Method Article

Оценка митохондриальной функции в седалищном нерве с помощью респирометрии высокого разрешения

DOI:

10.3791/63690

⸱

May 5th, 2022

 , 
1Instituto de Bioquímica Médica Leopoldo de Meis, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Респирометрия высокого разрешения в сочетании с флуоресцентными датчиками определяет потребление митохондриального кислорода и генерацию активных форм кислорода (АФК). Настоящий протокол описывает метод оценки скорости дыхания митохондрий и продукции АФК в пермеабилизированном седалищном нерве.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Митохондриальная дисфункция в периферических нервах сопровождает несколько заболеваний, связанных с периферической невропатией, которые могут быть вызваны несколькими причинами, включая аутоиммунные заболевания, диабет, инфекции, наследственные расстройства и опухоли. Оценка митохондриальной функции в периферических нервах мыши может быть сложной задачей из-за небольшого размера выборки, ограниченного количества митохондрий, присутствующих в ткани, и наличия миелиновой оболочки. Метод, описанный в этой работе, минимизирует эти проблемы, используя уникальный протокол пермеабилизации, адаптированный из того, который используется для мышечных волокон, для оценки митохондриальной функции седалищного нерва вместо выделения митохондрий из ткани. Измеряя продукцию флуориметрических реактивных видов с помощью Amplex Red/Peroxidase и сравнивая различные митохондриальные субстраты и ингибиторы в сапонин-пермеабилизированных нервах, можно было одновременно обнаружить митохондриальные респираторные состояния, активные формы кислорода (АФК) и активность митохондриальных комплексов. Таким образом, метод, представленный здесь, предлагает преимущества по сравнению с оценкой митохондриальной функции другими методами.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Митохондрии необходимы для поддержания жизнеспособности клеток и выполняют многочисленные клеточные функции, такие как энергетический метаболизм (пути метаболизма глюкозы, аминокислот, липидов и нуклеотидов). Как основной участок производства активных форм кислорода (АФК), митохондрии занимают центральное место в нескольких клеточных сигнальных процессах, таких как апоптоз, и участвуют в синтезе железо-серных (Fe-S) кластеров, импорте и созревании митохондриального белка и поддержании их генома и рибосом 1,2,3. Сеть динамики митохондриальных мембран контролируется процессами ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящий протокол одобрен Комитетом по этике использования животных в исследованиях, CCS/UFRJ (CEUA-101/19) и руководящими принципами Национальных институтов здравоохранения по уходу за экспериментальными животными и их использованию. Седалищный нерв изолирован от четырехмесячных самцов мышей C57BL/6, усыпленных вывихом шейки матки в соответствии с институциональными руководящими принципами. Этапы протокола оптимизированы, чтобы избежать ухудшения митохондрий. Поэтому в этом протоколе калибровка полярографических датчиков кислорода выполнялась до рассечения и пермеабилизации ткани седалищного нерва мыши.

