Методическая статья

Получение и характеристика 3D-биогибридных гидрогелевых биочернил на основе графена для периферической нейроинженерии

DOI:

10.3791/63622

⸱

16 мая 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Vocational School of Health Services, Istinye University, 2Chemical Metallurgy Faculty, Yildiz Technical University, 3Faculty of Medicine, Department of Histology & Embryology, Istinye University, 43D Bioprinting Design & Prototyping R&D Center, Istinye University, 5Stem Cell, and Tissue Engineering R&D Center, Istinye University, 6Vocational School of Health Services, Altinbas University, 7The V. Akhundov National Scientific Research Medical Prophylactic Institute, 8Center for Stem Cells and Regenerative Medicine (LivMedCell), Liv Hospital

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой рукописи мы демонстрируем получение биогибридных гидрогелевых биочернил, содержащих графен, для использования в инженерии периферических тканей. С помощью этого 3D-биогибридного материала выполняется протокол нейронной дифференцировки стволовых клеток. Это может стать важным шагом в привлечении подобных биоматериалов в клинику.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Периферические невропатии могут возникать в результате повреждения аксонов, а иногда и из-за демиелинизирующих заболеваний. Повреждение периферических нервов является глобальной проблемой, которая возникает у 1,5-5% пациентов неотложной помощи и может привести к значительным потерям работы. Сегодня подходы, основанные на тканевой инженерии, состоящие из каркасов, соответствующих клеточных линий и биосигналов, стали более применимыми с развитием технологий трехмерной (3D) биопечати. Комбинация различных гидрогелевых биоматериалов со стволовыми клетками, экзосомами или биосигнальными молекулами часто изучается для преодоления существующих проблем в регенерации периферических нервов. Соответственно, производство инъекционных систем, таких как гидрогели, или имплантируемых кондуитных структур, образованных различными методами биопечати, приобрело важное значение в периферической нейроинженерии. В нормальных условиях стволовые клетки являются регенеративными клетками организма, и их количество и функции не уменьшаются со временем, чтобы защитить их популяции; Они не являются специализированными клетками, но могут дифференцироваться при соответствующей стимуляции в ответ на травму. Система стволовых клеток находится под влиянием своего микроокружения, называемого нишей стволовых клеток. При повреждениях периферических нервов, особенно при невротмезисе, это микроокружение не может быть полностью спасено даже после хирургического связывания разорванных нервных окончаний вместе. Композитные биоматериалы и комбинированная клеточная терапия повышают функциональность и применимость материалов с точки зрения различных свойств, таких как биоразлагаемость, биосовместимость и технологичность. Соответственно, это исследование направлено на демонстрацию приготовления и использования биогибридного гидрогеля на основе графена и изучение эффективности дифференцировки стволовых клеток в нервные клетки, что может быть эффективным решением в регенерации нервов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нервная система, которая является механизмом, соединяющим внутреннюю структуру организма и окружающей среды, делится на две части: центральную и периферическую нервные системы. Повреждение периферических нервов является глобальной проблемой, которая составляет 1,5-5% пациентов, поступающих в отделение неотложной помощи, и развивается из-за различных травм, что приводит к значительной потере работы 1,2,3.

Сегодня клеточные подходы к периферической нейроинженерии представляют большой интерес. Стволовые клетки занимают первое место среди клеток, используемых в этих подходах. В нормальных условиях стволовые клетки являются регенеративными клетками организма, и их количество и функции не уменьшаются со временем, чтобы защитить их популяции; Эти клетки являются специализированными, но могут дифференцироваться при соответствующей стимуляции в ответ на повреждение 4,5. Согласно гипотезе стволовых клеток, система стволовых клеток находится под влиянием своего микроокружения, называемого нишей стволовых клеток. Сохранение и дифференцировка стволовых клеток невозможны без присутствия их микроокружения6, которое может быть восстановлено с помощью тканевой инженерии с использованием клеток и скаффолдов7. Тканевая инженерия — это междисциплинарная область, которая включает в себя как инженерные, так и биологические принципы. Тканевая инженерия предоставляет инструменты для создания искусственных тканей, которые могут заменить живые ткани и могут быть использованы для регенерации этих тканей путем удаления поврежденных тканей и обеспечения функциональных тканей8. Тканевые каркасы, один из трех краеугольных камней тканевой инженерии, производятся с использованием различных методов из натуральных и синтетических материалов9. Трехмерная (3D) печать — это новая технология аддитивного производства, которая широко используется для замены или восстановления дефектных тканей с помощью простого, но универсального производства сложных форм с использованием различных методов. Биопечать — это метод аддитивного производства, который обеспечивает сосуществование клеток и биоматериалов, называемых биочернилами10. Рассматривая взаимодействие нервных клеток друг с другом, исследования перешли к проводящим биоматериалам-кандидатам, таким как графен. Графеновые нанопластины, обладающие такими свойствами, как гибкая электроника, суперконденсаторы, батареи, оптика, электрохимические датчики и накопители энергии, являются предпочтительным биоматериалом в области тканевой инженерии11. Графен использовался в исследованиях, где проводилась пролиферация и регенерация поврежденных тканей и органов12,13.

