции клеточного индикатора для исследования происхождения неоинтимообразующих клеток в модели мешковидной боковой стенки крысы

1.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63580

⸱

16 марта 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, Kantonsspital Aarau, 2Cerebrovascular Research Group, Department for BioMedical Research, University of Bern, 3Institute of Pathology Laenggasse, 4Department of Neurosurgery, Neurocenter and Regenerative Neuroscience Cluster, Inselspital, Bern University Hospital, University of Bern, 5Faculty of Medicine, University of Bern

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы выполнили одноточечную инъекцию липофильного индикатора клеток для отслеживания эндотелиальных клеток, после чего последовала артериотомия и наложение швов аневризм боковой стенки на брюшную аорту крыс. Образование неоинтимы, по-видимому, зависело от родительской артерии в децеллюляризованных аневризмах и стимулировалось набором из клеток стенки аневризмы в жизненно важные клеточные стенки.

Аннотация

Микрохирургическое обрезание создает последующий барьер кровотока в внутричерепные аневризмы, тогда как эндоваскулярное лечение опирается на образование неоинтимы и тромба. Источник эндотелиальных клеток, покрывающих эндолюминальный слой неоинтимы, остается неясным. Поэтому целью настоящего исследования было исследование происхождения неоинтимообразующих клеток после инъекции клеточного индикатора в уже хорошо зарекомендовавшей себя модели микрохирургической аневризмы боковой стенки крыс в Хельсинки.

Аневризмы боковых стенок были созданы путем наложения швов децеллюляризированных или жизненно важных артериальных мешочков из стороны в сторону к аорте у самцов крыс Льюиса. Перед артериотомией со швом аневризмы в зажатую аорту была выполнена инъекция клеточного индикатора, содержащая краситель CM-Dil, для маркировки эндотелиальных клеток в соседнем сосуде и отслеживания их пролиферации во время наблюдения (FU). Лечение с последующим намоткой (n = 16) или стентированием (n = 15). В FU (7 дней или 21 день) все крысы прошли флуоресцентную ангиографию с последующим сбором аневризмы и макроскопической и гистологической оценкой с иммуногистологическим количеством клеток для конкретных областей, представляющих интерес.

Ни одна из 31 аневризмы не разорвалась при последующем наблюдении. Четыре животных умерли преждевременно. Макроскопически остаточная перфузия наблюдалась у 75,0% спиральных и 7,0% стентированных крыс. Количество клеточно-индикатор-положительных клеток было значительно повышено в децеллюляризированном стентированном стентировании по сравнению с спиральными аневризмами по отношению к тромбу на 7-й день (p = 0,01) и неоинтиме на 21-й день (p = 0,04). Не было обнаружено существенных различий в тромбе или неоинтиме при жизненно важных аневризмах.

Эти результаты подтверждают худшие закономерности заживления в спиральных по сравнению со стентированными аневризмами. Образование неоинтимы, по-видимому, особенно зависит от родительской артерии в децеллюляризированных аневризмах, тогда как оно поддерживается рекрутацией из клеток стенки аневризмы в жизненно важные клеточные стенки. С точки зрения трансляции, лечение стентом может быть более подходящим для сильно дегенеративных аневризм, тогда как одна только спираль может быть адекватной для аневризм с в основном здоровыми стенками сосудов.

Введение

Субарахноидальное кровоизлияние, вызванное разрывом внутричерепной аневризмы (ИА), является разрушительным нейрохирургическим состоянием, связанным с высокой заболеваемостью и смертностью 1,2,3,4. В дополнение к микрохирургическому клипированию, которое обеспечивает прямой контакт эндотелия с эндотелием, эндоваскулярные устройства приобретают все большее значение за последние десятилетия для лечения разорванных и случайно обнаруженных МА. Реакция заживления в эндоваскулярно обработанных ИА в основном зависит от образования неоинтимы и организации тромба. Оба являются синергетическими процессами, зависящими от миграции клеток из соседнего сосуда и стенки аневризмы. 5 На сегодняшний день происхождение эндотелиальных клеток в неоинтиме образование эндоваскулярных обработанных аневризм остается неясным. В литературе продолжаются споры об источнике, из которого набираются неоинтимообразующие клетки.

