Method Article

Оптимизированный одномолекулярный анализ для количественной оценки фосфорилирования белка

DOI:

10.3791/63665

⸱

June 6th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of New Mexico School of Medicine, 2Department of Physics and Astronomy, University of New Mexico, 3Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящий протокол описывает пробоподготовку и анализ данных для количественной оценки фосфорилирования белка с использованием улучшенного анализа вытягивания одной молекулы (SiMPull).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фосфорилирование является необходимой посттрансляционной модификацией, которая регулирует функцию белка и направляет результаты передачи сигналов клетками. Современные методы измерения фосфорилирования белка не могут сохранить гетерогенность фосфорилирования в отдельных белках. Анализ одномолекулярного вытягивания (SiMPull) был разработан для исследования состава макромолекулярных комплексов путем иммунопреципитации белков на стеклянном покровном листе с последующей одномолекулярной визуализацией. Современный метод представляет собой адаптацию SiMPull, которая обеспечивает надежную количественную оценку состояния фосфорилирования полноразмерных мембранных рецепторов на уровне одной молекулы. Визуализация тысяч отдельных рецепторов таким образом позволяет количественно оценить паттерны фосфорилирования белка. Настоящий протокол детализирует оптимизированную процедуру SiMPull, от подготовки образца до визуализации. Оптимизация препаратов стекла и протоколов фиксации антител еще больше повышает качество данных. Текущий протокол предоставляет код для анализа одномолекулярных данных, который вычисляет фракцию рецепторов, фосфорилированных в образце. Хотя эта работа фокусируется на фосфорилировании рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), протокол может быть обобщен на другие мембранные рецепторы и цитозольные сигнальные молекулы.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мембранно-ассоциированная сигнализация настраивается комбинацией активации мембранных рецепторов, индуцированной лигандами, и рекрутирования последующих вспомогательных белков, которые распространяют сигнал. Фосфорилирование ключевых тирозинов в рецепторных цитоплазматических хвостах имеет решающее значение для инициирования образования сигнальных комплексов, или сигналосом 1,2. Поэтому важным вопросом в биологии является то, как создаются и поддерживаются паттерны фосфорилирования для привлечения сигнальных партнеров и диктовки клеточных результатов. Это включает в себя понимание гетерогенности фосфорилирован....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка чехла

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого шага необходимо надеть средства индивидуальной защиты (СИЗ), которые включают в себя двойной слой нитриловых перчаток, защитные очки или лицевой щиток, а также лабораторный халат.

