Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Прижизненная субклеточная микроскопия молочной железы

1.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63674

⸱

24 июня 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Cellular and Molecular Biology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Charles Perkins Centre, Central Clinical School, Faculty of Medicine and Health, The University of Sydney, 3Department of Molecular Physiology and Biological Physics, School of Medicine, University of Virginia

В этой статье

Краткое содержание

В настоящем протоколе описан простой метод прижизненной визуализации молочной железы лактирующей мыши с помощью лазерной сканирующей, конфокальной и многофотонной микроскопии.

Аннотация

Молочная железа представляет собой превосходную модель для исследования эпителиальных функций, включая ремоделирование тканей, полярность клеток и секреторные механизмы. Во время беременности железа расширяется от примитивного протокового дерева, встроенного в жировую подушку, до сильно разветвленной альвеолярной сети, предназначенной для образования и секреции молозива и молока. После родов железа поставляет все питательные вещества, необходимые для выживания новорожденного, включая липидные капли с мембранной оболочкой (LD), белки, углеводы, ионы и воду. Различные компоненты молока, включая лактозу, мицеллы казеина и обезжиренные молочные белки, синтезируются в альвеолярных клетках и секретируются из везикул путем экзоцитоза на апикальной поверхности. ЛД транспортируются от мест синтеза в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме к верхушке клетки, покрытой клеточными мембранами, и секретируются по уникальному апокриновому механизму. Другие преформированные компоненты, включая антитела и гормоны, транспортируются с серозальной стороны эпителия в молоко путем трансцитоза. Эти процессы поддаются прижизненной микроскопии, поскольку молочная железа является кожной железой и, следовательно, непосредственно доступна для экспериментальных манипуляций. В этой статье описана простая процедура исследования кинетики секреции LD in situ, в режиме реального времени, у живых мышей, находящихся под наркозом. Бор-дипиррометен (BODIPY)665/676 или монодансилпентан используются для мечения нейтральной липидной фракции трансгенных мышей, которые либо экспрессируют растворимый EGFP (усиленный зеленый флуоресцентный белок) в цитоплазме, либо мембранно-целевой пептид, слитый с EGFP или tdTomato. Меченые мембраной гибридные белки служат маркерами клеточных поверхностей, а липидные красители разрешают LDs ≥ 0,7 мкм. Покадровые изображения могут быть записаны с помощью стандартной лазерной сканирующей конфокальной микроскопии на глубину до 15-25 мкм или с помощью многофотонной микроскопии для визуализации глубже в ткани. Молочная железа может быть промыта фармакологическими агентами или флуоресцентными красителями на протяжении всей операции, обеспечивая платформу для проведения острых экспериментальных манипуляций по мере необходимости.

Введение

Прижизненная микроскопия молочной железы мышей привлекает повышенное внимание как мощный метод анализа целого ряда биологических явлений, включая происхождение и дифференцировку стволовых клеток 1,2, прогрессирование метастатических опухолей 3,4,5 и роль протоковых макрофагов в развитии и инволюции молочной железы6. Благодаря развитию прижизненной субклеточной микроскопии (ISMic)7 исследования были расширены до мембранного транспорта и секреторных механизмов во время лактации 8,9 и окситоцин-опосредованного сокращения миоэпителиальных клеток 9,10. Были разработаны два основных метода, которые используют доступность железы между кожей и стенками тела.

При первом подходе в обшивку вставляется акриловое или стеклянное окошко и закрепляется металлическим стопорным кольцом 1,3,11. Мыши хорошо переносят операцию, и различные явления могут анализироваться на прерывистой основе у одного и того же животного в течение нескольких недель. Этот метод оказался особенно полезным для отслеживания линии 1,12 и мониторинга инвазии и прогрессирования опухолей молочной железы in situ 3,11. Тем не менее, разрешение ниже целого клеточного уровня оказалось сложным, потому что железа все еще прикреплена к стенке тела и, таким образом, подвержена артефактам движения, вызванным дыханием и сердцебиением.