Используя клеточно-индикаторную инъекцию красителя CM-Dil (см. Таблицу материалов) в брюшную аорту крыс, мы стремились проанализировать роль эндотелиальных клеток, происходящих из родительской артерии, в формировании неоинтимы в двух разных точках времени FU (день 7 и день 21) (рисунок 1). Преимуществом модели является прямая локальная инкубация индикатора клеток in vivo в родительской артерии до шва аневризмы, что позволяет FU в более поздние моменты времени. Методы инъекций in vivo , такие как инкубация клеточного индикатора, не были описаны в литературе. Преимуществом этой методики является прямая, одноточечная, интраоперационная, in vivo инъекция, что делает модель надежной и воспроизводимой.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Ветеринарная поддержка осуществлялась в соответствии с институциональными руководящими принципами. Эксперименты были одобрены Местным комитетом по этике, Швейцария (BE 60/19). Руководящие принципы ARRIVE и принципы 3R строгособлюдаются 6,7. Тридцать один самец крыс Льюиса, 12 недель и весом 492 ± 8 г, были включены. Разводят всех крыс при комнатной температуре 23 °C и 12-часовом цикле свет/темнота. Обеспечьте свободный доступ к воде и пеллетам. Статистический анализ был выполнен с использованием непараметрического теста Уилкоксона-Манна-Уитни U. Значения вероятности (p) ≤ 0,05 и/или ≤ 0,01 были признаны значимыми.

1. Предоперационная фаза - общая подготовка и анестезиологические аспекты

  1. Рандомизируйте крыс в группы обработки катушки или стента (рисунок 2) с помощью веб-системы рандомизации. Теперь проведите предоперационное клиническое обследование всех животных, запланированных к операции, рядом с тихой, асептической операционной, поддерживающей комнатную температуру 23 ± 3 °C. Анализ поведения животных и осмотр слизистых оболочек и тургора в рамках предоперационного клинического обследования.
  2. Запишите вес каждого животного.
  3. Перед операцией инкубируют артериальные мешочки крыс-доноров в 0,1% додецилсульфата натрия в течение 10 ч при 37 °C для получения децеллюляризованных аневризм8. Соберите эти мешочки с животных-доноров за несколько дней до операции.
    1. Подготовьте по всей длине брюшную аорту микросубсидами и щипцами и нанесите 6-0 нерассасывающихся лигатур с интервалом 3-4 мм.
    2. Непосредственно генерировать жизненно важные аневризмы интраоперационно с помощью ранее перевязанного мешочка артериального сосуда из грудной части животного-донора9. Выполните торакотомию ножницами и хирургическими щипцами в указанном моменте времени ФУ и обжарьте сосуд мешочек на нужную длину.
  4. Непосредственно имплантируйте мешочек в реципиента и соберите аневризму у животного-донора для дальнейшего макроскопического анализа и гистологической обработки.
  5. Для индукции анестезии поместите всех крыс в чистую коробку, обеспеченную кислородом (О2), до потери сознания через 5-10 мин. Анестезируют крыс подкожной (SC) инъекцией смеси фентанила 0,005 мг/кг, медетомидина 0,15 мг/кг и мидазолама 2 мг/кг.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечивает хирургическую плоскость не менее 45 минут.
  6. Проверьте глубину анестезии по отсутствию рефлекса снятия педали.
  7. Поместите крыс в лежачее положение и побрейте торакоабдоминальную часть электробритвой.
  8. Зафиксируйте 4 лапы крыс лентой на доске, покрытой грелкой, соединенной с авторегуляционным ректальным зондом. Вставьте ректальный зонд в анус крысы для поддержания нужной температуры 37 °C с помощью грелки.
  9. Теперь установите датчик на правой задней ноге, подключенный к компьютеризированной системе для интраоперационной проверки жизненно важных показателей.
  10. Накройте нос и рот крысы маской для лица. Если требуется длительная анестезия, начинают изофлуран (1,0-2,0% титруют для эффекта в 100%O2).
  11. Продезинфицируйте хирургическое поле повидоном-йодом или чередующимися дезинфицирующими средствами и задрапируйте хирургическое поле стерильным способом.
  12. Для перианестетической помощи нанесите стерильную офтальмологическую смазку на глаза и накройте их непрозрачной фольгированной маской, чтобы предотвратить высыхание и повреждение от хирургической лампы.
  13. На протяжении всей операции непрерывно подавайте кислород через маску для лица, контролируйте температуру тела и поддерживайте тепло с помощью грелки, поддерживая нормотермию.
  14. Непрерывно контролируйте другие жизненно важные показатели (пульс и растяжение дыхания, частоту сердечных сокращений и дыхания, а также насыщение кислородом).

2. Оперативная фаза - инъекция клеточного индикатора

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробный хирургический подход в модели9 микрохирургической аневризмы боковой стенки крыс в Хельсинки и методы имплантации катушек и стентов описаны в другом месте 8,10,11.

