Мелкомасштабная экстракция геномной ДНК Caenorhabditis elegans

Здесь представлены два связанных протокола для лизиса Caenorhabditis elegans, чтобы сделать ДНК доступной для приложений на основе ПЦР. ПЦР является широко используемым молекулярным методом, используемым для многих применений, включая генотипирование и амплиферацию фрагментов ДНК для клонирования и секвенирования, среди прочих. Маленький (1 мм), свободно живущий круглый червь C. elegans является популярной животной системой для биологических исследований. Получение подходящей геномной ДНК от одного животного или нескольких животных достаточно для амплиации последовательности с помощью ПЦР. Поздние личинки L4 и взрослые особи содержат только ~ 1000 соматических клеток (включая некоторые многоядерные, полиплоидные клетки), половые клетки и (если животное является гравидным гермафродитом) потомство в утробе матери¹. Однако эти животные защищены кутикулой, которая должна быть нарушена для извлечения геномной ДНК². Стандартные методы подготовки шаблона геномной ДНК нематоды для ПЦР включают в себя несколько шагов и занимают несколько часов. Животных сначала замораживают в буфере лизиса червей, содержащем протеиназу K (−70 °C или ниже) в течение не менее 15-45 мин (более длительный рекомендуется некоторыми протоколами)3,4,5,6. Этот шаг раскалывает животных.

После замораживания животных инкубируют в течение 1 ч при 60-65 °С для работы протеиназы К, затем фермент инактивируют в течение 15-30 мин при 95 °С. Протеиназа К разрушает нуклеазы, которые разрушают ДНК. Инактивация протеиназы К перед ПЦР важна для предотвращения деградации протеиназы К ДНК-полимеразы. Два описанных здесь протокола на основе наборов являются быстрыми, надежными и экономически эффективными методами извлечения геномной ДНК либо из одного животного, либо из нескольких нематод для повседневных исследований и обучения лабораторным приложениям. Используемый набор был первоначально оптимизирован производителем для извлечения ДНК из тканей животных, слюны и волос⁷. Он использует запатентованный раствор для подготовки тканей и экстракционный раствор для лизирования клеток и делает геномную ДНК доступной. Запатентованный нейтрализующий раствор затем нейтрализует компоненты, которые могут ингибировать ПЦР (например, соли, ионы и Mg²⁺-связывающие молекулы).

При генотипировании может быть протестировано одно животное. При определении того, является ли штамм гомозиготным, тестирование шести или более потомков от одного животного дает высокую уверенность в том, что линия гомозиготна или нет (существует 0,02% вероятность случайного выбора шести гомозиготных мутантных потомков от гетерозиготного родителя [(1/4)⁶ × 100% = 0,02%]). Этот метод 1) является простым, с меньшим количеством шагов, чем метод протеиназы К, и 2) сокращает время приготовления шаблона до 15 минут. Результаты этой работы демонстрируют, что разработанный протокол надежно работает при извлечении геномной ДНК из одного или нескольких червей, которые могут быть надежно использованы для последующих применений, не требующих высокоочищенной ДНК, включая ПЦР.

1. Обслуживание C. elegans

ПРИМЕЧАНИЕ: Штаммы N2 (дикий тип) и blmp-1(tm548) C. elegans поддерживались на стандартных пластинах среды роста нематод (NGM) при 20 °C.

1. Приготовьте пластины NGM, растворив 23,005 г порошка NGM в 973 мл воды в колбе 2 л. Накройте отверстие колбы алюминиевой фольгой (или автоклавируемым колпачком, позволяющим вентиляцию) и закрепите покрытие автоклавной лентой. Автоклав для растворения порошка и стерилизации содержимого с циклом стерилизации не менее 30 мин.
2. Охладите среду до 60 °C на водяной бане.
3. К охлаждаемой среде добавляют 25 мл стерильного буфера 1 Мфосфата (_KH2PO₄), рН 6,0; 1 мл 1 М раствора кальция хлорида; и 1 мл 1 М раствора сульфата магния.
4. Перемешайте среду на магнитной перемешиваемой пластине для получения однородной смеси и предотвращения неравномерного охлаждения и затвердевания (~5 мин). Убедитесь, что перемешивающий стержень вращается достаточно быстро, чтобы создать вихрь, но не так быстро, чтобы пузырьки вводились (~ 250-300 оборотов в минуту).
5. Налейте ~ 25 мл среды в каждую 10 см пластину Петри (всего ~ 40 пластин). Высушите пластины при комнатной температуре в течение ночи (обычно 16-25 °C).
6. Вырастите колонию Escherichia coli OP50 в 30-50 мл бульона LB в течение ночи при 37 °C.
7. Посейте каждую пластину 500 мкл культуры E. coli OP50 и дайте им высохнуть при комнатной температуре перед использованием (обычно 16-25 °C)⁸. Хранить пластины при температуре 4 °C до 3 недель.
8. Перенесите C. elegans на семенные пластины с помощью проволочного кирки или другого метода и дайте им вырасти до L4 или взрослой стадии при температуре, необходимой для штамма (обычно 16-25 ° C, 1-2 дня, если животные были покрыты голодом как дауэры, 3-4 дня, если животные были покрыты как эмбрионы)⁸.