При втором доступе железа хирургическим путем обнажается на кожном лоскуте с интактной сосудистой сетью и стабилизируется на предметном столике микроскопа с помощью спейсеров 4,9,13. Таким образом, часть железы эффективно отделяется от брюшной стенки, а артефакты движения сводятся к минимуму. В большинстве случаев открытая паренхима помещается непосредственно на покровную крышку вентральной стороной мыши вниз на инвертированном микроскопе. В недавней модификации мышь была помещена лежа на спине на вертикальный микроскоп, а обнаженная железа была защищена в заполненной жидкостью ячейке, герметизированной покровным стеклом2. Эта последняя конфигурация обеспечивает доступ к паренхиматозной поверхности для экспериментальных манипуляций во время визуализации. Разрешение до <1 мкм, в любом случае, позволяет анализировать внутриклеточные процессы, примером чего является отслеживание липидных капель (LD) в эпителиальных клетках молочной железы9.

В настоящем протоколе подробно описан простой метод прижизненной визуализации эпителиальных клеток молочной железы на субклеточном уровне с использованием биогенеза, транспорта и секреции ЛД во время лактации в качестве примера. Этот подход широко применим ко многим другим процессам, включая транспорт и секрецию молочных белков14, трансцитоз белков с серозальной стороны эпителия в альвеолярный просвет 15,16 и ремоделирование железы во время инволюции17,18.

Мыши, экспрессирующие флуоресцентный белок, предпочтительны для большинства прижизненных экспериментов, чтобы облегчить выбор подходящих областей для визуализации и в качестве морфологического референсного маркера. Существует широкий спектр подходящих трансгенных мышей и мышей, которые экспрессируют флуоресцентные белковые маркеры в клеточных компартментах, цитоскелетных элементах,мембранах и органеллах. В приведенных примерах использовали мышь EGFPcyto FvB, у которой усиленный зеленый флуоресцентный белок (EGFP) нацелен на цитоплазму в большинстве клеток20 (обозначаются EGFPcyto), и мышь21 C57BL/6J Tomato (mT/mG), которая представляет собой двойную флуоресцентную линию Cre, кодирующую гены tdTomato и EGFP. Экспрессия EGFP обеспечивается за счет Cre-опосредованной эксцизии гена tdTomato. Любой из флуорофоров нацелен на плазматическую мембрану в большинстве клеток с помощью пайеток, полученных из белка21 MARCKS. В данной работе мыши, экспрессирующие красный флуорофор tdTomato, обозначаются как tdTomatomembr (mT), а мыши, экспрессирующие EGFP, после эксцизии гена tdTomato обозначаются как EGFPmembr (mG).

У мышей имеется пять пар молочных желез по обе стороны от вентральной средней линии, три в грудном отделе (пронумерованы 1-3) и две в паховой области (пронумерованы 4-5) (рис. 1А). Для ISMic паховые железы являются наиболее доступными и легко поддающимися стабилизации, так как они находятся дальше всего от глобальных движений, связанных с дыханием и сердцебиением в грудной клетке.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры для животных были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Центра исследований рака, Национального института рака, Национальных институтов здравоохранения в соответствии с Руководством Национального исследовательского совета США по уходу и использованию лабораторных животных, Политикой Службы общественного здравоохранения США по гуманному уходу и использованию лабораторных животных. и Руководство по уходу за лабораторными животными и их использованию. Для этой работы железы No 4 самок первородящих мышей (в возрасте 4-5 месяцев, 10-й день лактации) были хирургически подготовлены в положении лежа на правой руке (рис. 1А).

