Этот протокол описывает методологию генетической абляции пигментного эпителия сетчатки (RPE) с использованием трансгенной модели рыбок данио. Адаптация протокола для включения модуляции сигнального пути с использованием фармакологических соединений подробно описана. Была разработана и обсуждается платформа MATLAB для количественной оценки регенерации RPE на основе пигментации.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Нитроредуктаза/метронидазол-опосредованная абляция и платформа MATLAB (RpEGEN) для изучения регенерации пигментного эпителия сетчатки рыбок данио
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Пигментный эпителий сетчатки (RPE) находится в задней части глаза и выполняет функции, необходимые для поддержания здоровья и целостности соседних тканей сетчатки и сосудов. В настоящее время ограниченная репаративная способность RPE млекопитающих, которая ограничена небольшими травмами, препятствует прогрессу в понимании регенеративных процессов RPE in vivo . Здесь представлена подробная методология, облегчающая изучение восстановления RPE in vivo с использованием рыбки данио, модели позвоночных, способной к надежной регенерации тканей. Этот протокол описывает трансгенную нитроредуктазу/метронидазол (NTR/MTZ)-опосредованную парадигму повреждения (rpe65a:nfsB-eGFP), которая приводит к абляции центральных двух третей RPE после 24-часового лечения MTZ с последующим восстановлением тканей. Основное внимание уделяется абляции RPE у личинок рыбок данио, а также изложены методы тестирования влияния фармакологических соединений на регенерацию RPE. Также обсуждается генерация и валидация RpEGEN, скрипта MATLAB, созданного для автоматизации количественной оценки регенерации RPE на основе пигментации. Помимо активных механизмов восстановления RPE, этот протокол может быть расширен до исследований дегенерации RPE и реакций на травмы, а также влияния повреждения RPE на соседние ткани сетчатки и сосудов, среди других клеточных и молекулярных процессов. Эта система рыбок данио имеет значительные перспективы в выявлении генов, сетей и процессов, которые управляют регенерацией RPE и механизмами, связанными с болезнью RPE, с долгосрочной целью применения этих знаний к системам млекопитающих и, в конечном счете, к терапевтическому развитию.
Введение
Методология, описанная в настоящем описании, детализирует протокол генетической абляции пигментного эпителия сетчатки (RPE) с использованием личинок рыбок данио. RPE простирается над задней частью глаза и находится между стратифицированными слоями нервной сетчатки и слоем сосудистой системы, составляющим сосудистую оболочку. Трофическая поддержка, поглощение фототоксического света и поддержание белков зрительного цикла являются лишь некоторыми из критических функций, выполняемых RPE, которые необходимы для поддержания здоровья и целостности этих смежных тканей1. Повреждения РПЭ млекопитающих поддаются исправлению, когда поражения небольшие
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все методологии, изложенные в настоящем документе, соответствуют требованиям Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Питтсбурга.
1. Подготовка перед сбором эмбрионов рыбок данио
- Установите инкубатор эмбрионов на 28,5°C.
- Готовят 25-кратный исходный раствор ингибитора меланогенеза N-фенилтиомочевины (ПТУ)21,22. Этот исходный раствор масштабируется по распространенной рецептуре22 и 1x равен 0,003% массы на объем (% мас./об.) (например, 0,003 г порошка ПТУ на 100 мл жи....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Известно, что ингибирование канонического сигнального пути Wnt значительно ухудшает регенерацию RPE рыбок данио с использованием парадигмы генетической абляции (rpe65a: nfsB-eGFP) и методологии фармакологических манипуляций (IWR-1), описанной в протоколе3. Этот эксперимент был повторен здесь, чтобы проверить автоматизированный метод количественной оценки регенерации RPE рыбок данио на основе пигментации. Результаты, обобщенные ниже, охватывали все этапы протокола, от дня оплодотворения (0.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот протокол описывает методологию генетической абляции RPE и изучает механизмы дегенерации и регенерации у личиночных рыбок данио. Этот протокол также был успешно выполнен у взрослых рыбок данио3, но с менее обширной характеристикой, поэтому личинки находятся в центре внимания. Критические аспекты этой части протокола (этапы 1-4) включают: 1) добавление 1,5x PTU к эмбрионам до начала меланогенеза, 2) дехорионирование обработанных PTU эмбрионов на 2-3 dpf, 3) тщательный скрининг на eGFP и 4) врем.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
L.L.L. является соавтором патента США No 9,458,428, который описывает ускоренный метод получения пигментного эпителия сетчатки из плюрипотентных стволовых клеток человека; это не связано с содержанием настоящего документа. J.M.G. и G.B.F. нечего раскрывать.