2. Извлечение ДНК одного червя

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод полезен для извлечения ДНК из одного червя (одного червя на 1,8 мкл общего объема). Мастер-микс может быть сделан, если несколько червей будут лизироваться одновременно.

1. Запрограммируйте термоциклер на один цикл при 55 °C в течение 10 мин с последующим 95 °C в течение 3 мин (программа лизиса).
2. Аликвота 0,8 мкл экстракционного раствора из комплекта на внутреннюю стенку 0,2 мл ПЦР-трубки на льду. Добавьте 0,2 мкл раствора тканевого препарата из набора в каплю экстракционного раствора. Перемешать путем пипетки.
3. Идентификация L4 или взрослого животного под рассекающим микроскопом⁹. Чтобы идентифицировать гермафродиты L4, ищите характерную вульву, которая видна как бледный полукруг в середине животного. Идентифицируйте взрослых гермафродитов, ища самых крупных животных на пластине, которые могут иметь овальные эмбрионы, видимые в их матке.
4. С помощью платиновой проволоки переведите выбранное животное в раствор¹⁰.
5. Центрифугируйте трубку ненадолго (2-3 с, ≤6000 об/мин/2000 × г) при комнатной температуре для сбора содержимого на дне трубки.
6. Поместите трубку в термоциклер и запустите программу лизиса, установленную на шаге 2.1.
7. Когда программа будет завершена, ненадолго центрифугируйте трубку и поместите ее на лед. Добавить в смесь 0,8 мкл нейтрализующего раствора из набора. Перемешать путем пипетки.
8. Ненадолго центрифугируйте трубку при комнатной температуре (2-3 с, ≤6000 об/мин/2 000 × г).
9. Непосредственно используйте лизат для ПЦР или храните его при 4 °C или −20 °C для будущего использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Экстрагированная ДНК стабильна при 4 °C или −20 °C в течение не менее 6 месяцев⁷.

3. Извлечение ДНК нескольких особей

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод полезен для извлечения ДНК из нескольких червей. Мастер-микс может быть приготовлен, если несколько штаммов будут лизироваться одновременно.

1. Запрограммируйте термоциклер на один цикл при 55 °C в течение 10 мин с последующим 95 °C в течение 3 мин (программа лизиса).
2. Aliquot 2,0 мкл экстракционного раствора из комплекта на внутреннюю стенку ПЦР-трубки 0,2 мл на льду. Добавьте 0,5 мкл раствора тканевого препарата из набора в каплю экстракционного раствора. Перемешать путем пипетки.
3. Идентифицируйте L4 или взрослых животных под рассекающим микроскопом⁹. Гермафродиты L4 имеют характерную вульву, которая видна как бледный полукруг в середине животного. Взрослые гермафродиты являются самыми крупными животными на пластине и могут иметь овальные эмбрионы, видимые в их матке.
4. Используя платиновый проволочный отбор, переведите несколько животных в раствор: 9 животных дают 1 животный эквивалент геномной ДНК на 0,5 мкл лизата, а 16 животных дают ~ 1 животный эквивалент геномной ДНК в 0,25 мкл (3,5 нематода/ мкл)¹⁰.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Трудно перенести в этот объем более 16 животных.
5. Ненадолго центрифугируйте трубку при комнатной температуре (2-3 с, ≤6000 об/мин/2 000 × г).
6. Поместите трубку в термоциклер и запустите программу лизиса, установленную на шаге 3.1.
7. Когда программа будет завершена, ненадолго центрифугируйте трубку и поместите ее на лед. Добавить в смесь 2 мкл нейтрализующего раствора из набора. Перемешать путем пипетки.
8. Ненадолго центрифугируйте трубку при комнатной температуре (2-3 с, ≤6000 об/мин/2 000 × г).
9. Непосредственно используйте лизис для ПЦР или храните его при 4 °C или −20 °C для будущего использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Экстрагированная ДНК стабильна при 4 °C или −20 °C в течение не менее 6 месяцев⁷.

4. Реакция ПЦР

ПРИМЕЧАНИЕ: Описано одно последующее применение этого метода лизиса червей, обнаруживающее мутацию делеции с использованием быстрой полимеразы. Также продемонстрирована эффективность двух протоколов лизиса червей в получении геномной шаблонной ДНК для успешной ПЦР при разведении до 1/^50-й доли червя за реакцию.

1. Извлеките ДНК из одного червя и 16 червей, используя дикий тип N2 и мутантные штаммы, как описано выше в Шагах 2 и 3.
2. Приготовьте 2-, 10-, 20- и 50-кратное разведение ДНК одного червя у диких животных N2 типа.
3. Настраивайте реакции ПЦР в соответствии с протоколом производителя с использованием праймеров, специфичных для интересующей последовательности, и мастер-микса ПЦР с горячим запуском (Таблица 1 и Таблица 2). Используйте 1 мкл неразбавленной ДНК или 2 мкл разбавленной ДНК в качестве шаблона в каждой реакции.
4. Подтвердите продукты ПЦР с помощью гелевого электрофореза и визуализации¹¹.

Геномная ДНК из одного или нескольких взрослых особей дикого типа была извлечена с использованием коммерческого набора или традиционного протокола лизиса для сравнения эффективности этих двух методов. Эти лизаты затем использовались в качестве шаблонов для ПЦР для усиления либо большей цели ~2 100 bp (кодирование blmp-1), либо меньшей цели ~500 bp (кодирование части sma-10). Оба метода успешно дали соответствующие продукты ПЦР (рисунок 1А).

Далее была продемонстрирована способность геномной ДНК, экстрагированной набором, служить шаблоном для различных ДНК-полимераз. Извлеченная геномная ДНК использовалась в качестве шаблона для амплификации продукта размером 0,5 кб с использованием четырех полимераз, которые обладают различными возможностями (включая скорость, точность и размер продукта). Продукты ожидаемых размеров были получены этими полимеразами с использованием шаблона из лизиса одного взрослого человека или лизиса с девятью взрослыми (рисунок 1B). Шаблонная последовательность и точность полимераз ПЦР для правильной амплификации шаблонной последовательности могут быть подтверждены секвенированием (дополнительный рисунок S1). Этот результат демонстрирует, что геномная ДНК, извлеченная из протоколов набора, обеспечивает подходящий шаблон для ряда полимераз.

Эффективность ПЦР была проверена с использованием различных концентраций геномной ДНК, извлеченной из одного животного с использованием коммерческого набора. ДНК разбавляли в 2, 10, 20 или 50 раз, и эквивалент примерно половины, одной десятой, двадцатой и одной пятидесятой червя за реакцию использовали для ПЦР. Эти концентрации шаблона ДНК поддерживали амплификацию либо большей цели ~2,1 кб, либо меньшей цели ~0,5 кб (рисунок 1C)12. В то время как наблюдался зависящий от концентрации ДНК выход продукта ПЦР 0,5 кб, выход продукта ПЦР 2,1 кб казался эквивалентным во всех реакциях.

Чтобы продемонстрировать, что эти протоколы производят геномную ДНК из C. elegans, подходящую для генотипирования ПЦР, геномная ДНК была извлечена из одного и 16 мутантов дикого типа и blmp-1 с потерей функции (blmp-1 (tm548)). Ген blmp-1 кодирует фактор транскрипции с важной ролью в миграции дистальных клеток кончика, размере тела и развитии 12,13,14,15,16. Мутант blmp-1 имеет делецию 810 bp, которая удаляет части экзона 3 и интрона 315. Были разработаны праймеры, которые приводят к продукту 2,134 bp при использовании шаблона ДНК дикого типа и продукту 1,324 bp, если используется ДНК blmp-1(-). Продукты ПЦР соответствующих размеров были обнаружены с использованием 1 мкл либо одного червя (около 0,5 червей на реакцию), либо лизиса 16 червей у животных, стадированных L4 (3,5 червя на реакцию) (рисунок 1D). Этот результат показывает, что извлеченная набором геномная ДНК с использованием любого протокола обеспечивает одинаково эффективные шаблоны для ПЦР и линий генотипа.

Эти результаты показывают, что препараты геномной ДНК C. elegans с использованием коммерческого набора для экстракции тканевой ДНК от одного и нескольких животных могут быть надежно использованы в качестве шаблонов для ПЦР.

Рисунок 1: Препараты ДНК с использованием коммерческого набора из одиночных нематод и нескольких нематод обеспечивают надежную амплификацию с помощью ПЦР. Продукты ПЦР нагружали 1% агарозным гелем в 1x TAE буфер (5 мкл (A,B) или 10 мкл (C,D) и запускали при 90-100 В в течение 30 мин до 2 ч. Для всех гелей использовалась 2-логарифмическая ЛЕСТНИЦА ДНК. (A) Сравнение лизиса ДНК по набору с традиционными методами протеиназы K для создания шаблона с использованием двух наборов праймеров. Взрослые особи дикого типа были лизированы, и эквивалент одного животного использовался в качестве шаблона для всех реакций. Дорожки 1-4, 2.1 kb изделие. Полоса 1, ПЦР из лизиса одного червя протеиназой К. Лейн 2, ПЦР из лизиса одного червя методом набора. Полоса 3, ПЦР из лизиса червей девяти червей протеиназой К. Лейн 4, ПЦР из лизиса червей девяти червей методом набора. Дорожки 5-8, 0.5 kb изделие. Полоса 5, ПЦР из лизиса одного червя протеиназой К. Лейн 6, ПЦР из лизиса одного червя методом набора. Полоса 7, ПЦР из лизиса червей девяти червей протеиназой K. Lane 8, ПЦР из лизиса червей девяти червей методом набора. (B) Метод набора для лизиса ДНК обеспечивает подходящий шаблон для ПЦР несколькими полимеразами. Взрослых особей дикого типа лизировали с использованием метода набора, а эквивалент половины животного использовался в качестве шаблона ПЦР для продукта размером 0,5 кб. Смотрите Таблицу материалов для деталей полимеразы. Полоса 1, ПЦР из лизиса одного червя с высокоскоростной полимеразой. Полоса 2, ПЦР из лизиса девяти червей с высокоскоростной полимеразой. Полоса 3, ПЦР из лизиса одного червя с taq-полимеразой . Полоса 4, ПЦР из лизиса девяти червей с taq-полимеразой . Полоса 5, ПЦР из лизиса одного червя с высокоточной полимеразой. Полоса 6, ПЦР из лизиса девяти червей с высокоточной полимеразой. Полоса 7, ПЦР из лизиса одного червя с высокоскоростной, высокоточной полимеразой. Полоса 8, ПЦР из лизиса девяти червей с высокоскоростной высокоточной полимеразой. (C) Разбавления одного лизиса червей L4 дикого типа служат образцом для ПЦР. Дорожки 1-5, 2.1 kb изделие. Полосы 6-10, 0,5 кб мишень. Полоса 1 и полоса 6, неразбавленная ДНК. Полоса 2 и полоса 7, 2-кратная разбавленная ДНК. Полоса 3 и полоса 8, 10-кратная разбавленная ДНК. Полоса 4 и полоса 9, 20-кратная разбавленная ДНК. Полоса 5 и полоса 10, 50-кратная разбавленная ДНК. (D) Генотипирование локуса blmp-1 методом ПЦР с использованием 1 мкл препаратов ДНК одного и 16 червей в качестве шаблона. Полоса 1, ПЦР из лизиса одного червя дикого типа. Полоса 2, ПЦР из лизиса одного червя blmp-1(-). Полоса 3, ПЦР из лизиса диких 16 червей. Полоса 4, ПЦР из blmp-1(-) 16-червячного лизиса. Сокращения: prep = способ приготовления; kb = килобаза; st. = стадия нематоды; dil. = разбавление ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Перечень грунтовок.

Таблица 2: Компоненты реакции ПЦР.

Дополнительный рисунок S1: Секвенирование для подтверждения качества геномной ДНК, полученной с помощью коммерческого набора. Результаты двух реакций секвенирования полностью соответствуют ожидаемой последовательности из более чем 1 600 нуклеотидов ДНК, амплифицированной высокоскоростной высокоточной полимеразой (Pol E) из лизиса 16 червей (Таблица 1, Таблица 2A и Таблица 2D). Концы чтения секвенирования были обрезаны, чтобы удалить некачественные базовые чтения. Выравнивание выполнялось с помощью инструмента выравнивания нескольких последовательностей EMBL-EBI MUSCLE (MUltiple Sequence Comparison by Log-Expectation)17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.