  1. Храните флуоресцентный липофильный индикатор клеток при ≤ -20 °C все время, защищенный от света.
  2. Выполняют операцию путем подготовки аорты крысы и кавальной вены с последующим отделением обоих, а также проксимальным и дистальным временным зажимом аорты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта техника была описана ранее9.
    1. Зажмите проксимальную и дистальную части аорты двумя временными титановыми зажимами.
  3. Поместите один микросваб с фиолетовой прокладкой каждый под проксимальную и дистальную части аорты для лучшей визуализации артерии.
  4. Теперь защитите живот мокрой марлей.
  5. В день операции растворяют 2 мкл индикатора клеток путем пипетирования в 1 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).
  6. Переложите смесь на шприц объемом 1 мл, снабженный стерильной канюлей весом 27-1/2 г (0,4 x 13 мм).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы избежать воздействия света при выполнении шагов 2.5 и 2.6.
  7. Выключите свет в операционной. Глядя под микроскоп, выполните одноточечную инъекцию в среднюю вентральную часть аорты с помощью микрощипцов и осторожно введите 1 мл гепаринизированного 0,9% физиологического раствора.
  8. Осторожно введите индикатор клеток (Видео 1) и немедленно выключите работающий микроскоп. Опять же, защитите живот мокрой марлей.
  9. Дайте красителю инкубировать не менее 15 минут. После инкубационного периода включите микроскоп и подсветку операционной.
  10. Выполняют продольную артериотомию и наложение швов аневризмы, как описано в другом месте11.
    1. Используйте микрофорфорсы и микросубчики для выполнения артериотомии так, чтобы ее длина усредняла диаметр собранной аневризмы (шаг 1.3). Чтобы обеспечить правильную длину, поместите аневризму рядом с аортой перед выполнением артериотомии. Зашить аневризму 8-10 одиночными швами с помощью нерассасывающегося шва 10-0 и аккуратно снять временные зажимы, начинающиеся дистально, под непрерывным орошением гепаринизированным физиологическим раствором. Закройте рану послойным способом. Следует отметить, что используйте катушку плотности упаковки 1 см.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Методика спиральной или стент-имплантации была описана в другом месте 8,10.