Тканевая инженерия состоит из трех основных строительных блоков: каркаса, клеток и молекул биосигнала. Существуют недостатки в исследованиях повреждения периферических нервов с точки зрения полного обеспечения этих трех структур. В биоматериалах, производимых и используемых в исследованиях, были обнаружены различные проблемы, такие как те, которые содержат только стволовые клетки или биосигнальные молекулы, отсутствие биологически активной молекулы, которая позволила бы дифференцировать стволовые клетки, отсутствие биосовместимости используемого биоматериала и низкое влияние на пролиферацию клеток в тканевой нише, и, таким образом, нервная проводимость не полностью реализована 2,13,14,15,16. Это требует оптимизации регенерации нервов, уменьшения мышечной атрофии 17,18 и создания необходимого самонаведения19 с факторами роста против таких проблем. На этом этапе очень важны характеристика и анализ нейроактивности прототипа хирургического биоматериала, который должен быть передан в клинику.

Соответственно, в этом исследовании исследуется паттерн биочернил гидрогеля с графеновыми нанопластинами, сформированными 3D-биопринтером, и его эффективность в отношении нейрогенной дифференцировки стволовых клеток, которые он содержит. Также исследуется влияние графена на формирование и дифференцировку нейросферы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Культивирование мезенхимальных стволовых клеток желе Уортона

  1. Достаньте желеобразные мезенхимальные стволовые клетки Wharton (WJ-MSCs, от ATCC) из морозильной камеры с температурой -80 °C. Культивирование WJ-МСК в среде DMEM-F12, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 1% Pen-стрептококка и 1% L-глютамина в стерильном ламинарном потоке при комнатной температуре, как описано в Yurie et al.20.
  2. Криоконсервируйте некоторые клетки в дозе 1 x 106 клеток/мл с замораживающей средой, содержащей 35% FBS, 55% DMEMF-12 и 10% диметилсульфоксида (ДМСО). Для этого посчитайте 1 x 106 ячеек на предметном стекле для подсчета клеток Тома и добавьте раствор для замораживания по каплям. Быстро перенесите предметное стекло в емкость с жидким азотом.
  3. Когда культивируемые клетки на 80% сливаются в колбу, вылейте среду и промойте 5 мл PBS. Добавьте 5 мл 0,25% трипсина и 2,21 мМ ЭДТА-4Na. Инкубировать в инкубаторе при 37 °C в течение 5 мин.
  4. Добавьте 10 мл среды DMEM-F12 с 10% FBS в клетки, извлеченные из инкубатора. Хорошо суспендируйте его, соберите среду и перенесите среду в центрифужную пробирку.
  5. Центрифугу при скорости вращения 101 x g в течение 5 мин при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно засейте клетки в новые колбы со свежей питательной средой, содержащей 10% FBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерческие WJ-МСК, меченные геном GFP методом трансдукции, могут быть использованы для лучшей визуализации взаимодействий биоматериала и клеток, которые будут произведены21. Группы, которые будут использоваться в этом методе, могут быть созданы, как показано в таблице 1.

Созданные группыПричины для созданияКоличество повторений
2D WJ-MSC (2D-C)2D-управлениех 5
2D WJ-MSCs и графен (2D-G)Определение токсической дозы графена в 2Dx 5 повторений для каждой из разных концентраций
WJ-MSC входят в состав биочернил (3D-B)3D-управлениех 3
WJ-MSC и 0,1% графена включены в биочернила (3D-G)Биогибридная группа 3D графен-биоинкх 3
WJ-MSC находятся в сфероидной форме на биочернилах (3D-BS)3D-управление формой сфероидах 3
WJ-MSC и 0,1% графена находятся в форме сфероида на биочернилах (группа 3D-GS)3D графен-биочернильная биогибридная группа сфероидной формых3 шт.
Капля 3D BioinkОн предназначен для анализа характеристик SEM и FTIR.х5
3D графеновая капляОн предназначен для анализа характеристик SEM и FTIR.х5
3D Bioink с маркировкой GFP WJ-MSCs и 0,1%Наблюдение за движениями WJ-MsC в биочернилах, содержащих соответствующую дозу графена.х3 шт.

Таблица 1. Группы в методе. Все 2D и 3D группы в методе включены.