  1. Выполните травление пираньи, чтобы удалить органический мусор из стекла.
    ВНИМАНИЕ: Раствор пираньи является сильным окислителем, который является коррозионным и высокореакционноспособным при контакте с органическими материалами. Реакция с органическим мусором является экзотермической и потенциально взрывоопасной. Таким образом, процедура должна выполняться в химическом вытяжном шкафу с опущенн....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Карикатура, изображающая процесс SiMPull, показана на рисунке 1A. Покровные листы функционализируются с использованием NeutrAvidin в качестве якоря для биотинилированных антител против EGFR для захвата EGFR-GFP из общих белковых лизатов. После вымывания несвязанного белка фосфорилированные рецепторы мечутся антифосфотирозиновым (анти-PY) антителом15. На рисунке 1В показано изображение гидрофобной решетки, где несколько образцов могут быть.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол, описанный здесь, был оптимизирован для проведения количественных измерений фосфорилирования рецепторов на уровне одного белка. Было разработано несколько простых, но важных модификаций протокола SiMPull, которые повысили надежность измерения для обнаружения фосфо-тирозина, включая снижение аутофлуоресценции при обработке NaBH4 и постфиксацию образца для предотвращения диссоциации антител. Использование зеленой маски канала для идентификации расположения рецепторов для расчета колокализации с антитело.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения R35GM126934, R01AI153617 и R01CA248166 для DSL. EMB поддерживался в рамках программы ASERT-IRACDA (NIH K12GM088021) и JAR в рамках программы UNM MARC (NIH 2T34GM008751-20). Мы с благодарностью отмечаем использование общего ресурса флуоресцентной микроскопии Комплексного онкологического центра Университета Нью-Мексико, поддерживаемого NIH P30CA118100. Мы хотим отметить докторов Анкура Джайна и Тхэкиджипа Ха, чья оригинальная разработка SiMPull вдохновила эту работу.
ES-C нынешний адрес: Группа иммунодинамики, Лаборатория интегративной иммунологии рака, Центр исследований рака, Национальный институт....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Микроцентрифужные пробирки 1,5 млMTC BioC2000
10 мМ Tris-HCl pH 7,4
10 мМ Tris-HCl pH 8,0/ 50 мМ NaClT50 Буфер
100 мм Чашка для культуры тканейCELLTREAT229620Хранение травленого стекла/массивов пираний
15 мл Коническая пробирка
16% Параформальдегид водный РастворЭлектронная микроскопия Науки15710Опасный
50 мл Коническая трубкаФункционализированное стекло Хранение / повторное использование KOH
50 мМ Tris-HCl pH 7,2/150 мМ NaClЛизис Буферный компонент
60 мм Чашка для культуры тканейCorning430166
8% глутаральдегид Водный растворЭлектронная микроскопия Науки16020Опасный
ацетон (C3H6O)Millipore Sigma270725опасный
Alexa Fluor 647 NHS EsterThermo Fisher ScientificA-20006
Рекомбинантный человеческий EGF без животного происхожденияPeprotechAF-100-15
Anti-Human EGFR (внешний домен) – BiotinLeinco Technologies, IncE101
Anti-p-Tyr антитела (PY99) Alexa Fluor 647Santa Cruz Biotechnologysc-7020 AF647
Bath-sonicatorBranson1200
BCA Protein Assay Kit Pierce23227
Biotin-PEGLaysan BioBiotin-PEG-SVA, MW 5,000
Бычий сывороточный альбуминGold BiotechnologyA-420-1Тиродовский буферный компонент Воронка
Бюхнера Бунзеновская
горелка
Хлорид кальция (CaCl2)Millipore SigmaC4901Тиродовский буферный компонент
Скребок для клетокBioworld30900017-1
Коническая фильтрующая колбаFisher ScientificS15464
Банка для коплинаWHEATON900470
Автоматизированный счетчик ячеек Countess IIThermo Fisher ScientificAMQAX1000
Coverslips 24 x 60 #1.5Электронная микроскопия Науки63793
DipImagehttps://diplib.org/
DMEMCaisson LabsDML19-500
Камера emCCDAndor iXon
Фетальная бычья сыворотка, OptimaBio-TechneS12450HТермоинактивированный
Fusion 360 программное обеспечениеAutodesk
Geneticin G418 ДисульфатКессон LabsG030-5GM
Ледяная уксусная кислота (CH3COOH)JT BakerJTB-9526-01Опасный
Стеклянные серологические пипетки
Стеклянная палочка
глюкозы (D-(+)-глюкозы)Millipore SigmaD9434Буферный компонент Тироде
Halt Фосфотазы и ингибитора протеазы (100X)Thermo Fisher Scientific78446Буферный компонент лизиса
HEPESMillipore SigmaH3375TyrodeБуферный компонент
соляной кислоты (HCl)VWRBDH7204-1Опасная
перекись водорода (H2O2) (3%)HX0645
Перекись водорода (H2O2) (30%)EMD MilliporeHX0635-2
Ice
IGEPAL CA-630 ( NP-40)Sigma AldrichI8896Лизис буферный компонент
ImmEdge Гидрофобный барьер PenVector LaboratoriesH-4000
Immersol 518F Immersion oilZeiss444960-0000-000
собственная вакуумная линия
L-глутаминThermo Fisher Scientific25030-164
Гексагидрат хлорида магнесии (MgCl2-6H2O)MPBio2191421Tyrode's Buffer Component
MatlabMathworksCurve Fitting Toolbox, Набор инструментов для параллельных вычислений и набор инструментов для статистики и машинного обучения
Метанол (CH3OH)IBIS ScientificMX0486-1Опасная
водаMilli-Q
Mix-n-Stain CF Наборы для мечения антителBiotium92245Предлагаемый набор для конъюгации
mPEGLaysan BiomPEG-сукцинимидилвалерат, MW 5,000
N-(2-аминоэтил)-3-аминопропилтриметоксисиланUCT United ChemicalA0700Опасная
наносеткаMiraloma Tech
NeutrAvidin Biotin Связывающий белокThermo Fisher Scientific31000
Азот (сжатый газ)
NVIDIA GPU с CUDAИщите совместимость в https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html
Olympus iX71 МикроскопOlympus
Parafilm M Герметизирующая пленкаЛабораторное депоHS234526C
PBS pH 7.4Caisson LabsPBL06
PC-200 Аналоговая горячая пластинаCorning6795-200
Пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл)Thermo Fisher Scientific15140-163
Рецептор фосфо-EGF (Tyr1068) (1H12) Технология передачи сигналов клеток mAb мыши2236BF
Хлорид калия (KCl)Millipore Sigma529552Буферный компонент Tyrode
Гидроксид калия (KOH)Millipore Sigma1050330500опасная
нить премиум-класса PLA, диаметр 1,75 ммRaise 3DPMS: 2035U/RAL: 3028Диапазон температур печати: 205-235 ° C
Pro2 3D принтерRaise 3D
Pyrex 1 л стакан
PYREX 100 мл хранение бутылокCorning1395-100CH3OH/C3H6O повторное использование
Pyrex 250 мл стаканы
Pyrex 4 л стакан
Quad-view Изображение СплиттерФотометрическаямодель QV2
Охлаждаемая центрифугаEppendorfEP-5415R
RevCount Счетчики ячеек, EVE Cell Counting SlidesVWR10027-446
Эмиссионные фильтры Semrock: синий (445/45 нм), зеленый (525/45 нм), красный (600/37 нм), дальний красный (685/40 нм)SemrockLF405/488/561/635-4X4M-B-000
Серологический контроллер пипетки
Серологические пипетки
поражают пакетhttps://github.com/LidkeLab/smite.git
бикарбонат натрия (NaHCO3)Sigma AldrichS6014опасный
борогидрид натрия (NaBH4)Millipore Sigma452874Tyrode' s Буферный компонент
Хлорид натрия (NaCl)Millipore SigmaS9625Активация путем последовательного нагрева и циклирования pH
Гидроксид натрияVWRBDH3247-1
Ортванадат натрия (Na3VO4)Millipore SigmaS6508Опасная
серная кислота (H2SO4)Millipore Sigma258105опасные
микросферы TetraSpeckThermo Fisher ScientificT7279мультифлуоресцентные шарики
Трис (Тризма) основаMillipore SigmaT1503
Трипан синий морилка, 0,4%Thermo Fisher Scientific15250061
трипсин-ЭДТА 0,05%Thermo Fisher Scientific25300120
для перемешивания для анализа одной молекулы

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  2. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule Pull DownProtein PhosphorylationPhosphorylation QuantificationEGFR PhosphorylationImmunoprecipitation AssayAntibody LabelingGlass PreparationSingle Molecule ImagingColocalization AnalysisGaussian Localization

Related Articles