1. Подготовка животных

  1. Взвесьте мышь на весах с верхней загрузкой, чтобы рассчитать необходимое количество анестетика.
  2. Во время и после применения анестетиков поддерживайте температуру тела, положив мышь на греющую подушку.
  3. Обезболивают мышь путем кратковременного воздействия изофлурана (3,0%-3,5%) в насыщенной кислородом дыхательной камере (см. Таблицу материалов) в течение 1-2 мин с последующим внутрибрюшинным введением смеси 100 мг/кг кетамина и 10 мг/кг ксилазина.
  4. Поддерживайте животных в глубокой плоскости анестезии во время операции и визуализации, дополнительно вводя титруемые дозы ксилазина и кетамина (от половины до четверти начальной дозы, описанной в шаге 1.3) через постоянный катетер (см. шаг 3.4) каждые 45 минут или около того, по мере необходимости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальную плоскость анестезии легче всего поддерживать, проверяя зрительный рефлекс и рефлекс на пальцах ног каждые 10-20 минут. Температура мышей в сознании составляет 36,5-38 °С, которая снижается до 34,5 °С под наркозом.
  5. Перекрестное воспитание щенков22 , если доступны мыши-доноры на аналогичной стадии лактации; В противном случае усыпьте подстилку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Щенки в возрасте <10 дней должны быть усыплены путем воздействия 3,0% изофлурана с последующим обезглавливанием. Щенки в возрасте ≥ 10 дней должны быть усыплены путем ингаляции CO2 с последующим вывихом шейки матки.

2. Процедура операции

  1. Держите мышь в тепле на протяжении всей операции на грелке. Сбрейте шерсть с кожи, окружающей молочные железы под номером 4 и 5 (лежа, с правой стороны) с помощью ручной электрической бритвы. Очистите выбритый участок тремя чередующимися бетадиновыми и спиртовыми скрабами.
  2. Протрите все хирургические инструменты 70% спиртом. Сделайте разрез по средней линии ~1 см близко к четвертому соску, защипнув кожу пинцетом и разрезав приподнятую кожу острыми ножницами. Сделайте круговые разрезы вокруг железы как в краниальном, так и в каудальном направлениях и осторожно отшелушите кожу от живота. Поддерживайте открытые участки кожи влажными с помощью физиологического раствора.
  3. Чтобы свести к минимуму кровопотерю, запечатайте все выступающие кровеносные сосуды с помощью ручного прижигания (см. Таблицу материалов) перед тем, как разрезать их. Любая экзогенная кровь должна быть немедленно удалена физиологическим раствором, чтобы избежать последующей потери оптического разрешения.
  4. Удалите поверхностную соединительную и жировую ткань, аккуратно дразня поверхностный слой тонкими щипцами.
  5. Поддерживайте открытую железу влажной с помощью физиологического раствора и защищайте брюшную стенку гелем и полупрозрачной, гибкой, термопластичной пленкой (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 2.2-2.5 создают лоскут кожи с частью железы и связанной с ней сосудистой сетью, отделенной от брюшной стенки (Рисунок 1Bi-iv).
  6. При необходимости обработайте железу экзогенными препаратами, например, фармакологическими средствами или органеллоспецифичными красителями, промывая обнаженную железу во время операции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В приведенных примерах LD либо уEGFP cyto , либо у EGFPmembr (mG) мыши были помечены 1,0 мл бор-дипиррометена (BODIPY)665/676 (10 мМ стоковый раствор в диметилсульфоксиде, разведенный в 1-1000 раз в физиологическом растворе и применяемый в течение <1 ч) и у мышей tdTomatomembr (mT) или EGFPmembr (mG), с 0,5 мл монодансилпентана23 (0,1М стоковый раствор в диметилсульфоксиде, разведенный в 1-1000 раз в физрастворе и применяемый в течение 5 мин).