2. Токсичность графена и 2D-визуализация

  1. Получение концентраций графена и нанесение на клетки
    ПРИМЕЧАНИЕ: Необработанные наночастицы графена были приобретены на коммерческой основе (тип промышленных графеновых нанопластин), а также были пожертвованы. Размеры частиц составляли 5-8 нм в толщину, 5 мкм в диаметре и 120-150 м2/г в площади поверхности.
    1. Взвесьте графен, чтобы получить 1% раствор (мг / мл). Сделайте исходный раствор, добавив 10 мл среды DMEMF-12 с 10% FBS к взвешенным 100 мкг наночастиц графена и пометьте этот раствор как исходный раствор. Стерилизовать в автоклаве при температуре 121 °C при давлении 1,5 атм в течение 20 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильную графеновую смесь хранят в холодильнике при температуре 4 °C до использования. Он может не подходить для длительного использования (максимум 1 месяц). В этих случаях смесь должна быть восстановлена и стерилизована.
    2. Приготовьте смесь среднего графена в разных концентрациях для определения нетоксичных доз. Установите начальные разведения как 1%, 0,1%, 0,01%, 0,001% и 0,0001% графена/среды.
    3. Начиная с 1% исходного раствора, возьмите последовательно 1 мл из каждой концентрации и переложите его в новую пробирку. Добавьте 9 мл среды DMEMF-12 с 10% FBS в каждую пробирку, получив пять постепенно разбавленных образцов, и встряхните и встряхните растворы, чтобы получить равномерное распределение. Используйте только 10 мл среды DMEMF-12 с 10% FBS в качестве контроля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тяжелые хлопья графена выпадают в осадок и, следовательно, должны быть перераспределены.
    4. Засейте WJ-MSC в 6-луночные планшеты с 2 мл свежей среды, содержащей 10% FBS, в количестве 5 x10,5 клеток на лунку. Инкубировать 1 день при температуре 37 °C. Затем разделите пластины на группы равных и повторяющихся лунок. Сделайте пять повторений для каждой концентрации.
    5. Откажитесь от среды, а затем замените среду концентрацией графеновой среды по 2 мл на лунку. Используйте только среду для контрольной группы. Выдерживают пластины при 37 °C в течение 24 часов.
  2. Определение нетоксичных концентраций графена с помощью МТТ
    1. Утилизируйте носители с графеном через 24 часа. Вымойте каждый из них хорошо с помощью PBS. Добавьте свежую среду DMEMF-12 с 10% FBS по 2 мл на лунку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно промывать PBS после нанесения концентраций графена на клетку, потому что наночастицы графена, которые не попадают в клетку эндоцитозом, удаляются из окружающей среды. Это делает МТТ-тест более эффективным.
    2. Используйте протокол МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолия бромид) для определения значения IC50, указывающего на 50% жизнеспособность клеток, как описано в Kose et al.22 и на этапах 2.2.3.-2.2.6.
    3. Во-первых, взвесьте 5 мг / мл соли МТТ и растворите в PBS. Стерилизовать с помощью фильтра 0,45 мкм. Раствор МТТ, изготовленный в центрифужной пробирке объемом 15 мл, оберните алюминиевой фольгой и храните при температуре 4 °C.
    4. Добавьте 10 мкл МТТ во все лунки и инкубируйте пластину в течение 4 ч при 37 °C. Наблюдайте за образованием кристаллов формазана при 10-кратном увеличении под микроскопом после инкубации.
    5. Чтобы растворить кристаллы, образовавшиеся в клетках, добавьте по 100 мкл ДМСО в каждую лунку и перемешайте пипеткой. Держите тарелку в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут. Вставьте пластину в считыватель пластин ИФА. Установите длину волны 570 нм из программы для измерения поглощения и попросите ее прочитать на табличке22.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, в то время как частицы графена считываются только при 270 нм23, диапазон считывания 570 нм24 здесь будет предназначен только для считывания жизнеспособности клеток.
    6. Проведите статистический анализ полученных результатов с помощью одностороннего ANOVA с тестом Тьюки в программе статистического анализа.
  3. Визуализация швов
    1. Чтобы изучить взаимодействие различных концентраций графена с клетками, выполните покадровую съемку клеток с помощью метода, называемого визуализацией стежка. Этот метод создает покадровое изображение с использованием образцов изображений, взятых через равные промежутки времени под микроскопом.
    2. Для этого сначала включите компьютер. Включите инкубатор для покадровой визуализации и установите его на 37 °C. Поместите планшет MTT в слот инкубатора с интервальной съемкой.
    3. Откройте программу Stitch на компьютере. Укажите скважины, которые будут считываться в системе. Поднесите считыватель к первому колодцу, найдите и сфокусируйте область с 10-кратным увеличением в белом свете. Запустите программу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это программа для создания высококачественных фотоколлажей размером 4 строки x 5 столбцов. Программа объединяет фотографии, сделанные одна за другой в HD качестве. Когда вы нажимаете кнопку запуска системы, скважины автоматически считываются, и она берет и сшивает 4 ряда х 5 столбцов несколько фотографий.