3. Послеоперационный фазовый мониторинг и обезболивающий уход

  1. В конце операции отмените анестезию инъекционной смесью SC бупренорфина 0,05 мг/кг, атипамезола 0,75 мг/кг и флумазенила 0,2 мг/кг. Пусть каждое эксплуатируемое животное выздоровеет в чистой клетке до полного бодрствования и тепла, по мере необходимости, с помощью нагревательной лампы.
  2. В течение 3 дней вводят 1 мг/кг мелоксикама (одна инъекция или пероральное применение в день) и бупренорфин (0,05 мг/кг четыре раза в день) SC. На ночь вводят бупренорфин непрерывно в питьевую воду с той же дозировкой: 6 мл бупренорфина 0,3 мг/мл, 360 мл питьевой воды, 10 мл 5% глюкозы.
  3. В непосредственной послеоперационной фазе поместите каждое животное в одну клетку для защиты. Перегруппируйте животных через 24 ч.
  4. Если какая-либо крыса демонстрирует дистрессное или агрессивное поведение после инъекции СК, вводите бупренорфин в питьевую воду в течение дня.
  5. Обеспечьте мягкое кормление на полу клетки для поддержки кормления и восстановления после операции.
  6. Наблюдайте и ухаживайте за всеми животными в соответствии с таблицей оценки благополучия и боли.
  7. При необходимости вводят спасательную анальгезию SC (мелоксикам 1 мг/кг и 0,05 мг/кг бупренорфина).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В лабораторных условиях было включено в общей сложности 31 животное: 27 крыс были включены в окончательный статистический анализ; 4 крысы умерли преждевременно (смертность 12,9%). Интраоперационно растяжение дыхания было значительно снижено (p = 0,03) у стент- (12,9 мкм ± 0,7) по сравнению с крысами, обработанными катушками (13,5 мкм ± 0,6). Флуоресцентная ангиография проводилась для каждой крысы в конце финального FU. Реперфузия была показана у всех 6 животных, обработанных катушками, тогда как реперфузия наблю...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Это исследование показывает, что образование неоинтимы опосредовано эндотелиальными клетками, происходящими из родительской артерии комплекса аневризмы, но поддерживается набором клеток, полученных из стенки аневризмы в жизненно важных аневризмах. Тем не менее, роль циркулирующих клеток-предшественников в заживлении аневризмы остается спорной12,13. В целом, 31 самец крысы Льюиса был включен в это исследование; только 4 умерли преждевременно (12,9% смертности).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы несут единоличную ответственность за разработку и проведение представленного исследования и заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Авторы благодарят Алессандру Бергадано, DVM, PhD, за целенаправленный надзор за долгосрочным здоровьем животных. Эта работа была поддержана исследовательскими фондами Исследовательского совета, Kantonsspital Aarau, Aarau, Швейцария, и Швейцарского национального научного фонда SNF (310030_182450).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
3-0 рассасывающийся шовный материалEthicon Inc., СШАVCP428G
4-0 нерассасывающийся шовный материалB. Braun, ГерманияG0762563
6-0 нерассасывающийся шовный материалB. Braun, ГерманияC0766070
9-0 нерассасывающийся шовный материалB. Braun, ГерманияG1111140
AtipamezolArovet AG, Швейцария
Полосовой фильтр синийThorlabsFD1Bлюбой другой
Полосовой фильтр зеленыйThorlabsFGV9любой другой
Биполярные щипцылюбой другой
Велосипедный прожекторлюбой другой
Доска (20 х 10 см)любой другой
BuprenorphineIndivior, Швейцария1014197
ФотоаппаратSony NEX-5R, Sony, Токио, Япония
Canjula (27-1/2 G)любое другое
программное обеспечение для подсчета клетокImage-J версии 1.52n, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, США, https://imagej.nih.gov/ij/
CellTracker CM-Dil dyeThermoFisher SCIENTIFIC, СШАC7000
Coil-DeviceStyker, Каламазу, Мичиган, США2 см Target 360 TM Ultra, диаметром 2 мм
Дезинфекциялюбой другой
Глазная смазкалюбой другой
ФентанилSintetica, S.A., Швейцария98683любой дженерик
ФлумазенилLabatec-Pharma, Switerzland
FluoresceineCuratis AG5030376любой
универсальный флуоресцентный микроскопOlympus BX51, Гамбург, Германия; Программное обеспечение Cell Sens Dimension Imaging v1.8
Фольгированная маскалюбая другая
глюкоза (5%)любая другая
грелкаГомеотермический блок управления, Гарвард, Эденбридж, Англиялюбой другой
изотонический раствор хлорида натрия (0,9%)Fresenius KABI336769любой дженерик
Изофлуранлюбой дженерик
Longuettesлюбой другой
MeloxicamBoehringer IngelheimP7626406любой дженерик
MedetomidineVirbac, ШвейцарияQN05CM91
Микро иглодержательлюбой другой
MidazolamRoche, Швейцария
Мониторинг-системаStarr Life Sciences Corp., 333 Allegheny Ave, Oakmont, PA 15139, Соединенные Штаты
Иглодержательлюбой другой
O2-Face маскалюбой другой
Операционный микроскопOPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Германиялюбой другой
Кислородлюбой другой
Ректальный температурныйлюбой другой
СкальпеллSwann-Morton210любой другой
Бритвалюбой другой
Смартфонлюбой другой
Додецилсульфат натрия (0.1%)Sigma-Aldrich11667289001
Soft feedEmeraid Omnivoreлюбой общий
Щипцыдля мягких тканейлюбой другой
Разбрасывательлюбой другой
Губчатые чашилюбой другой
Стент-аппаратBiotroni, Bü lach, Швейцариямодифицированный аппарат magmaris, AMS с полимерным покрытием, длина 6 мм, диаметр 2 мм
Стерильные микротампонылюбые другие
Прямые и изогнутые микрощипцылюбые другие
Прямые и изогнутые микроножницылюбые другие
Прямые и изогнутые щипцылюбые другие
Хирургические простынилюбые другие
хирургическиелюбые другие
шприцы 1 мл, 2 мл и 5 мллюбая другая
ленталюбая другая
аппликатор сосудистых зажимовB. Braun, ГерманияFT495T
Yasargil titan стандартный зажим (2x)B. Braun Medical AG, Эскулап, ШвейцарияFT242Tвременно
зонд для мелких животных мягких тканей из нержавеющей стали ножницы