3. Подготовка к визуализации

  1. Осторожно расположите мышь брюшной стороной вниз на нагретом (37 °C) инвертированном предметном столике микроскопа таким образом, чтобы кожный лоскут доходил до центрального покровного стекла (30 мм) (рис. 1Biv). Открытые участки защитите тонким слоем геля.
  2. Стабилизируйте кожный лоскут с помощью специально изготовленных прокладок, чтобы смягчить железу от артефактов движения, вызванных дыханием и сердцебиением. Чтобы добиться этого, поместите прокладку с насечкой, сделанную из трех приклеенных ватных палочек (Рисунок 1Ci) между кожаным лоскутом и стенкой корпуса, а заднюю ногу и хвост прикрепите скотчем к сцене за прокладкой (Рисунок 1Bv).
  3. Предотвратите скольжение кожного лоскута во время визуализации, надежно закрепив пластиковую крышку (Рисунок 1Cii) с обоих концов на проеме сцены (Рисунок 1Bv).
  4. Введите подкожный постоянный катетер под тыльную сторону кожи, прикрепленный к трубке, шприцу и насосу (см. Таблицу материалов).
  5. Подтвердите стабильность кожного лоскута с адекватным кровотоком с помощью обычной флуоресцентной микроскопии (Рисунок 1Bvi).
  6. Накройте мышь губчатой марлей (см. Таблицу материалов), чтобы сохранить тепло во время визуализации,
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 3.1-3.5 являются наиболее важными для обеспечения получения видео с высоким разрешением, пригодных для количественного анализа. Нет смысла выходить за рамки этого этапа, если не подтверждена стабильность тканей.

4. Микроскопия

  1. Для обычной конфокальной микроскопии мыши EGFPcyto или EGFPmembr (mG), меченной BODIPY665/676 (рис. 2, видео 1 и видео 2), используйте инвертированный микроскоп, оснащенный предварительно нагретым 60-кратным объективом для погружения в масло, поддерживаемым при температуре 37 °C (см. Таблицу материалов).
    1. Отдельно детектировать EGFP и BODIPY665/676 с помощью лазеров 488 и 633 соответственно; для EGFP, возбуждение 488 нм, и излучение 560 нм, с полосовым фильтром BA 505-605; для BODIPY665/676, возбуждение 633 нм и излучение 668 нм, с полосовым фильтром BA 655-755.
    2. Собирайте изображения с помощью линейного сканирования со скоростью 4 или 8 μс/пиксель (512 x 512 пикселей; 12 бит на пиксель) каждые 5 с или 10 с в течение 1–2 часов и сохраняйте их в виде файлов TIFF. Вручную поддерживайте отсканированные области в кадре, корректируя смещение по оси x/y на протяжении всего цикла изображения. Создание трехмерных изображений на основе z-сканов с помощью программного обеспечения, связанного с микроскопом (см. Таблицу материалов).
  2. Для двухфотонной микроскопии мыши EGFPmembr (mG), меченной монодансилпентаном (Рисунок 3, Видео 3), используйте инвертированный микроскоп, оснащенный перестраиваемым лазером и предварительно нагретым при температуре 37 °C 30-кратным объективом (см. Таблицу материалов).
    1. Возбуждайте железу на длине волны 910 нм и детектируйте моноданзилпентан и EGFP с помощью двух детекторов GaAs, используя полосовые фильтры 410-460 нм и 495-540 нм для синего и зеленого излучений соответственно.
    2. Собирайте изображения с помощью линейного сканирования со скоростью 2 μс/пиксель (320 x 320 пикселей; 16 бит на пиксель) и сохраняйте их в виде файлов OIR. Вручную поддерживайте отсканированные области в кадре, корректируя смещение оси x/y на протяжении всего цикла изображения. Создавайте 3D-изображения на основе z-сканов с помощью программного обеспечения, связанного с микроскопом.
  3. Для двухфотонной микроскопии мыши tdTomatomembr (mT), меченной монодансилпентаном (Рисунок 4, Видео 4), используйте инвертированный микроскоп с перестраиваемыми лазерами и предварительно нагретый при температуре 37 °C 63-кратный объектив (см. Таблицу материалов).
    1. Возбуждайте образцы на длине волны 800 нм и 1060 нм одновременно и детектируйте монодансилпентан с помощью гибридного детектора HyD, настроенного на излучение 418-471 нм, и TdTomato с помощью другого гибридного детектора HyD, установленного на уровне излучения 595-667 нм.
    2. Соберите изображения с помощью линейного сканирования с помощью четырех линий со средним значением 200 Гц (512 x 512 пикселей; 12 бит на пиксель) и сохраните их в виде файлов LIF. Вручную поддерживайте отсканированные области в кадре, корректируя смещение оси x/y на протяжении всего цикла изображения. Создавайте 3D-изображения на основе z-сканов с помощью программного обеспечения, связанного с микроскопом.