3. Производство биогибридного гидрогеля Graphene - Bioink и дифференциация WJ-MSCs

  1. Производство биочернил
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лиофилизированные коммерчески доступные порошки альгинат-желатина (3:5) используются в качестве основы биочернил. Группу графеновых биочернил (3D-G; 3D-GS) и группу безграфеновых контрольных биочернил (3D-B; 3D-BS) получают одним и тем же способом (таблица 1).
    1. Для приготовления используйте конические пробирки объемом 50 мл. Сначала взвесьте 4,5 мг альгината и 1,5 мг желатина и перенесите в центрифужную пробирку. Добавьте в смесь среду DMEMF-12, содержащую 10% FBS, до общего объема 50 мл. Это контрольная (С) группа без графена.
    2. Повторить взвешивание 4,5 мг альгината и 1,5 мг желатина и перенести в центрифужную пробирку. Затем возьмите 50 мкл приготовленного 0,1% графена из шага 2.1.3. и добавьте его в тюбик. Добавьте DMEMF-12 с 10% FBS к общему объему 50 мл.
    3. Смешайте биочернила сначала пипеткой, а затем вихревом. Стерилизовать в автоклаве при температуре 121 °C при давлении 1,5 атм в течение 20 мин. В качестве альтернативы выполните стерилизацию в микроволновой печи до точки кипения.
    4. После автоклавирования смесей центрифугу при 280 х г в течение 2 мин при комнатной температуре для удаления образовавшихся пузырьков. Храните биочернила при температуре 37 °C, пока клетки не будут подготовлены.
  2. Добавление WJ-MSC и 3D-биопечати
    1. Для подсчета промойте клетки, когда произойдет 80% слияние примерно с 5 мл PBS, и добавьте 5 мл 0,25% трипсина и 2,21 мМ EDTA 4Na. Оставьте на 5 минут при температуре 37 °C.
    2. Добавьте 10 мл среды DMEM-F12 с 10% FBS в клетки после извлечения из инкубатора. Хорошо суспендировать, собрать среду и перенести ее в центрифужную пробирку. Центрифугу при 101 x g в течение 5 мин при комнатной температуре, а затем выбросьте надосадочную жидкость.
    3. Оставьте примерно 250 мкл среды с гранулами. Повторно растворите гранулы в 1 мл свежей среды. К 48 мкл среды добавляют 2 мкл клеточной суспензии и 50 мкл трипанового синего (0,4 г трипанового синего/100 мл) в конической пробирке (1,5 мл) для подсчета4. Хорошо протрите его пипеткой.
    4. Добавьте приблизительно 10 мл подготовленной окрашенной клеточной суспензии в камеру для подсчета клеток Тома. Рассчитайте среднее количество клеток, попадающих в квадраты по обе стороны светового микроскопа.
      Рассчитайте процент жизнеспособности (%) = (подсчитано жизнеспособных клеток/подсчитано общее количество клеток) x 100
      ПРИМЕЧАНИЕ: Взаимодействие клеток и биочернил изучается двумя способами: (1) его можно напечатать, добавив его в биочернила (3D-B; 3D-G); (2) Клетки высеваются на биочернила после прессования, и клетки образуют сфероид (3D-BS; 3D-GS).
    5. Для взаимодействия между клеткой и биочернилами сначала создайте группы биочернил (таблица 1). Группа 1 включает 3D-B и 3D-G, напечатанные биочернилами для биопечати. К группе 2 относятся биочернила 3D-BS и 3D-GS, на которых после биопечати образовались сфероиды.
    6. Подсчитайте клетки для группы 1 так, чтобы в 0,5 мл среды было примерно 1 x 107 клеток. Добавьте 4,5 мл биочернил, чтобы довести общий объем до 5 мл. Перенесите это в картриджи в стерильном шкафу с помощью шприцев. Установите картриджи в соответствующую секцию экструдера биопринтера.
    7. Для второй группы возьмите по 5 мл из каждой из групп биочернил и перенесите их в стерильные картриджи с помощью инжектора.
    8. Используйте биопринтер с двумя коаксиальными печатающими головками и технологией экструзии с пневматическим приводом. Установите разрешение X/Y/Z на микрошаг на 1,25 мкм, ширину экструзии на 400 мкм и высоту экструзии на 200 мкм. Сетка 20 мм x 20 мм x 5 мм является одной из наиболее часто используемых 3D-моделей для 3D-биопечати.
    9. Создавайте 3D-модели с помощью веб-программ САПР с открытым исходным кодом. Перед биопечатью создайте простые 3D-модели с помощью одной из платформ с открытым исходным кодом (например, infill). Модель может быть линейной (как модель, используемая здесь), сотовой или сетчатой. Экспортируйте и загружайте в формате .stl после создания квадрата размером 5 мм x 20 мм x 20 мм.
    10. Программное обеспечение биопринтера использует файлы .stl и преобразует их в формат .gcode для печати с помощью модулей слайсера. Чтобы получить печатную форму сетки, отключите внешнюю оболочку в модуле слайсера. Перед работой протрите устройство 70% этанолом, а затем стерилизуйте УФ-стерилизацией.
    11. Для процесса биопечати перенесите группы биочернил на картриджи с помощью инжектора. Установите картриджи в соответствующую секцию экструдера биопринтера.
    12. Установите среднее давление 3D-принтера на 7,5 фунтов на квадратный дюйм, а температуру картриджа и слоя — на 37 °C. Установите скорость на 60% и выполните стандартный процесс 3D-печати.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Планирование подготовленных моделей с помощью пространств (как линейная модель) позволяет проводить культивирование клеток в пространствах после биопечати.
    13. Переведите систему в исходное положение на этапе записи. Автоматически расположите оси (X, Y, Z), выберите экструдер и установите. Запустите процесс печати. После процесса биопечати возьмите образец и поместите его под шкаф с ламинарным потоком.
    14. Распылите биочернила 0,1 N раствором CaCl2 после печати или добавьте 1 мл раствора пипеткой при комнатной температуре. Подождите около 10-20 секунд и простирайте напечатанные шаблоны 2x с помощью PBS, содержащего Ca 2+ и Mg2+.
    15. Добавьте 2 мл DMEMF-12 с 10% средой FBS поверх каждой из групп биочернил, содержащих клетки. Инкубируйте пластины при 37 °C с 5%CO2. После этого добавьте 2 мл суспензионной среды, содержащей 1 x 106 клеток, в каждую группу для образования сфероидов.
    16. Инкубируйте пластины при 37 °C с 5%CO2. После 24-часовой инкубации наблюдайте за образованием сфероида под перевернутым микроскопом.
  3. Дифференцировка WJ-МСК в нейроноподобные клетки
    1. Наблюдайте и фотографируйте все партии биочернил после 24 часов инкубации. Добавьте 2 мл среды для нейрогенной дифференцировки на лунку (кроме контрольной группы) и обновляйте каждые 2 дня. Наблюдайте в течение 7 дней, чтобы наблюдать нервную дифференцировку.

