Сочетание вирусной векторной трансдукции и очистки мозга с помощью метода CLARITY позволяет исследовать большое количество нейронов и астроцитов одновременно.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Исследование пространственного взаимодействия между астроцитами и нейронами в очищенном мозге
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Сочетание вирусной векторной трансдукции и очистки тканей с помощью метода CLARITY позволяет одновременно исследовать несколько типов клеток головного мозга и их взаимодействия. Вирусная векторная трансдукция позволяет маркировать различные типы клеток различными цветами флуоресценции в одной и той же ткани. Клетки могут быть идентифицированы генетически по активности или проекции. Используя модифицированный протокол CLARITY, потенциальный размер выборки астроцитов и нейронов вырос на 2-3 порядка. Использование CLARITY позволяет визуализировать полные астроциты, которые слишком велики, чтобы поместиться в них целиком в срезы, и исследовать соматы со всеми их процессами. Кроме того, он дает возможность исследовать пространственное взаимодействие между астроцитами и различными типами нейрональных клеток, а именно количество пирамидных нейронов в каждом астроцитарном домене или близость между астроцитами и специфическими ингибирующими популяциями нейронов. В настоящем документе подробно описывается, как должны применяться эти методы.
Введение
В последние годы знания о функции астроцитов и о том, как они взаимодействуют с нейронными цепями, резко возросли. Астроциты могут влиять на пластичность 1,2, помогать в восстановлении нейронов после травмы 3,4 и даже индуцировать de novo нейрональное потенцирование, причем недавние исследования демонстрируют важность астроцитов в приобретении памяти и вознаграждении, ранее рассматриваемых как чисто нейронные функции 5,6,7 . Особенностью, представляющ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Экспериментальные протоколы были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Еврейским университетом и соответствовали руководящим принципам Руководства Национального института здравоохранения по уходу за лабораторными животными и их использованию.
1. Вирусная векторная трансдукция
ПРИМЕЧАНИЕ: Вирусная векторная трансдукция используется для экспрессии флуорофоров в головном мозге.
- Используйте атлас (например, Allen Brain Atlas) для определения соответствующей координации целевой области.
ПРИМЕЧАНИЕ: 3D-атласы можно найти в Интернете (например, http://connectivity.brai....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Успешная очистка толстых срезов мозговой ткани приводит к новому кругу вопросов, которые можно задать относительно свойств больших клеточных популяций в отличие от свойств отдельных клеток или соседних групп клеток. Для достижения успешных результатов следует строго придерживаться протокола CLARITY, так как существует широкий спектр параметров, которые необходимо учитывать для уменьшения дисперсии между образцами (например, процент четкости, информация о флуоресценции, параметры опухания).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Методы очистки тканей представляют собой революционный инструмент в исследованиях мозга, вызывая вопросы, которые ранее не могли быть заданы. Нацеливаясь на свойства небольшой группы клеток, одной клетки или даже одного синапса, CLARITY теперь позволяет нацеливаться на общие популяции клеток или функции связи на большие расстояния с помощью соответствующих флуорофоров.
Результат комбинации экспрессии флуорофора и процедуры CLARITY не является бинарным; многие факторы могут мешать процедуре, чт.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Благодарности
Этот проект получил финансирование от Европейского исследовательского совета (ERC) в рамках исследовательской и инновационной программы Европейского союза Horizon 2020 (грантовое соглашение No 803589), Израильского научного фонда (грант ISF No 1815/18) и канадско-израильских грантов (CIHR-ISF, грант No 2591/18). Мы благодарим Нехаму Новика за комментарий ко всей рукописи.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| AAV1-GFAP::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | вирусный вектор, используемый для обнаружения астроцитов | |
| AAV5-CaMKII::eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | вирусный вектор, используемый для обнаружения нейронов | |
| AAV5-CaMKII::H2B-eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | вирусный вектор, используемый для обнаружения ядер нейронов | |
| AAV5-CaMKII::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | вирусный вектор, используемый для обнаружения нейронов | |
| Акриламид (40%) | Bio-rad | #161-0140 | |
| Бисакриламид (2%) | Bio-rad | #161-0142 | |
| Борная кислота | Сигма | #B7901 | Молекулярная масса - 61,83 г/моль |
| Конфокальный микроскоп, сканирование, объектив FV1000 | Olympus | 4x (UPlanSApo, 0,16 NA) | |
| Программное обеспечение | ImarisBitplane, Великобритания | Программное обеспечение, позволяющее проводить 3D-анализ изображений | |
| NaOH | Sigma | #S5881 | |
| PBS | |||
| PFA 4% | EMS | #15710 | |
| RapiClear | SunJin lab | #RC147002 | |
| RapiClear CS | SunJin lab | #RCCS002 | |
| SDS | Sigma | #L3771 | |
| Программное обеспечение | Программное обеспечение, позволяющее проводить 3D-анализ изображений с использованием виртуальной реальности | ||
| Tris base 1 M | Bio-rad | #002009239100 | Молекулярная масса - 121,14 г/моль |
| Triton X-100 | ChemCruz | #sc-29112A | |
| Двухфотонный микроскоп | Neurolabware | Ti:сапфировый лазер (Chameleon Discovery TPC, Coherent), фотоумножитель GaAsP (Hamamatsu, H10770-40), полосовой фильтр (Semrock), объектив с водяным погружением 16x (Nikon, 0.8 NA) | |
| VA-044 Инициатор | Wako | #011-19365 |
Ссылки
- Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information. Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).
- Ciappelloni, S., et al. Aquaporin-4 sur....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
