Описаны усовершенствования стандартного метода измерения клеточных тяговых сил, основанного на микроконтактной печати с одной стадией субтрактивного паттерна точечных массивов белков внеклеточного матрикса на мягких гидрогелях. Этот метод позволяет упростить и более последовательное изготовление островных узоров, необходимых для контроля формы клеточного кластера.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Генерация паттернов для микрошаговой тракционной микроскопии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Микроструктурная тракционная микроскопия позволяет контролировать форму отдельных клеток и клеточных кластеров. Кроме того, способность формировать рисунок на микрометровой шкале длины позволяет использовать эти узорчатые контактные зоны для измерения тяговых сил, поскольку каждая микроструктурированная точка позволяет формировать единую фокальную адгезию, которая затем деформирует мягкий, лежащий в основе гидрогель. Этот подход был использован для широкого спектра типов клеток, включая эндотелиальные клетки, гладкомышечные клетки, фибробласты, тромбоциты и эпителиальные клетки.
В этом обзоре описывается эволюция методов, которые позволяют печатать белки внеклеточного матрикса на полиакриламидных гидрогелях в регулярном массиве точек заранее определенного размера и интервала. Поскольку микрометровые узоры трудно непосредственно напечатать на мягких подложках, узоры сначала генерируются на жестких стеклянных крышках, которые затем используются для переноса рисунка на гидрогель во время гелеобразования. Во-первых, описан оригинальный подход микроконтактной печати для генерации массивов мелких точек на обложке. Второй шаг, который удаляет большую часть узора, чтобы оставить островки маленьких точек, необходим для управления формами клеток и клеточных кластеров на таких массивах узорчатых точек.
Далее описывается эволюция этого подхода, позволяющая генерировать островки точек с помощью одного стадии субтрактивного паттерна. Этот подход значительно упрощен для пользователя, но имеет недостаток в уменьшенном сроке службы для мастер-формы, необходимой для изготовления узоров. Наконец, описаны вычислительные подходы, которые были разработаны для анализа изображений смещенных точек и последующих клеточных тяговых полей, и предоставлены обновленные версии этих пакетов анализа.
Введение
Большинство клеточных фенотипов оказывают тяговые силы на окружающую среду. Эти тяговые силы генерируются сократительным цитоскелетом клетки, который представляет собой сеть актина и миозина, а также другими нитевидными биополимерами и сшивающими белками 1,2,3,4. Силы, генерируемые внутри клетки, могут передаваться во внеклеточную среду или соседние клетки, главным образом через трансмембранные белки, такие как интегрины и кадгерины, соответственно 5,6. То, как клетка распространяетс....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Создание силиконовых мастеров
ПРИМЕЧАНИЕ: Большая часть процесса проектирования, создания и устранения неисправностей кремниевых мастеров для повторного формования штампов PDMS была рассмотрена ранее21, поэтому здесь будут описаны только ключевые различия в этом новом подходе.
- Создайте дизайн для фотомаски с помощью AutoCAD или аналогичного программного обеспечения для проектирования. Покройте одну сторону фотомаски, тонкий кусок стекла, тонким слоем хрома, чтобы контролировать рассеяние ультрафиолетового света. Спроектируйте фотомаску таким образом, чтобы свет через нее ультрафиолетовый....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Гидрогели PAA с модулем Юнга E = 3,6 кПа и отношением Пуассона ν = 0,445 были изготовлены для использования этим методом субтрактивного микроструктурирования. Гидрогели были сделаны толщиной ~ 100 мкм, что позволяет их визуализировать с помощью используемой здесь установки визуализации, а также не позволять клеткам ощущать жесткий покров под гелем, что вызовет проблемы в исследованиях, ориентированных на клеточную жесткость, чувствительную23,33........
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В данной работе описан усовершенствованный метод косвенного моделирования гидрогелей ПАА. Этот подход основан на методах, которые использовались ранее 20,35,36,37,38,39,40,41,42. Основное изменение заключается в том, что ш.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить доктора Пола Барбоуна с факультета машиностроения Бостонского университета за полезные обсуждения и помощь в анализе данных. Это исследование было поддержано грантом NSF CMMI-1910401.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| (3-аминопропил)триметоксисилан | Sigma Aldrich | #281778 | |
| 1,5 мл микроцентрифужная трубка | Fisher Scientific | #05-408-129 | |
| 15 мл коническая трубка | Fisher Scientific | #05-539-12 | |
| 4 x 4 in 0,060 Кварц LR хромированная фотомаска | Advance Reproductions Corporation | N/A | Специально разработанная маска |
| 6 луночных планшетов | Fisher Scientific | #07-200-83 | |
| Ацетон | Fisher Scientific | #A18P-4 | |
| Раствор акриламида, 40% | Sigma Aldrich | #A4058 | |
| AlexaFluor 488 | Thermo Fisher | #A20000 | |
| персульфат аминония | Fisher Scientific | #BP179-25 | |
| Бисаакриламид | Fisher Scientific | #PR-V3141 | |
| Этанол | Greenfield Global | #111000200C1GL | |
| Стеклянные покровные стекла, 25 мм круглые | Fisher Scientifc | #12-545-102 | |
| Стеклянные покровные стекла, 30 мм круглые | Warner | #64-1499 | |
| Hamamatsu ORCA-R2 Camera | Hamamatsu | #C10600-10B | |
| Human Plasma | Valley Biomedical | #HP1051P | Используется для выделения фибронектин |
| соляная кислота, 1,0 n | миллипор сигма | #1.09057 | |
| imageJ | Wayne Rasband | #1.53n | |
| Сменный набор посуды | Coverslip Bioptechs | #190310-35 | |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | #06-666-11C | |
| Маска Alinger | Karl Suss | #MA6 | |
| Matlab 2021 | Mathworks | #R2021a | |
| MetaMorph Basic | Molecular Devices | #v7.7.1.0 | |
| N-гидроксисукцинимидный эфир | Sigma Aldrich | #130672-5G | |
| NucBlue Live Cell Stain | Thermo Fisher | #R37605 | |
| Olympus IX2-ZDC Инвертированный микроскоп | Olympus | #IX81 | |
| Обессоливающие колонки PD-10 | Healthcare | #52-1308-00 | |
| Фоторезистный колпак Headway | Research | #PWM32 | |
| Плазменный очиститель | Harrick | #PDC-001 | |
| Плазменный травитель | TePla | #M4L | |
| Prior Lumen 200Pro Источник света | Prior Scientific | #L200 | |
| Кремниевые пластины, 100 мм | Университетская пластина | #809 | |
| SU-8 2005 | Kayaku Advanced Materials Inc. | ||
| Разработчик СУ-8 | Kayaku Advanced Materials Inc. | ||
| Силгард 184 Силиконовый эластомер | Эссекс Браунелл | #DC-184-1.1 | |
| Тетраметилэтилендиамин | Фишер Научный | #BP150-20 | |
| Трихлор(1H,1H,2H,2H-перфтороктил)силан | Сигма Олдрич | #448931 | |
| UAPON-40XW340 Объектив | Олимпус | #N2709300 | |
| воздействие | ультрафиолетового излученияNewport | #69910 | |
| Лоток для вафель, 110 x 11 мм | Ted Pella, Inc. | #19395-40 |
Ссылки
- Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