4. Характеристика биогибридного гидрогеля графен-биоинк

ПРИМЕЧАНИЕ: Покадровая съемка, инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье (FT/IR) и сканирующая электронная микроскопия (SEM) выполняются для определения характеристик биогибридного гидрогеля графена и биочернил. Образцы создаются из групп биочернил 3D-B и 3D-G капельным методом для FT/IR и SEM-анализа.

  1. FT/IR анализ
    ПРИМЕЧАНИЕ: FT/IR - это химический аналитический метод, основанный на математическом преобразовании Фурье, незаменимом для определения характеристик материалов. Используйте ИК/ИК-устройство, основанное на принципах интерферометра Майкельсона 28 °C, с галогенной лампой, ртутным источником света с водяным охлаждением, соотношением сторон сигнала 4 см-1, измеренным в течение 1 мин, при 2,200 см-1.
    1. Подготовьте ИК/ИК-микроскоп и убедитесь, что оптика прибора выровнена. Откалибруйте устройство.
    2. Поскольку образец находится в капле, возьмите кусочек гидрогеля толщиной 1-2 мм и поместите его щипцами на часть образца. Сосредоточьтесь на образце и поднимите его до тесного контакта. Соберите спектр образца, запустив процесс из системы.
  2. Анализ сканирующей электронной микроскопии (СЭМ)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Морфология поверхности, внутренняя структура, распределение клеток и взаимодействия биочернил с клетками могут быть изучены с помощью анализа SEM в различных измерениях.
    1. Капните гидрогель в 6-луночные планшеты, содержащие 1 мл сшивающего агента CaCl2 , используя метод капель наконечника пипетки (см. рис. 1).
    2. Вымойте пластины 2 раза примерно 1 мл PBS, чтобы освободить раствор солей. Затем поместите эти капли в соколиную пробирку, содержащую 5 мл 5% параформальдегида, с помощью щипцов.
    3. Сделайте тонкие срезы из капель биочернил с помощью скальпеля. Наклейте образцы липкой стороной на металлическую пластину. Вставьте в устройство покрытия там, где золотой палладий, который переходит в плазменную фазу, заменяя воздух газообразным аргоном, покрывает образец.
    4. Поместите его в электронный микроскоп (СЭМ). Откройте программу микроскопа, к которой подключен СЭМ. Выполните масштабирование и сделайте снимки разных частей образца. Для этого протокола использовались шкалы 5 мкм, 10 мкм и 200 мкм. Всего было сделано 40 снимков для групп 3D-B и 3D-G.
  3. Покадровая визуализация
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время покадровой визуализации использовались не только образцы биочернил, содержащие клетки, трансформированные геном GFP, но и биочернила со сфероидами визуализировались в течение 16 часов. Покадровая визуализация выполняется для изучения влияния графена на стволовые клетки и для мониторинга клеточных взаимодействий в биочернилах.
    1. Добавьте коммерчески доступные 1 x 107 GFP-меченных МСК в 5 мл биочернил и биопечати, как показано на шаге 3.2.11. Добавьте 1 мл сшивающего агента, подержите 20-30 с и промойте 2 раза PBS.
    2. Включите покадровый монитор и откройте программу на компьютере. Установите примерно 16 ч в режиме Time-Lapse и установите температуру 37 °C. Нажмите кнопку «Пуск ». Видео в виде 40-секундных покадровых видеосэмплов записываются системой.
    3. Фокусируйте микроскоп с 10-кратным увеличением каждые 2 часа. Кроме того, визуализируйте сфероиды, созданные путем выполнения тех же шагов.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Группы биочернил 3D-B и 3D-G, полученные в виде капель для использования в характеризации. (A) Образцы биочернил (изображение перед характеристикой) на пластине со сшивающим агентом. (B) 3D-B каплевидное изображение биочернил. (C) 3D-G изображение с биочернилами. Биоматериал, подлежащий описанию, и содержащиеся в нем клетки могут легче проходить такие процессы, как золочение, отбор проб и т. Д. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