5. Эвтаназия

  1. Усыпьте мышей в конце визуализации с помощью ингаляцииCO2 в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами.

6. Создание видеороликов в реальном времени

  1. Конвертируйте временные последовательности в файлы TIFF, а затем в видео с помощью соответствующего программного обеспечения (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количественный анализ конкретных видео выходит за рамки данной статьи и потребует конкретных методов для решения конкретных задач. Например, см. Ebrahim et al.24 о роли комплексов актиномиозина в экзоцитозе слюны из слюнной железы, Meyer et al.25 о динамике секреции желчи из печени и Masedunskas et al.9 об анализе секреции LD из эпителиальных клеток молочной железы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Молоко выделяется из поляризованных альвеолярных эпителиальных клеток, которые дифференцируются во время беременности из почек обширного протокового дерева26 (рисунок 2А). Предшественники для синтеза молока ассимилируются через базальные/боковые мембраны, а готовые продукты секретируются через апикальную поверхность в центральное «молочное пространство». Базальная сторона каждой альвеолы покрыта звездчатым массивом миоэпителиальных клеток (рисунок...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Использование однофотонного или многофотонного микроскопа зависит от задаваемых вопросов, характера и расположения ткани, которую необходимо изобразить, а также требуемого разрешения. Многофотонные микроскопы основаны на генерации двух или более низкоэнергетических фотонов в ближнем инфракрасном диапазоне, которые могут проникать в ткани на большую глубину с меньшей фототоксичностью, чем однофотонные микроскопы29,30. Кроме того, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Ни у кого из авторов нет противоречащих друг другу интересов.

Благодарности

Авторы благодарят Шерри Рауш и Самри Гебре (Национальный институт рака, NIH) за управление и уход за животными, а также Джеймса Мазера за помощь в производстве ряда пластиковых спейсеров. Это исследование было поддержано [частично] Программой внутренних исследований NIH.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
488 лазерMelles-Griot-CW  лазер 50 мВт
60x PLAPON масляный иммерсионный объектив (NA 1.42)Olympus1-U2B933Объектив конфокальный микроскоп
633 лазерMelles-Griot-CWHe-Ne лазер 12 мВт
63x объектив (NA 1.40, HC PL APO CS2)Leica11506350Lens Двухфотонный микроскоп
BA 410-460 нмChroma-Полосовой фильтр
BA 495-540 нмChroma-Band-passфильтр
BA 505-605 нмChroma-Band-passфильтр
BA 655-755 нмChroma-Band-passfilter
Бор-дипиррометан (BODIPY) 665/676Thermo Fisher ScientificB3932Датчик липидной пероксиации
Carbomer-940Snowdrift Farm739601480651Гелевый
катетерTerumoSV27ELКрылатые инфузионные наборы 
Прижигатель Braintree Scientific, IncGEM 5917Система прижигания
CMV-Cre мышь Jackson lab006054Mouse line
CoverslipBioptechs-30мм диаметр покровная кромка для инвертированного микроскопа
Curity 4x4 дюйма универсальная губчатая марляCovidien9024Sponge
EGFPcyto мышьJackson lab003291Mouse line
Fiji/ImageJ программное обеспечениес открытым исходным кодом- Бесплатное программное обеспечение
Тонкие щипцыBraintree Scientific, IncFC003 8тканевых щипцов
Микроскоп Fluoview 1000OlympusFV1000Конфокальный микроскоп
FluoView программное обеспечениемикроскоп и двухфотонный микроскоп
Ручная электрическая бритваBraintree Scientific, IncCLP-8786-451AБеспроводная машинка для стрижки
ГрелкаBraintree Scientific, IncDPIP Грелка для животных
HyD детекторыLeica-Leica4Tune спектральный детектор
Imaris программное обеспечение Bitplane/ Oxford instruments-Коммерческоепрограммное обеспечение
Ingisht X3 перестраиваемый лазерSpectra PhysicsInsight X3Настраиваемый импульс-лазер
ИзофлуранVetOne13985-046-40Обезболивающий
кетамин VetOne13985-702-10Анестетик
LAS X Программное обеспечениеLeica-Двухфотонныймикроскоп
Программный инструмент Mai-Tai перестраиваемый лазерSpectra ФизикаMai-TaiLaser
MetaMorphMolecularDevices-Коммерческийпрограммный инструмент
Монодансилпентан AUTODOTAbceptaSm1000aКраситель липидных капель
MPE-RS микроскопOlympusIX70Двухфотонный микроскоп
mT/mG мышьJackson lab007676Линия мышей
Нагреватель объективаBioptechs150819Нагреватель объектива как для конфокальных, так и для двухфотонных микроскопов
Кислородно-насыщенная дыхательная камераPatterson Scientific78933385, SAS3 и EVAC4Система газовой анестезии и эвакуации 
ПарапленкаHeathrow ScientificHS234526BПолупрозрачный, гибкий, термопластичный пленочный
детектор ФЭУOlympus-Descanned    детекторы
ФЭУ детекторLSM-технологияИзготовленные на заказнеразсканированные детекторы
НасосГарвардский аппарат703602, 704402Инжектор и контроллер Наномит
физраствораБиологический114-055-721EAНормальный физиологический раствор
Острые ножницы с тупым концомBraintree Scientific, IncSCT-S 508Хирургические
ножницыШприцCovidien22-257-1501мл туберкулиновый шприц
TCS SP8 Дайверский спектральный микроскопLeicaSP8Двухфотонный микроскоп
ПинцетBraintree Scientific, IncFC032Тканевые щипцы
Xylazine VetOne13985-704-10Обезболивающее
Olympus-Конфокальный Качество

