Пероральное комбинированное антиретровирусное лечение у ВИЧ-1 инфицированных гуманизированных мышей

Ожидаемая продолжительность жизни лиц, инфицированных хроническим вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), значительно улучшилась при комбинированном антиретровирусном лечении (кАРТ)^1,2. cART успешно снижает репликацию ВИЧ-1 и увеличивает количество CD4+ Т-клеток до нормального состояния у большинства ВИЧ-1 хронически инфицированных участников³, что приводит к улучшению общего состояния здоровья и резкому снижению прогрессирования заболевания⁴. Однако латентный резервуар ВИЧ-1 устанавливается даже тогда, когда АРТ инициируется во время острой инфекции ^5,6,7. Резервуары сохраняются в течение многих лет во время АРТ, а быстрый вирусный отскок после прерывания АРТ хорошо документирован ^8,9. Люди, живущие с ВИЧ на АРТ, также предрасположены к более высокому риску сопутствующих заболеваний, таких как сердечно-сосудистые заболевания, рак и нервные расстройства 10,11,12. Поэтому необходимо функциональное лекарство от ВИЧ. Животные модели для инфекции ВИЧ-1 предлагают очевидные преимущества в разработке и проверке новых стратегий лечения ВИЧ 13,14,15. Гуманизированные мыши, как модель на небольших животных, могут обеспечить многолинейное восстановление иммунных клеток человека в различных тканях, что позволяет проводить тщательное изучение ВИЧ-инфекции 16,17,18,19. Среди гуманизированных моделей гуманизированная модель костного мозга-печени-тимуса (BLT) успешно рекапитулирует хроническую инфекцию ВИЧ-1, а также функциональные иммунные реакции человека на инфекцию ВИЧ-1 20,21,22,23,24. Поэтому гуманизированная модель мыши BLT широко используется для изучения различных аспектов в области исследований ВИЧ. Гуманизированные мыши BLT являются не только хорошо зарекомендовавшими себя моделями для рекапитуляции персистирующей инфекции ВИЧ-1 и патогенеза, но и последовательными инструментами для оценки стратегий вмешательства на основе клеточной терапии. Нынешние авторы и другие продемонстрировали, что гуманизированная модель мышей BLT рекапитулирует персистирующую инфекцию ВИЧ-1 и патогенез 25,26,27 и предоставляет инструменты для оценки стратегий вмешательства на основе клеточной терапии 28,29,30,31,32,33.

Схемы cART, состоящие из комбинаций антиретровирусных препаратов, которые ежедневно принимаются, подавляют репликацию ВИЧ-1 до такой степени, что вирусная нагрузка у успешно пролеченных лиц остается неопределяемой в течение длительного^{времени 34}. Результаты лечения ВИЧ-инфицированных гуманизированных мышей клинически значимыми схемами кАРТ аналогичны тем, которые наблюдались у ВИЧ-1 инфицированных АРТ лиц²²: уровни ВИЧ-1 подавляются ниже пределов обнаружения, а прерывание кАРТ приводит к отскоку репликации ВИЧ из латентного резервуара³⁵. Подкожная (SC)27,36,37 или внутрибрюшинная (IP)^37,38,39 инъекция является маршрутом, обычно используемым для лечения кАРТ у гуманизированных мышей. Однако интенсивная ежедневная инъекция вызывает стресс у животных при физическом сдерживании⁴⁰. Это также трудоемко и потенциально небезопасно для исследователей из-за повышенного воздействия ВИЧ при использовании острых предметов. Пероральное введение идеально подходит для имитации абсорбции, распределения и выведения препаратов кАРТ, которые принимаются ВИЧ-1-инфицированными людьми. Пероральное введение обычно включает в себя индивидуальные и часто трудоемкие процедуры для введения антиретровирусных препаратов в стерилизованную (необходимую из-за иммунодефицита мышей) пищу 24,37,41 или воду 42,43,44,45,46 , которые могут быть или не быть химически совместимыми со многими антиретровирусными препаратами или приводить к чему-то, что мыши не будут легко есть или пить (что повлияет на дозу и уровень лекарств в организме). Новый метод перорального введения кАРТ, предложенный здесь, превосходит предыдущие попытки доставки из-за его совместимости с различными типами антиретровирусных препаратов, безопасности и простоты приготовления и введения, а также снижения стресса и беспокойства животных в результате ежедневной инъекции.