5. Определение нейрогенной дифференцировки методом иммуноокрашивания

  1. Соберите сфероиды, не прерывая формы сфер, и пересейте в новые пластины, чтобы окрасить более простым методом, вместо того, чтобы встраивать парафин для разделения тканей.
  2. Накройте 48-луночные планшеты примерно 20 мл предварительно автоклавированного 0,1% раствора желатина и выдержите в инкубаторе не менее 1 часа. Пипеткой налейте примерно 500 мкл подготовленного 0,1% желатина в 48-луночные планшеты. Студенистые пластины оставить в инкубаторе на 10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволит желатину немного набухнуть, покрывая поверхность и создавая лучшую среду для прикрепления собранных сфероидов.
  3. Соберите сфероиды пипеткой, распределите собранные сфероиды из инкубатора в лунки 48-луночной пластины и добавьте свежую среду. Затем инкубируйте в течение 12-24 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Довольно сложно распределить сфероиды путем подсчета. Соберите сфероиды в одну трубку и равномерно распределите общий объем по лункам. Для этого исследования каждая лунка содержала примерно 4-6 сфероидов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для 2D-образцов достаточно предварительной промывки пятен и замены носителя не требуется.
  4. Удалите среду и медленно промойте ячейки PBS, так как сфероиды будут наверху. Зафиксируйте в 4% параформальдегиде в течение 2 ч.
  5. Снова промойте образцы PBS и заблокируйте примерно 10 мл 2% BSA и 0,1% TritonX в течение 30 мин. Затем постирайте с помощью PBS 3x.
  6. Разбавьте выбранные антитела-праймер (N-кадгерин-кролик и β-III тубулин-мышь) в соотношении 1:100 раствором реагента-разбавителя антител. Добавьте 100 мкл раствора антитела к каждому из образцов и инкубируйте в течение ночи при 4 ° C.
  7. Промойте образцы 3 раза с помощью PBS. Инкубируйте с антимышиным IgG-FTIC-кроликом для β-III тубулина и мышиным вторичным антителом IgG-SC2781-козья для N-Cad, разбавленными до 1:200 при комнатной температуре в течение 30 мин. Выполняйте все операции в темное время суток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Независимо от того, какой штамм используется в качестве первичного антитела (например, мыши) при двойном окрашивании, для вторичного антитела следует использовать другой штамм (например, козу или кролика).
  8. Промойте вторичное антитело PBS 3x, а затем капните раствор DAPI (1:1) в каждый из образцов. Подождите 15-20 минут. Проведите иммунофлюоресцентную визуализацию.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Токсичность графена и 2D-визуализация
Статистический анализ полученных результатов МТТ проводился с помощью одностороннего ANOVA с тестом Тьюки в программном обеспечении статистического анализа, а полученный график показан на рисунке 2. Процентное содержание графена по сравнению с контролем показало достоверное снижение только при концентрации графена 0,001% (**p < 0,01). Достоверных различий между другими группами и контролем не выявлено (p > 0,05). Таким образом, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Преимущества лечения, применяемого с помощью инженерных 3D-каркасов, по сравнению с традиционными 2D-методами становятся все более заметными с каждым днем. Стволовые клетки, используемые отдельно в этих методах лечения или вместе со скаффолдами, полученными из различных биоматериалов с низкой биосовместимостью и биоразлагаемостью, обычно недостаточны для регенерации периферических нервов. Желейные мезенхимальные стволовые клетки Уортона (WJ-MSCs), по-видимому, являются подходящей клеточной линией-кандидатом, особенно с у...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Проект выполнен в сотрудничестве с HD Bioink, разработчиком технологии 3D-биопечати.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Графен, используемый в этом исследовании, был разработан в Университете Киркларели, на факультете машиностроения. Он был подарен доктором Карабейоглу. Испытание на токсичность графена финансировалось в рамках проекта под названием «Печать и дифференцировка мезенхимальных стволовых клеток на 3D-биопринтерах с помощью биочернил, легированных графеном» (No заявки: 1139B411802273), завершенного в рамках программы поддержки дипломных работ TÜBİTAK 2209-B-Industry-Oriented для студентов. Другая часть исследования была поддержана исследовательским фондом, предоставленным научно-исследовательскими проектами Технического университета Йылдыз (TSA-2021-4713). Мезенхимальные стволовые клетки с GFP, используемые на этапе покадровой визуализации, были безвозмездно предоставлены компанией Virostem Biotechnology. Авторы благодарят Darıcı LAB и команду YTU The Cell Culture and Tissue Engineering LAB за продуктивные обсуждения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии

Центробежный		HitachiИспользуется в клеточной культуре и биоматериале на стадии
0,1N CaCl2HD BioinkИспользуется для сшивающего агента
0,22 &; m мембранный фильтрAι sι moИспользуется для стерилизации
0,45 & микро; м шприц фильтрАι sι moИспользуется для стерилизации
1,5 мл коническая трубкаEppendorfaИспользуется для капли биочернил
15 мл Falcon tubeNestИспользуется на этапе клеточной культуры
25 см2 колбы для клеточной культуры (Falcon, TPP tissue culture flaskNestИспользуется для клеточной культуры
3D БиопечатьAxolotl Biosystems Bio A2 (Турция)БиопечатьШаг
50 мл Falcon tubeNestИспользуется на стадии культивирования клеток
6/24/48/96 лунок (Falcon, микропланшеты TPP)Merck MilliporeИспользуется на стадии культивирования клеток
75 см2 колбы для клеточной культуры (Falcon, колбы для культуры тканей TPPГнездоИспользуется для клеточной культуры
Антимышиный IgG-FTIC-кроликSanta Cruz BiotechnologyJ1514Seconder антитело, используется для красителя
Антимышиный IgG-SC2781-goatSanta Cruz BiotechnologyC3109Вторичное антитело, используемое для окрашивания
Au-покрытие устройство EM ACE600Leicaдля золотого покрытия биоматериала перед SEM визуализацией
АвтоклавNUVE-OT 90LИспользуется для процесса стерилизации.
АвтоклавNUVE-OT 90LИспользуется для процесса стерилизации.
Cell Cultre CabineHera Safe KSИспользуется для процесса культивирования клеток
Модифицированная смесь Eagle's Medium/Nutrient Mix-F12SigmaRNBJ7249Используется в качестве среды для культивирования клеток
FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEMQuantaFEG 450для SEM
Фетальная бычья сыворотка-FBSCapricornFBS-16AИспользуется путем добавления в среду для клеточной культуры.
Морозильная камера -80° CPanasonicMDF-U5386S-PEМы использовались для хранения клеток и полученных экзосом
Желатин-альгинатный порошок биочернилHD BioinkИспользуется для производства биочернил
этап GFP меченый-WJ-MSCsVirostemИспользуется для визуализации взаимодействия клетки с биочернилами
Графеновые нанопластинки (графен-IGP2)Grafen Chemical Industries Co.Используется для производства 3D-G биочернила
Иммунофлуоресцентные антитела (N-CAD; β-III тубулин)Клеточная сигнализация и Santa CruzИспользуется для красителя
JASCO 6600Tetraдля FTIR
MTT АнализSigmaЖизнеспособность Sigma
Раствор пеницилина/стрептомицинаCapricornPB-SДобавлялся в среду для предотвращения загрязнения в клеточной культуре.
СлайдThoma IsolabИспользуется для подсчета клеток
Система покадровой визуализацииZeiss Axio.Observer.Z1Imaging
Tripsin-EDTAMulticellКолба использовалась для удаления клеток, покрывающих поверхность.
VorteksBiobaseДля производства биочернил
step WJ-MSCsATCCИспользуется для процесса культивирования клеток