Ссылки

  1. Scheele, C. L. G. J., et al. Identity and dynamics of mammary stem cells during branching morphogenesis. Nature. 542 (7641), 313-317 (2017).
  2. Dawson, C. A., Mueller, S. N., Lindeman, G. J., Rios, A. C., Visvader, J. E. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nature Protocols. 16 (4), 1907-1935 (2021).
  3. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  4. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2011).
  5. Ellenbroek, S. I. J., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nature Reviews Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).
  6. Dawson, C. A., et al. Tissue-resident ductal macrophages survey the mammary epithelium and facilitate tissue remodelling. Nature Cell Biology. 22 (5), 546-558 (2020).
  7. Ebrahim, S., Weigert, R. Intravital microscopy in mammalian multicellular organisms. Current Opinion in Cell Biology. 59, 97-103 (2019).
  8. Masedunskas, A., Weigert, R., Mather, I. H. Advances in Intravital Microscopy. Weigert, R. , Weigert) Springer-Verlag. Netherlands. 187-204 (2014).
  9. Masedunskas, A., Chen, Y., Stussman, R., Weigert, R., Mather, I. H. Kinetics of milk lipid droplet transport, growth, and secretion revealed by intravital imaging: lipid droplet release is intermittently stimulated by oxytocin. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 935-946 (2017).
  10. Stevenson, A. J., et al. Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally-mature mammary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 26822-26832 (2020).
  11. Shan, S., Sorg, B., Dewhirst, M. W. A novel rodent mammary window of orthotopic breast cancer for intravital microscopy. Microvascular Research. 65 (2), 109-117 (2003).
  12. Zomer, A., et al. Brief report: Intravital imaging of cancer stem cell plasticity in mammary tumors. Stem Cells. 31 (3), 602-606 (2013).
  13. Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2+ mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
  14. Burgoyne, R. D., Duncan, J. S. Secretion of milk proteins. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 3 (3), 275-286 (1998).
  15. Monks, J., Neville, M. C. Albumin transcytosis across the epithelium of the lactating mouse mammary gland. Journal of Physiology London. 560, 267-280 (2004).
  16. Boisgard, R., Chanat, E., Lavialle, F., Pauloin, A., Ollivier-Bousquet, M. Roads taken by milk proteins in mammary epithelial cells. Livestock Production Science. 70 (1-2), 49-61 (2001).
  17. Green, K. A., Lund, L. R. ECM degrading proteases and tissue remodelling in the mammary gland. Bioessays. 27 (9), 894-903 (2005).
  18. Lund, L. R., et al. Two distinct phases of apoptosis in mammary gland involution: proteinase-independent and -dependent pathways. Development. 122 (1), 181-193 (1996).
  19. Abe, T., Fujimori, T. Reporter mouse lines for fluorescence imaging. Develoment Growth and Differentiation. 55 (4), 390-405 (2013).
  20. Hadjantonakis, A. K., Gertsenstein, M., Ikawa, M., Okabe, M., Nagy, A. Generating green fluorescent mice by germline transmission of green fluorescent ES cells. Mechanisms of Development. 76 (1-2), 79-90 (1998).