Тенофовир дизопроксил фумарат (TDF), Элвитегравир (ELV) и Ралтегравир (RAL) являются плохо водорастворимыми препаратами. Интересно, что повышенная биодоступность TDF наблюдается с жирной пищей, предполагая, что конкурентное ингибирование липаз жирной пищей может обеспечить определенную защиту TDF⁴⁷. Поэтому чашки DietGel Boost были выбраны для замены обычного чау-чау для грызунов в качестве метода доставки, основанного на их скромном содержании жира (20,3 г на 100 г) по сравнению с обычным чау-чау грызунов (10 г на 100 г) и типичной диетой с высоким содержанием жиров у мышей (40-60 г на 100 г)⁴⁸. Общий вес одной чашки составляет 75 г; таким образом, каждая чашка будет содержать количество пищи, а значит и лекарство, достаточное для пяти мышей в течение 3 дней.

Анонимная ткань человеческого плода была приобретена коммерчески. Исследования на животных проводились в соответствии с протоколами, одобренными Калифорнийским университетом в Лос-Анджелесе и Комитетом по исследованиям животных (ARC) (UCLA) в соответствии со всеми федеральными, государственными и местными руководящими принципами. В частности, все эксперименты проводились в соответствии с рекомендациями и руководящими принципами по содержанию и уходу за лабораторными животными Национальных институтов здравоохранения (NIH) и Международной ассоциации по оценке и аккредитации ухода за лабораторными животными (AALAC) в соответствии с Протоколом UCLA ARC No 2010-038-02B. Все операции проводились под кетамином (100 мг/кг)/ксилазином (5 мг/кг) и изофлурановой анестезией (2-3 об.), и были предприняты все усилия для минимизации боли и дискомфорта животных.

1. Гуманизированные мыши, инфицированные ВИЧ-1

ПРИМЕЧАНИЕ: Гуманизированные мыши были построены, как описано ранее в 30,31,49. Протокол кратко описан ниже.

1. Очищайте CD34+ кроветворные клетки-предшественники из печени плода человека с помощью микрошариков против CD34 в соответствии с протоколом производителя.
2. Обезболивать 6-8-недельных мышей NOD/SCID/IL2Rγ−/− (NSG) самцов и самок и сублетально облучать (2,7 Гр) перед операцией.
3. Имплантируйте тимус, полученный от того же донора, что и печень плода, под почечную капсулу вместе с печенью.
4. После имплантации вводите мышам от 0,5 до одного миллиона клеток CD34+ внутривенно.
5. Через 8-10 недель собирают 100 мкл мышиной крови с помощью ретроорбитального кровотечения⁵⁰ в микроцентрифужные трубки, содержащие 5 мкл ЭДТА и центрифугу при 350 х г в течение 3 мин.
6. Храните плазму при -80 °C для мониторинга вирусной нагрузки после того, как мышь была инфицирована ВИЧ-1. Добавьте 2 мл 83% раствора NH4C и инкубируйте в течение 5 мин при комнатной температуре для лизирования эритроцитов.
7. Добавьте 10 мл RPMI с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), чтобы остановить лизис. Открутите при 300 х г в течение 5 мин.
8. Аспират супернатант. Окрашивание клеток панелью антител (см. Таблицу материалов) и анализ с помощью проточной цитометрии для проверки приживления иммунных клеток человека.
9. Инфицировать мышей, демонстрирующих более 50% циркулирующих клеток CD45+, путем ретроорбитальной инъекции в ^{вену 51,52} с не менее 200 нг р24 штамма ВИЧ-1 (т.е. NFNSXSL9 30,53,54) с помощью инсулинового шприца. Собирать кровь раз в две недели для анализа проточной цитометрии и измерения вирусной нагрузки.

2. Приготовление препаратов АРТ

1. Взвешивание отдельных препаратов; Например, чтобы сделать 10 пищевых стаканчиков с cART, используйте стерильные клеточные скребки для взвешивания 250 мг FTC (Эмтрицитабина), 375 мг TDF и 500 мг RAL или ELV в отдельные стерильные центрифужные трубки 15 мл в шкафу биобезопасности.
2. Добавьте 1 мл ДМСО в пробирку FTC 250 мг (конечная концентрация 250 мг/мл), добавьте 1,5 мл ДМСО в пробирку 375 мг TDF (конечная концентрация 250 мг/мл) и добавьте 1 мл ДМСО в 500 мг RAL или ELV трубку (конечная концентрация 500 мг/мл). Перемешайте или пипетируйте смесь препарата до полного растворения и получения прозрачного раствора.
3. Используйте гидрофильный мембранный фильтр PVDF размером пор 0,22 мкМ для стерилизации растворов стерильным шприцем. Отдельные растворы препарата можно хранить при -20 °С в течение 12 недель.
4. Когда готовы к применению, только что разморозьте по одной аликвоте каждого раствора препарата при 37 °C до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. Хорошо перемешать с помощью пипетки.
5. Комбинируйте препараты и хорошо смешивайте, чтобы составить мастер-микс: 1 мл FTC в DMSO, 1,5 мл TDF в DMSO и 1 мл ELV или RAL в DMSO.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это количество составит 10 пищевых чашек.
6. Добавьте 350 мкл раствора cART master mix в одну чашку, чтобы сделать одну чашку DietGel Boost cART.
7. Добавьте в чашку 0,75 мл триметоприма-сульфаметоксазола (конечная концентрация 0,48 мг/мл).
8. Тщательно перемешайте, используя 1 мл стерильных наконечников пипетки.
9. Aliquot чашка с пищей, содержащая cART из оригинальной чашки с микропатком на чашку Петри 60 мм по мере необходимости. Взвесьте пищу на весах, чтобы рассчитать количество чашки с пищей, содержащей cART для каждой клетки, в соответствии с количеством мышей.

3. Назначение препаратов АРТ ВИЧ-1 инфицированным мышам

1. Выньте обычный чау из клетки и замените его чашкой с пищей, содержащей cART.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В среднем мышь съедает до 5 г пищи в день. Примерно одну чашку с пищей можно вводить пяти мышам в течение 2 дней.
2. Обновляйте пищу cART три раза в неделю.
3. Взвешивайте использованные чашки для контроля потребления. Взвешивайте мышей еженедельно, чтобы подтвердить потребление.

4. Мониторинг вирусной нагрузки с помощью ПЦР в режиме реального времени

1. Оценка иммунных клеток человека (уровни CD4 и CD8 Т-клеток) и репликации ВИЧ-1 у мышей BLT каждые 2 недели путем ретроорбитального кровотечения. Соберите плазму, следуя инструкциям на шагах 1.5-1.8.
2. Мониторинг вирусной нагрузки плазмы мышей, инфицированных ВИЧ-1 до и во время перорального приема кАРТ в течение 8 недель. Извлеките вирусную РНК плазмы из плазмы с помощью набора для экстракции вирусной РНК и количественно оцените ее с помощью ПЦР в режиме реального времени с использованием праймеров и зондов (см. Таблицу материалов), как описано ранее 27,30,31. Используйте следующий протокол цикла: 48 °C (15 мин), 95 °C (10 мин), затем 95 °C (15 с), 60 °C (1 мин) в течение 45 циклов.

5. Оценка соотношения CD4/CD8 с помощью проточной цитометрии

1. Готовят одноклеточные суспензии из периферической крови двухнедельных кровотечений, следуя шагам 1,5-1,8.
2. Окрашивание клеток поверхностными маркерами и анализ методом проточной цитометрии. Используют следующие поверхностные маркерные антитела 27,30,43,49 в проточной цитометрии: CD45 (клон HI30), CD8 (клон SK1), CD3 (клон OKT3), CD4 (клон RPA-T4)27,30,42,49.

Предполагая, что средняя мышь с весом 25 г потребляет 4 г пищи в день, суточная доза препарата при пероральном приеме соответствует 2,88 мг / кг TFV, 83 мг / кг FTC и 768 мг / кг RAL. Чтобы проверить, является ли оптимизированный режим питания токсичным и влияет ли на общее состояние здоровья по сравнению с ежедневной инъекцией кАРТ, вес мышей контролировали еженедельно до и во время кАРТ с помощью пероральной или подкожной инъекции. Не было существенных различий в весе до введения cART в каждой группе (рисунок 1). Тем не менее, вес мышей постоянно снижался во время ежедневной инъекции cART SC. Напротив, FTC / TDF / ELV или FTC / TDF / RAL в DietGel восстанавливали вес мышей до уровней до начала АРТ после 5 недель перорального приема кАРТ. Кроме того, не наблюдалось значительных изменений веса между группами Ралтегравира или Элвитегравира.

Чтобы проверить, подавляет ли пероральный прием кАРТ вирусную нагрузку так же эффективно, как ежедневная инъекция, двухнедельную вирусную нагрузку плазмы оценивали с помощью ОТ-ПЦР. На рисунке 2 показано, что режим питания FTC/TDF/ELV ART на 100% эффективно подавлял репликацию вируса до неопределяемых уровней в течение 4 недель; Режим питания FTC / TDF / RAL ART может подавлять 80% мышей до неопределяемых уровней в течение 4 недель, тогда как только 70% мышей, получавших инъекцию SC, достигли неопределяемых уровней после 4 недель лечения. Результаты показали, что пероральное введение подавляет репликацию вируса быстрее и эффективнее, чем инъекция SC. Кроме того, режим питания кАРТ предотвращал дальнейшее снижение соотношения CD4/CD8 в периферической крови раньше, чем суточная инъекция SC (рисунок 3). Эти результаты показали, что предлагаемый пероральный режим кАРТ может успешно подавлять вирусемию плазмы ниже уровня обнаружения, быстро восстанавливать уровни CD4 Т-клеток и улучшать общее состояние здоровья животных у ВИЧ-1 инфицированных гуманизированных мышей.

Рисунок 1: Изменения массы тела мыши до и во время лечения кАРТ после заражения ВИЧ-1 в разных группах. Гуманизированные мыши были инфицированы ВИЧNFNSXSL9 после восстановления иммунитета. После 4 недель инфекции ВИЧ-1 мышей либо лечили в течение еще 7,5 недель режимом FTC/TDF/RAL через подкожную (SC) инъекцию, либо пероральным введением FTC/TDF/RAL или FTC/TDF/ELV. Массу тела мышей измеряли, начиная с 1 недели до ВИЧ-инфекции. Все статистические сравнения проводились с использованием теста Манна-Уитни, представляющего собой среднее значение группы (± S.E.). Зеленые звездочки показывают статистические различия между ftC / TDF / ELV пищевой пероральной группой и группой инъекций FTC / TDF / RAL SC. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. n=6-7 в каждой группе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Пероральное введение кАРТ с пищей показывает более быстрое подавление вируса. Как описано на рисунке 1, мышей либо не лечили, либо лечили режимом FTC/TDF/RAL через подкожную инъекцию и пероральное введение макета пищевой чашки, FTC/TDF/RAL или FTC/TDF/ELV в течение еще 7,5 недель. (A) Вирусная нагрузка плазмы с течением времени после заражения ВИЧ-1 в различных группах. (B) Сводка вирусной нагрузки с течением времени после инфицирования ВИЧ-1 в различных группах с указанием среднего геометрического значения группы с 95% доверительным интервалом (ДИ). Черные стрелки указывают время инициализации cART для групп, обработанных cART. (C) Анализ выживаемости времени после лечения кАРТ до неопределяемой вирусной нагрузки для каждой группы. n= 6-7 в каждой группе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Пероральные препараты для приготовления пищи в ВРТ показывают более быстрое восстановление соотношения CD4/CD8. Соотношение CD4/CD8 в периферической крови с течением времени после заражения ВИЧ-1 для каждой группы. Все статистические сравнения проводились с использованием теста Манна-Уитни, представляющего собой среднее групповое значение (± S.E.). Красные звездочки показывают статистические различия между группой ftC / TDF / RAL пищевой пероральной группы и группой инъекций FTC / TDF / RAL SC. *P < 0,05. n=6-7 в каждой группе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

SK является основателем CDR3 Inc. Остальные авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.