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kamasak, B., et al. Peripheral Nerve Injuries and Physiotherapy. Clinical Physiotherapy. 19, Vize Publishing, Istanbul. (2019).
  2. Yegiyants, S., Dayicioglu, D., Kardashian, G., Panthaki, Z. J. Traumatic peripheral nerve injury: A wartime review. Journal of Craniofacial Surgery. 21 (4), 998-1001 (2010).
  3. Mushtaq, S., et al. Frequency of peripheral nerve injury in trauma in emergency settings. Cureus. 13 (3), 14195(2021).
  4. Allahverdiyev, A. Basic Principles of Somatic and Stem Cell Culture Systems, 1st Edition. , Nobel Medicine Bookstore. Istanbul. (2018).
  5. Allahverdiyev, A. M., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a new host cell in latent leishmaniasis. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 85 (3), 535-539 (2011).
  6. Schofield, R. The relationship between the spleen colony-forming cell and the hemopoietic stem cell. Blood Cells. 4 (1-2), 7-25 (1978).
  7. Goodman, S. R. Stem Cells and Regenerative Medicine (Chapter 13). Goodman's Medical Cell Biology, Fourth Edition. , Academic Press. 361-380 (2021).
  8. Kaya, T. I. Tissue engineering. International Journal of Medical Sciences. 1 (48), 165-169 (2018).
  9. Sensharma, P., Madhumathi, R. G., Jayant, R. D., Jaiswal, A. K. Biomaterials and cells for neural tissue engineering: Current choices. Materials Science and Engineering: C. 7, 1302-1315 (2017).
  10. Hölzl, K., et al. Bioink properties before, during, and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002(2016).
  11. Zheng, Y., et al. 2D nanomaterials for tissue engineering and regenerative nanomedicines: Recent advances and future challenges. Advanced Healthcare Materials. 10 (7), 2001743(2021).
  12. Shin, S. R. Graphene-based materials for tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 105, 255-274 (2016).
  13. Chen, M., Qin, X., Zeng, G. Biodegradation of carbon nanotubes, graphene, and their derivatives. Trends in Biotechnology. 35 (9), 836-846 (2017).
  14. Chen, S., et al. PAM/GO/Gel/SA composite hydrogel conduit with bioactivity for repairing peripheral nerve injury. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 1273-1283 (2019).
  15. Chiriac, S., Facca, S., Diaconu, M., Gouzou, S., Liverneaux, P. Experience of using the bioresorbable copolyester poly(DL-lactide-ε-caprolactone) nerve conduit guide Neurolac™ for nerve repair in peripheral nerve defects: Report on a series of 28 lesions. Journal of Hand Surgery (European Volume). 37 (4), 342-349 (2011).
  16. Karaaltin, A. B., et al. Human olfactory stem cells for injured facial nerve reconstruction in a rat model). Head & Neck. 38, 2011-2020 (2016).
  17. Bingham, J. R., et al. Stem cell therapy to promote limb function recovery in peripheral nerve damage in a rat model. Annals of Medicine and Surgery. 41, 20-28 (2019).
  18. Zhuang, H., et al. Gelatin-methacrylamide gel loaded with microspheres to deliver GDNF in bilayer collagen conduit promoting sciatic nerve growth. International Journal of Nanomedicine. 11, 1383-1394 (2016).
  19. Scheib, J., Hoke, A. Advances in peripheral nerve regeneration. Nature Reviews: Neurology. 9 (12), 668-676 (2013).
  20. Yurie, H., et al. The efficacy of a scaffold-free bio 3D conduit developed from human fibroblasts on peripheral nerve regeneration in a rat sciatic nerve model. PLOS ONE. 12 (2), 0171448(2017).
  21. Guo, Y., et al. Assessment of the green florescence protein labeling method for tracking implanted mesenchymal stem cells. Cytotechnology. 64 (4), 391-401 (2012).
  22. Kose, C., Kacar, R., Zorba, A. P., Bagirova, M., Allahverdiyev, A. The effect of CO2 laser beam welded AISI 316L austenitic stainless steel on the viability of fibroblast cells, in vitro. Materials Science and Engineering: C. 60, 211-218 (2016).
  23. Liu, Y., et al. Bio-adenine-bridged molecular design approach toward non-covalent functionalized graphene by liquid-phase exfoliation. Journal of Materials Science. 55, 140-150 (2020).
  24. Rehman, S. Reduced graphene oxide incorporated GelMA hydrogel promotes angiogenesis for wound healing applications. International Journal of Nanomedicine. 14, 9603-9617 (2019).
  25. Bei, H. P., et al. Graphene-based nanocomposites for neural tissue engineering. Molecules. 24 (4), 658(2019).
  26. Othman, S. A., et al. Alginate-gelatin bioink for bioprinting of HeLa spheroids in alginate-gelatin hexagon-shaped scaffolds. Polymer Bulletin. 78, 6115-6135 (2021).
  27. Peng, X. L., Li, Y., Zhang, G., Zhang, F., Fan, X. Functionalization of graphene with nitrile groups by cycloaddition of tetracyanoethylene oxide. Journal of Nanomaterials. 2013, 841789(2013).
  28. Zorba Yildiz, A. P., et al. 3D therapeutic approaches for peripheral nerve damage. 9th International Molecular Biology and Biotechnology Congress Abstract Book. , E- ISBN: 978-605-70057-4-8 (2020).
  29. Liau, L. L., Ruszymah, B. H. I., Ng, M. H., Law, J. X. Characteristics and clinical applications of Wharton's jelly-derived mesenchymal stromal cells. Current Research in Translational Medicine. 68 (1), 5-16 (2020).
  30. Yoo, J., et al. Augmented peripheral nerve regeneration through elastic nerve guidance conduits prepared using a porous PLCL membrane with a 3D printed collagen hydrogel. Biomaterials Science. 22, 1-12 (2020).
  31. Jansen, K., Meek, M. F., vander Werff, J. F. A., van Wachem, P. B., van Luyn, M. J. A. Long-term regeneration of the rat sciatic nerve through a biodegradable poly (DL-lactide-Ɛ-caprolactone) nerve guide: Tissue reactions with a focus on collagen III/IV reformation. Journal of Biomedical Materials Research. 69 (2), 334-341 (2016).
  32. Pathre, P., et al. PTP1B regulates neurite extension mediated by cell-cell and cell-matrix adhesion molecules. Journal of Neuroscience Research. 15, 143-150 (2001).
  33. Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. Exosomes and their microRNA cargo: New players in peripheral nerve regeneration. Neurorehabilitation and Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

3D

Похожие статьи