  21. Mazumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  22. Fostering litters. The Jackson Laboratory. , Available from: https://www.jax.org/jax-mice-and-services/customer-support/technical-support/breeding-and-husbandry-support/general-husbandry-tips# (2022).
  23. Yang, H. -J., Hsu, C. -L., Yang, J. -Y., Yang, W. -Y. Monodansylpentane as a blue-fluorescent lipid-droplet marker for multi-color live-cell imaging. PloS One. 7 (3), 32693(2012).
  24. Ebrahim, S., et al. Dynamic polyhedral actomyosin lattices remodel micron-scale curved membranes during exocytosis in live mice. Nature Cell Biology. 21 (8), 933-939 (2019).
  25. Meyer, K., et al. A predictive 3D multi-scale model of biliary fluid dynamics in the liver lobule. Cell Systems. 4 (3), 277-290 (2017).
  26. Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).
  27. Mather, I. H., Masedunskas, A., Chen, Y., Weigert, R. Symposium review: Intravital imaging of the lactating mammary gland in live mice reveals novel aspects of milk-lipid secretion. Journal of Dairy Science. 102 (3), 2760-2782 (2019).
  28. Caspi, A., Granek, R., Elbaum, M. Enhanced diffusion in active intracellular transport. Physical Review Letters. 85, 5655-5658 (2000).
  29. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  30. Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. Imaging cell biology in live animals: Ready for prime time. Journal of Cell Biology. 201 (7), 969-979 (2013).
  31. So, P. T. C. Two-photon fluorescence light microscopy. Encyclopedia of Life Sciences. , 1-5 (2002).
  32. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563(2011).
  33. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562(2011).
  34. Nishinakagawa, H., Mochizuki, K., Nishida, S. On the blood supply to the mammary glands of the mouse, rat, hamster and guinea-pig. Japanese Journal of Zoological Science. 39 (7), 283-291 (1968).
  35. Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51086(2014).
  36. Palade, G. Intracellular aspects of the process of protein synthesis. Science. 189 (4200), 347-358 (1975).
  37. Heald, C. W., Saacke, R. G. Cytological comparison of milk protein synthesis of rat mammary tissue in vivo and in vitro. Journal of Dairy Science. 55 (5), 621-628 (1972).
  38. Hunziker, W., Kraehenbuhl, J. P. Epithelial transcytosis of immunoglobulins. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 3 (3), 287-302 (1998).
  39. Messal, H. A., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. An intravital microscopy toolbox to study mammary gland dynamics from cellular level to organ scale. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 26 (1), 9-27 (2021).
  40. Teter, B. B., Sampugna, J., Keeney, M. Milk fat depression in C57Bl/6J mice consuming partially hydrogenated fat. Journal of Nutrition. 120 (8), 818-824 (1990).
  41. Russell, T. D., et al. Transduction of the mammary epithelium with adenovirus vectors in vivo. Journal of Virology. 77 (10), 5801-5809 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

интравитальная микроскопиясубклеточная визуализациясекреция липидных капельконфокальная микроскопиядвухфотонная микроскопиясекреторные эпителиальные клеткимыши EGFPапокриновая секрециятайм-лапс визуализация
Прижизненная субклеточная микроскопия молочной железы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.