Благодарности
Работа, описанная здесь, была поддержана Национальными институтами здравоохранения (RO1-EY29410 для J.M.G и грант NIH CORE P30-EY08098 для департамента офтальмологии); Центр иммунной трансплантации и терапии UPMC (для L.L.L. и J.M.G.); и кафедра офтальмологических исследований Э. Рональда Сальвитти (дж.м.г.). Дополнительная поддержка была получена от стипендии Виганда в области офтальмологии (L.L.L.), Фонда глаз и ушей Питтсбурга и неограниченного гранта от Research to Prevent Blindness, New York, NY. Авторы также хотели бы поблагодарить Аманду Платт за техническую помощь и доктора Хью Хаммера и персонал водных видов спорта за отличную поддержку по уходу за животными.....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Lab Material/Equipment | |||
| 2-(4-амидинофенил)-6-индолкарбамидина дигидрохлорид (DAPI) | Millipore Sigma | D9542 | |
| 6-луночные планшеты | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Конические полипропиленовые центрифужные пробирки | Fisher Scientific | 05-539-13 | Каталожный номер для пробирок объемом 50 мл |
| Ручка для скрайбирования алмазным наконечником | Fisher Scientific | 50-254-51 | Изготовлено компанией Electron Microscopy Sciences, изделия, аналогичные этому номеру детали, являются адекватными |
| диметилсульфоксидом (ДМСО) &; 99,7 % | Fisher Scientific | BP231 | Проверить требования к утилизации химических отходов |
| Инкубатор для эмбрионов (большой) | Fisher Scientific | 3720A | |
| Инкубатор для эмбрионов (мини/настольный) | Labnet | I5110A | |
| Флуоресцентный стереомикроскоп | Zeiss | Axio Zoom.V16 | Или аналогичный, с лазером/фильтром возбуждения 488 нм |
| Стеклянная пипетка Пастера | Fisher Scientific | 13-678-4 | Производитель Corning, нестерильный |
| антагонист InSolution Wnt I, IWR-1-endo | Millipore Sigma | 5.04462 | производства Calbiochem; 25 мМ в ДМСО; ознакомьтесь с требованиями к утилизации химических отходов |
| Метиленовый синий (порошок) | Fisher Scientific | BP117-100 | Также доступен в виде готового водостойного раствора |
| Метронидазол (МТЗ) | Millipore Sigma | M3761 | Ознакомьтесь с требованиями к утилизации химических отходов |
| N-фенилтиомочевины (PTU) | Millipore Sigma | P7629 | Ознакомьтесь с требованиями к утилизации химических отходов |
| Параформальдегид (16 % по массе) без метанола | Fisher Scientific | AA433689M | Химические отходы, требуется правильная утилизация |
| чашек Петри | Fisher Scientific | FB0875712 | диаметром 10 см |
| (пакеты с порошком) | Millipore Sigma | P3813 | Используется для изготовления 10 x PBS стокового |
| инкубатора Pronase | Millipore | Sigma PRON-RO | |
| Shakeking incubator | Benchmark | H2010 | Используется для инкубации MTZ в течение 1 часа при 37 градусах Цельсия |
| Стереомикроскоп | Leica S9i | Или аналогичный, с проходящим светом освещение | |
| Студенческий Дюмон #5 щипцы | Fine Science Tools | 91150-20 | Щипцы с тонким наконечником для ручной дехорионации |
| Настольный ротатор/шейкер | Scilogex | SK-D1807-E | |
| Переводная пипетка | Millipore Sigma | Z135003 | 3,2 мл лампочка протягивается, нестерильный |
| Трикаин метансульфонат (MS-222) | Pentair | TRS1, TRS2, TRS5 | Также доступно от Fisher Scientific (NC0342409) |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Software Material | |||
| FIJI (Fiji is Just ImageJ) | FIJI (Fiji is Just ImageJ) | https://imagej.net/software/fiji/ | Версия: 2.0.0-rc-69/1.52p; Сборка: 269a0ad53f; Требуется плагин: Био-форматы, |
| примеры GRAMM и инструкции | MathWorks | https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like. | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Toolbox, необходимые для запуска RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning |
| Toolbox MATLAB поддерживает | MathWorks | https://www.mathworks.com/support.html |
Ссылки
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Grierson, I., et al. repair and regeneration of the retinal pigment epithelium. Eye. 8 (2), 255-262 (1994).
- Hanovice, N. J., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