1. Подготовка реагентов

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Потребление митохондриального кислорода пермеабилизированным седалищным нервом представлено на рисунке 2. Красный след представляет собой поток O2 на единицу массы в pmol/s.mg. После регистрации базального потребления кислорода эндогенными субстратами (рутинное дыхание) вводится сукцинат (SUCC) для записи дыхания, управляемого комплексом II (сукцинатдегидрогеназа), что приводит к увеличению скорости потребления кислорода. Последовательно добавляется насыщенная концентрация АДФ, ак.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Некоторые заболевания или состояния, сопровождающие невропатии, имеют митохондриальную дисфункцию в качестве фактора риска. Оценка функции митохондрий в периферических нервах имеет важное значение для выяснения того, как митохондрии действуют в этих нейродегенеративных состояниях. Оценка митохондриальной функции является трудоемкой из-за сложности метода изоляции и дефицита материала. Таким образом, разработка методов пермеабилизации тканей, которые не требуют выделения митохондрий, имеет важное значение.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование финансировалось Институтом Серрапилхейры, Фондом организации ампаро в Пескисе по вопросам развития Рио-де-Жанейро (ФАПЕРЖ), Национальным советом по научным вопросам и технологиям (CNPq) и Координационным советом по вопросам образования в Нижнем Бразилии (CAPES). Мы благодарны д-ру Антонио Галине Фильо, д-ру Монике Монтеро Ломели и д-ру Клаудио Масуде за поддержку с лабораторным оборудованием, а также доктору Марте Соренсон за добрые и ценные комментарии по улучшению статьи.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Аденозин 5' трифосфат динатрий сольгидрат Sigma-AldrichA26209
Аденозин 5′-дифосфат натриевая сольSigma-AldrichA2754
Amplex Red РеагентThermo Fisher scientificA12222Amplex Red получен в ДМСО в соответствии с техническим описанием продукта
Антимицин А (из Streptomyces sp.)Sigma-AldrichA8674
Бычья сыворотка альбуминSigma-AldrichA7030фракция теплового шока, без протеазы, без жирных кислот, практически без глобулина, pH 7, ≥ 98%
Карбонат кальцияSigma-AldrichC6763
Карбонилцианид 4-(трифторметокси)фенилгидразон (FCCP)Sigma-AldrichC2920
Цитохром cSigma-AldrichC7752(из сердца лошади; малый гемпротеин)
DataLab version 5.1.1.91OROBOROS INSTRUMENTS, АвстрияCopyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger
Цифровой орбитальный микропланшетный шейкер 120VThermo Fisher scientific88882005
DL-DithiothreitolSigma-Aldrich43819
EGTA натриевая сольSigma-AldrichE8145
Шприц HamiltonSigma-AldrichHAM8007510 мкл, 25 мкл и 50 мкл
HEPESSigma-AldrichH3375
Водород раствор перекиси 30% в/бMerckH1009
ИмидазолСигма-ОлдричI2399
L-(&минус;)-Яблочная кислотаSigma-AldrichM7397
Хлорид магния гексагидратSigma-AldrichM2393
MES Натриевая сольSigma-AldrichM3885
Микрорассекающие щипцы, изогнутыеSigma-AldrichF4142
Микрорассекающие щипцы, прямыеSigma-AldrichF4017
O2K - Набор фильтров Amplex RedOROBOROS INSTRUMENTS, Австрия44321-01Фашинг М., Сумбалова З., Гнайгер Э. (2013) O2k-Флуориметрия: продукция HRR и H2O2 в митохондриях мозга мыши. Физиологическая сеть митохондр 17.17.
O2K - Флуоресцентный LED2 - модульный компонент Флуоресцентный сенсор ЗеленыйOROBOROS INSTRUMENTS, Австрия44210-01
ОлигомицинSigma-AldrichO4876(из Streptomyces diastatochromogenes; смесь олигомицинов A, B и C
OROBOROS Oxygraph-2kOROBOROS INSTRUMENTS, Австрияhttp://www.oroboros.at
пальмитоилкарнитин (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl)Sigma-AldrichP4509
Пероксидаза из хренаSigma-AldrichP8375
Чашки Петри, полистиролMERCKP5606
Фосфокреатин динатриевая соль гидратSigma-AldrichP7936
Калия дигидрофосфат одноосновнойSigma-AldrichPHR1330
Калия гидроксидСигма-Олдрич221473
РотенонСигма-ОлдричR8875
СапонинСигма-ОлдричSAE0073
Пируват натрияСигма-ОлдричP5280
Сукцинат натрия двухосновной гексагидратСигма-ОлдричS2378
СахарозаСигма-ОлдричS9378
ТауринСигма-ОлдричТ0625

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial protein organization: from biogenesis to networks and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
  2. Sena, L. A., Chandel, N. S. Physiological roles of mitochondrial reac....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial FunctionSciatic NerveHigh Resolution RespirometryOxygen ConsumptionReactive Oxygen SpeciesSaponin PermeabilizationElectron Transport SystemMitochondrial Complex ActivityATP SynthesisPeripheral Neuropathy

Related Articles