Ссылки

  1. Vergouwen, M. D., et al. Definition of delayed cerebral ischemia after aneurysmal subarachnoid hemorrhage as an outcome event in clinical trials and observational studies: proposal of a multidisciplinary research group. Stroke. 41 (10), 2391-2395 (2010).
  2. Macdonald, R. L., et al. Preventing vasospasm improves outcome after aneurysmal subarachnoid hemorrhage: rationale and design of CONSCIOUS-2 and CONSCIOUS-3 trials. Neurocritical Care. 13 (3), 416-424 (2010).
  3. Wanderer, S., et al. Levosimendan as a therapeutic strategy to prevent neuroinflammation after aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Journal of Neurointerventional Surgery. , (2021).
  4. Wanderer, S., et al. Aspirin treatment prevents inflammation in experimental bifurcation aneurysms in New Zealand White rabbits. Journal of Neurointerventional Surgery. 14 (2), 189-195 (2021).
  5. Gruter, B. E., et al. Patterns of neointima formation after coil or stent treatment in a rat saccular sidewall aneurysm model. Stroke. 52 (3), 1043-1052 (2021).
  6. Kilkenny, C., et al. Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines. British Journal of Pharmacology. 160 (7), 1577-1579 (2010).
  7. Tornqvist, E., et al. Strategic focus on 3R principles reveals major reductions in the use of animals in pharmaceutical toxicity testing. PLoS One. 9 (7), 101638(2014).
  8. Nevzati, E., et al. Aneurysm wall cellularity affects healing after coil embolization: assessment in a rat saccular aneurysm model. Journal of Neurointerventional Surgery. 12 (6), 621-625 (2020).
  9. Marbacher, S., et al. The Helsinki rat microsurgical sidewall aneurysm model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51071(2014).
  10. Nevzati, E., et al. Biodegradable magnesium stent treatment of saccular aneurysms in a rt model - introduction of the surgical technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56359(2017).
  11. Gruter, B. E., et al. Testing bioresorbable stent feasibility in a rat aneurysm model. Journal of Neurointerventional Surgery. 11 (10), 1050-1054 (2019).
  12. Kadirvel, R., et al. Cellular mechanisms of aneurysm occlusion after treatment with a flow diverter. Radiology. 270 (2), 394-399 (2014).
  13. Li, Z. F., et al. Endothelial progenitor cells contribute to neointima formation in rabbit elastase-induced aneurysm after flow diverter treatment. CNS Neuroscience & Therapeutics. 19 (5), 352-357 (2013).
  14. Marbacher, S., et al. Intraluminal cell transplantation prevents growth and rupture in a model of rupture-prone saccular aneurysms. Stroke. 45 (12), 3684-3690 (2014).
  15. Frosen, J., et al. Contribution of mural and bone marrow-derived neointimal cells to thrombus organization and wall remodeling in a microsurgical murine saccular aneurysm model. Neurosurgery. 58 (5), 936-944 (2006).
  16. Marbacher, S., Niemela, M., Hernesniemi, J., Frosen, J. Recurrence of endovascularly and microsurgically treated intracranial aneurysms-review of the putative role of aneurysm wall biology. Neurosurgical Review. 42 (1), 49-58 (2019).
  17. Frosen, J. Smooth muscle cells and the formation, degeneration, and rupture of saccular intracranial aneurysm wall--a review of current pathophysiological knowledge. Translational Stroke Research. 5 (3), 347-356 (2014).
  18. Fang, X., et al. Bone marrow-derived endothelial progenitor cells are involved in aneurysm repair in rabbits. Journal of Clinical Neuroscience. 19 (9), 1283-1286 (2012).
  19. Morel, S., et al. Sex-related differences in wall remodeling and intraluminal thrombus resolution in a rat saccular aneurysm model. Journal of Neurosurgery. , 1-14 (2019).
  20. Gruter, B. E., et al. Fluorescence video angiography for evaluation of dynamic perfusion status in an aneurysm preclinical experimental setting. Operative Neurosurgery. 17 (4), 432-438 (2019).
  21. Marbacher, S., Strange, F., Frosen, J., Fandino, J. Preclinical extracranial aneurysm models for the study and treatment of brain aneurysms: A systematic review. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (5), 922-938 (2020).
  22. Ravindran, K., et al. Mechanism of action and biology of flow diverters in the treatment of intracranial aneurysms. Neurosurgery. 86, Suppl 1 13-19 (2020).
  23. Marbacher, S., et al. Loss of mural cells leads to wall degeneration, aneurysm growth, and eventual rupture in a rat aneurysm model. Stroke. 45 (1), 248-254 (2014).
  24. Morosanu, C. O., et al. Neurosurgical cadaveric and in vivo large animal training models for cranial and spinal approaches and techniques - systematic review of current literature. Neurologia i Neurochirurgia Polska. 53 (1), 8-17 (2019).
  25. Wanderer, S., et al. Arterial pouch microsurgical bifurcation aneurysm model in the rabbit. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61157(2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи