Методическая статья

Исследование смягчающего воздействия введения Bacillus cereus на колит посредством модуляции кишечной микробиоты

DOI:

10.3791/63707

⸱

27 июля 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Anhui University, 2Key Laboratory of Human Microenvironment and Precision Medicine of Anhui Higher Education Institutes, Anhui University, 3Anhui Key Laboratory of Modern Biomanufacturing, 4Institute of Physical Science and Information Technology, Anhui University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной работе мы представляем протокол для создания модели индуцированного антибиотиками псевдобактериологического дикстрансульфата натрия, индуцированного натрием, для изучения роли микробиоты кишечника в регулировании положительного влияния Bacillus cereus на колит.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Считается, что дисбиоз кишечной микробиоты играет роль в прогрессировании колита. Тем не менее, точные стандарты введения пробиотиков для облегчения колита остаются неопределенными. Большинство методов анализа основаны на ограниченном разнообразии и изобилии кишечных микроорганизмов. Таким образом, обсервационные исследования не могут установить причинно-следственную связь. В этом исследовании мы использовали индуцированных антибиотиками псевдостерильных мышей для изучения роли микробиоты кишечника в регулировании пробиотических эффектов Bacillus cereus (B. cereus) на колит, индуцированный декстрансульфатом натрия (DSS) у мышей. Этот процесс позволяет оценить двунаправленное регулирующее действие добавок B. cereus на здоровье и обеспечивает стабильные и воспроизводимые результаты. Здесь представлены подробные протоколы культивирования B. cereus , операции в области зондирования, сбора кала и лечения клиренса антибиотиками у мышей с колитом. Методы оптимизации применимы и при других хронических воспалительно-ассоциированных заболеваниях. Результаты показали, что введение B. cereus снижает потерю массы тела, сокращение длины толстой кишки, индекс активности заболевания и гистопатологические показатели. Однако лечение антибиотиками подавляло положительное влияние B. cereus на колит. Эти результаты указывают на то, что микробиота кишечника необходима для смягчения воздействия B. cereus на колит. Таким образом, изучение благотворного влияния пробиотиков в этом исследовании является многообещающим подходом к разработке новых стратегий лечения для облегчения симптомов хронических воспалительных расстройств.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) — это распространенные хронические воспалительные заболевания желудочно-кишечного тракта, включая болезнь Крона и язвенный колит (ЯК)1. В настоящее время терапевтическими направлениями лечения воспалительного колита являются 5-аминосалицилаты, кортикостероиды, азатиоприн иантибиотики2. Более того, эти препараты имеют значительные побочные эффекты3. Поэтому следует уделять больше внимания влиянию пробиотиков на лечение колита.

Альтернативные терапевтические подходы включают введение пробиотиков, которые использовались на животных моделях и в клинических испытаниях. Предыдущие исследования показали, что различные пробиотики, такие как Bacillus cereus или Bifidobacterium infantis, могут облегчить колит 4,5. В доклинических исследованиях эффективность и безопасность пробиотиков должны быть изучены на животных моделях.

Мышиные модели колита с декстрансульфатом натрия (DSS) могут помочь изучить механизмы колита и оценить положительные эффекты пробиотиков. Стимулирование DSS приводит к эрозии слизистой оболочки кишечника, дисфункции кишечного барьера и увеличению проницаемости кишечного эпителия6. Большинство мышиных моделей пробиотиков в основном выделяют биологические эффекты. Тем не менее, механизм, лежащий в основе введения этого пробиотика, сложно изучить, учитывая ограничения в дальнейшей проверке причинно-следственной связи между пробиотиками и облегчением колита. Таким образом, существует необходимость в разработке стандартизированного метода исследования механизма действия пробиотиков.

Традиционно эти исследования требуют инокуляции определенных пробиотиков у стерильных мышей7. Тем не менее, существуют некоторые лабораторные ограничения в использовании стерильных мышей в качестве рецепторов для пробиотиков, такие как низкая иммунная способность и дорогостоящие стерильные средства8. Чтобы избежать этих ограничений, была создана альтернативная модель DSS-индуцированного колита с использованием псевдостерильных мышей. Псевдостерильная мышиная модель была создана путем применения антибиотиков, как описано ранее 9,10.

В этой статье мы вводим псевдостерильных мышей с помощью коктейля из антибиотиков. Мы также подробно описываем методологию создания и оценки моделей колита у мышей и исследуем влияние пробиотиков на облегчение симптомов колита. В приведенном ниже протоколе также представлены методы доставки пробиотиков через зонд.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры проводились в соответствии с Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию Аньхойского университета, Китай, и все процедуры были одобрены Комитетом по этике животных Аньхойского университета, Китай (No. IACUC(AHU)-2020-014).

1. Назначение антибиотиков

  1. Приготовьте коктейль из антибиотиков, растворив в 1 л питьевой воды ампициллин (1 г/л), неомицина сульфат (1 г/л), метронидазол (0,5 г/л) и ванкомицин (0,5 г/л)5.
  2. После полного растворения растворы хранить при температуре 4 °C.
  3. Налейте растворы для коктейлей антибиотиков в бутылку с водой. Поместите бутылку на клетку для мыши.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно используйте коричневые флаконы или оберните флаконы алюминиевой фольгой, чтобы защитить растворы антибиотиков от света.
  4. Заменяйте коктейль антибиотиков свежими растворами 2 раза в неделю.
  5. Дайте мышам свободно пить растворы коктейлей с антибиотиками в течение 4 недель.

2. Приготовление питьевой воды DSS и индукция колита

  1. Для приготовления 2,5% раствора сульфата декстрана натрия (ДСС) растворить 2,5 г ДСС в 100 мл дистиллированной воды11.
  2. Замените питьевую воду на 2,5% раствор DSS в группе мышей с моделью колита. Следите за тем, чтобы мыши в группе колита не имели доступа к другой питьевой воде. Тем временем обработайте контрольных мышей дистиллированной водой без DSS.
  3. Домашние самцы мышей C57BL/6J (средняя масса тела 20 г ± 2 г; возраст 7 недель) в условиях, свободных от патогенов, со свободным доступом к стандартному пище и воде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Содержать в общей сложности пять мышей в клетке в условиях, свободных от патогенов.
  4. Экспериментальный дизайн
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты на животных были разработаны в два этапа. В каждую группу было включено по пять мышей.
    1. Первый этап: Чтобы оценить положительное влияние B. cereus на облегчение колита, случайным образом распределите мышей по следующим трем группам: контрольная группа (контрольная группа), модель DSS-индуцированного колита (DSS), добавка пробиотика B. cereus для мышей, индуцированных DSS (B. cereus).
    2. Второй этап: Чтобы изучить роль микробиоты кишечника в регулировании пробиотических эффектов B. cereus на колит, вызванный DSS, случайным образом распределите мышей по следующим трем группам: ABX (контроль), ABX (DSS) и ABX (B. cereus + DSS).
      1. Обработайте мышей в группе ABX (контрольной) физиологическим раствором.
      2. После лечения растворами коктейлей антибиотиков в течение 4 недель мышам в группе ABX (DSS) давали получать воду, содержащую 2,5% DSS, в течение 1 недели и нормальный физиологический раствор в течение 2 недель.
      3. После лечения растворами коктейлей антибиотиков и водой DSS ежедневно обрабатывайте мышей группы ABX (B. cereus + DSS) B. cereus (2 x 108 клеток) в 200 мкл физиологического раствора с использованием внутрижелудочной канюли в течение 2 недель.
  5. После введения коктейля антибиотиков немедленно обработайте самцов мышей C57BL/6 2,5% раствором DSS в питьевой воде в течение 7 дней.
  6. Запишите массу тела мышей до вмешательства DSS в качестве исходного веса.

3. Количественное определение B. cereus

  1. Подготовьте восемь микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл, заполненных 900 мкл стерильного физиологического раствора.
  2. Пипеткой 100 мкл логарифмического роста B. cereus и растворить в 900 мкл стерильного физиологического раствора.
  3. Серийно разводите B. cereus с помощью трубочек.
  4. Пластина 40 мкл каждого разбавления на соответствующую агаровую пластину LB, помеченную коэффициентом разведения. Повторите 3 раза для каждой пропорции разведения.
  5. Культивировать планшеты в инкубаторе с постоянной температурой 37 °C в течение 16 часов.
  6. Выберите пластины с ~20-70 колониями для подсчета. Рассчитайте среднюю концентрацию бактерий в соответствии с кратным разбавлением выбранных планшетов.

4. Подготовка B. cereus к зондированию

  1. После количественного определения B. cereus соберите 1 мл среды B. cereus , содержащей 1 x 109 КОЕ, и центрифугируйте при 8000 x g в течение 10 минут. Затем промойте бактериальные клетки 2 раза стерильной водой центрифугированием при давлении 8000 x g в течение 10 минут и удалите надосадочную жидкость.
  2. Разбавьте концентрированный B. cereus стерильным физиологическим раствором до конечной концентрации 2 x 108 КОЕ/200 мкл4.
  3. Пипеткой многократно разбавляйте вверх и вниз, чтобы получить диспергированную суспензию B. cereus .
  4. Проведите количественное определение концентрации B. cereus методом подсчета в планшетах до завершения метода зондирования.

5. Применение добавок B. cereus через зонд

  1. Вводите вмешательства (2 x 10 пробиотиковпо 8 КОЕ в 200 мкл нормального физиологического раствора) мышам через пероральный зонд в фиксированное время.
  2. Для введения B. cereus подсоедините иглу для зонда (размер подающей иглы: 20 G, 38 мм) к шприцу объемом 1 мл. Протрите внешнюю сторону иглы для зонда 70% этанолом между мышами и поддерживайте правильную дозу.
  3. Чтобы удержать мышей, возьмите их за хвост и крепко возьмитесь за рыхлую кожу спины, зажав конец хвоста между двумя последними пальцами дрессировщика.
  4. Держите мышей в вертикальном положении. Затем осторожно и аккуратно введите иглу для зондирования через рот в пищевод. Если на этом этапе сопротивление не встречается, осторожно введите иглу в желудок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед введением препарата подтвердите регулярное и беспрепятственное дыхание мышей.
  5. Медленно продвигайте иглу вперед и введите раствор B. cereus . Осторожно извлеките иглу после завершения зондажа. Отпустите мышь и верните ее в клетку.

6. Определение индекса активности заболевания

Индекс активности заболевания (DAI) рассчитывался ежедневно на основе потери массы тела мышей, кала скрытой крови и консистенции стула.

  1. Ежедневно измеряйте массу тела мышей. Присвойте каждой мыши оценку от 0 до 4 в зависимости от процента потери массы тела (0: 0%, 1: 1%-5%, 2: 6%-10%, 3: 11%-18% и 4: >18%).
  2. Соберите свежие образцы стула у каждой мыши. Используйте ватный тампон для стимуляции сокращения анального отверстия, чтобы способствовать дефекации. Затем соберите образцы кала сразу после дефекации в стерилизованную центрифужную пробирку.
  3. Определите каловую скрытую кровь по анализу кала на скрытую кровь. Наберите 10 мг образца кала на палочку-аппликатор.
  4. Положите образец на тестовую карту и нанесите на карту тонкий мазок. Откройте задний клапан и нанесите проявитель на мазок.
  5. Затем оцените скрытую кровь с помощью теста кала на скрытую кровь в течение 120 секунд.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Любой след синего цвета на мазке или по краю мазка является положительным на скрытую кровь. Баллы за кал были следующими: 0: Отсутствует, 1: Гемокультный положительный, 2: Незначительный, 3: Следы крови в стуле и 4: Сильное кровотечение.
  6. Определение консистенции стула путем обнаружения образца кала11. Присвойте балл от 0 до 4 (0: нормальный, 1: жидкий стул, 2: полуобразовавшийся стул, 3: жидкий стул и 4: диарея).

7. Забор тканей

  1. Обезболивайте мышей путем введения 10% хлоралгидрата (10 мг/кг) в конце первого и второго этапов эксперимента. Оценивайте глубину анестезии у мышей по рефлексу отмены щипка.
  2. Затем усыпьте мышей путем вывиха шейки матки.
  3. Зафиксируйте мышей лежа на операционном столе, а брюшную полость вскройте.
  4. Отделите всю толстую кишку хирургическим путем и измерьте длину с помощью линейки.
  5. Затем аккуратно промойте толстую кишку шприцем объемом 5 мл, наполненным предварительно охлажденным PBS.

8. Оценка гистологического повреждения

  1. Разрежьте ткань толстой кишки на мелкие фрагменты, зафиксируйте их в 4% параформальдегиде и заделайте в парафин с помощью машины для встраивания тканей.
  2. Затем разрежьте залитые парафином ткани с помощью микротома, чтобы получить срезы ткани толстой кишки толщиной 4 мкм. Депарафинизируйте и обезвоживайте отделы толстой кишки. Затем окрашивайте срезы толстой кишки гематоксилином и эозином (H&E).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашенные образцы толстой кишки оцениваются исследователем с помощью системы по следующим показателям: степень инфильтрации воспалительных клеток (нет: 0, легкая: 1, умеренная: 2, тяжелая: 3), повреждение слизистой оболочки (нет: 0, слизистый слой: 1, подслизистая: 2, мышечная и сероза: 3), повреждение крипты (нет: 0, 1/3: 1, 2/3: 2, целиком: 3, весь + потеря эпителия: 4), диапазон поражений (%) (0%: 0, 1%-25%: 1, 26%-50%: 2, 51%-75%: 3, 76%-100%: 4). Общая оценка гистологических повреждений рассчитывается для каждой отдельной оценки по вышеуказанным показателям5.
  3. Пусть два независимых экспериментатора оценят (ослепят) гистологические показатели образца под световым микроскопом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Добавки с B. cereus и колит
Модель острого экспериментального колита была индуцирована вмешательством DSS в питьевую воду. На рисунке 1A показан протокол эксперимента по введению B. cereus мышиной модели с колитом. Побуждение DSS, очевидно, уменьшало массу тела (Рисунок 1B) и длину толстой кишки. Смягчающее действие B. cereus через зонд полости рта было исследовано на мышах с моделью колита. По сравнению с мышами, в...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для того чтобы использовать пробиотики в клинических исследованиях, необходимо оценить эффективность и безопасность пробиотиков на животных моделях. Предоставленные протоколы были предварительно оптимизированы для оценки тяжести колита. Мыши, получавшие DSS, являются моделью воспаления кишечника, которая имитирует клинические и гистологические особенности, характерные для язвенного колита12. Мыши, моделирующие острый колит, характеризуются потерей массы тела, диар...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Данное исследование было поддержано, по крайней мере частично, Национальным фондом естественных наук Китая (K.S., грант No 32000081), Фондом естественных наук провинции Аньхой (K.S., грант No 1908085QC120), Программой открытого проекта Государственной ключевой лаборатории пищевых наук и технологий Цзяннаньского университета (K.S., грант No.SKLF-KF-201920), Фондом естественных наук высших учебных заведений провинции Аньхой Китая (K.S., грант No. KJ2019A0040), Фонд докторских научных исследований Аньхойского университета (K.S., грант No J01003316), Национальный фонд естественных наук Китая (Y.W., грант NoNo 31770066, 31470218), Открытый фонд построения дисциплин, Институт физических наук и информационных технологий Аньхойского университета (Y.W.) и Программа выдающихся талантов Аньхойского университета, Китай (Y.W.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,01 М PBS (порошок, pH7,2– 7.4)СоларбиоП1010-2Л
Спирт этиловый абсолютныйХуши64-17-5
Раствор для дифференцировки кислотного спирта fsatБейотимNo C0163S
АгарСангон Биотех9002-18-0
АмпициллинСоларбио69-53-4Магазин в 2– 8 ° C
Анаэробный инкубаторЛун ЮэЛА1-3Т
Декстран сульфат натрия соли колит степениMP Biomedicals160110
Электротермический инкубаторСАНФАНР-050А
Фиксатор тканей общего назначенияБиошарпБЛ539А
ГлицеринХуши56-81-5
Набор для окрашивания гематоксилином и эозиномБейотимNo C0105
Монтажный средний вариант KisserБейотимNo C0181
МетронидазолСоларбио443-48-1Магазин в 2– 8 ° C
Сульфат неомиеинаСоларбио1405-10-3Магазин в 2– 8 ° C
Осциллирующий инкубаторШанхай ЧжичуZQLY-180S
Хлорид натрияСангон Биотех7647-14-5
Бумага для анализа кала на скрытую кровьБасоBA2020B
ТриптонОКСОИДНЫЙ2285856
ВанкомицинСоларбио1404-93-9Магазин в 2– 8 ° C
КсилолХуши1330-20-7
Дрожжевой экстрактСангон Биотех8013-01-2

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pittayanon, R., et al. Differences in gut microbiota in patients with vs without inflammatory bowel diseases: A systematic review. Gastroenterology. 158 (4), 960-946 (2020).
  2. Kuehn, F., Hodin, R. A. Impact of modern drug therapy on surgery: Ulcerative colitis. Visceral Medicine. 34 (6), 426-431 (2018).
  3. Harmand, P. -O., Solassol, J. Thiopurine drugs in the treatment of ulcerative colitis: Identification of a novel deleterious mutation in TPMT. Genes. 11 (10), 1212(2020).
  4. Sheng, K., et al. Synbiotic supplementation containing Bifidobacterium infantis and xylooligosaccharides alleviates dextran sulfate sodium-induced ulcerative colitis. Food & Function. 11 (5), 3964-3974 (2020).
  5. Sheng, K., et al. Probiotic Bacillus cereus alleviates dextran sulfate sodium-induced colitis in mice through improvement of the intestinal barrier function, anti-inflammation, and gut microbiota modulation. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (49), 14810-14823 (2021).
  6. Wei, L., et al. PRKAR2A deficiency protects mice from experimental colitis by increasing IFN-stimulated gene expression and modulating the intestinal microbiota. Mucosal Immunology. 14 (6), 1282-1294 (2021).
  7. Souza, E. L. S., et al. Beneficial effects resulting from oral administration of Escherichia coli Nissle 1917 on a chronic colitis model. Beneficial Microbes. 11 (8), 779-790 (2020).
  8. Trinder, M., Daisley, B. A., Dube, J. S., Reid, G. Drosophila melanogaster as a high-throughput model for host-microbiota interactions. Frontiers in Microbiology. 8, 751(2017).
  9. Liang, W., et al. Colonization potential to reconstitute a microbe community in pseudo germ-free mice after fecal microbe transplant from equol producer. Frontiers in Microbiology. 11, 1221(2020).
  10. Hernandez-Chirlaque, C., et al. Germ-free and antibiotic-treated mice are highly susceptible to epithelial injury in DSS colitis. Journal of Crohns & Colitis. 10 (11), 1324-1335 (2016).
  11. Sheng, K., et al. Grape seed proanthocyanidin extract ameliorates dextran sulfate sodium-induced colitis through intestinal barrier improvement, oxidative stress reduction, and inflammatory cytokines and gut microbiota modulation. Food & Function. 11 (9), 7817-7829 (2020).
  12. Xu, X., et al. Histological and ultrastructural changes of the colon in dextran sodium sulfate-induced mouse colitis. Experimental and Therapeutic Medicine. 20 (3), 1987-1994 (2020).
  13. Zheng, L., et al. Jianpi Qingchang decoction alleviates ulcerative colitis by inhibiting nuclear factor-kappa B activation. World Journal of Gastroenterology. 23 (7), 1180-1188 (2017).
  14. Gao, X., et al. Symptoms of anxiety/depression is associated with more aggressive inflammatory bowel disease. Scientific Reports. 11, 1440(2021).
  15. Thippeswamy, B. S., et al. Protective effect of embelin against acetic acid induced ulcerative colitis in rats. European Journal of Pharmacology. 654 (1), 100-105 (2011).
  16. Sakai, S., et al. Astaxanthin, a xanthophyll carotenoid, prevents development of dextran sulphate sodium-induced murine colitis. Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition. 64 (1), 66-72 (2019).
  17. Li, S., et al. Role of gut microbiota in the anti-colitic effects of anthocyanin-containing potatoes. Molecular Nutrition & Food Research. 65 (24), 2100152(2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

DSS

Похожие статьи