Методическая статья

Ex Vivo Высвобождение пептида, связанного с геном кальцитонина, из тригеминосаскулярной системы у грызунов

5.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63723

⸱

16 мая 2022 г.

 ,  ,  , 
1Danish Headache Center, Department of Neurology, Rigshospitalet, University of Copenhagen, 2EHESP, Irset (Institut de Recherche en Santé, Environnement et Travail), Univ Rennes, Inserm, 3Department of Biology, Section of Cell Biology and Physiology, University of Copenhagen

В этой статье

Краткое содержание

Настоящий протокол описывает модель высвобождения ex vivo кальцитонина, связанного с геном пептида (CGRP), и стратегию количественной оценки влияния фармакологических агентов на количество CGRP, высвобождаемого из тригеминозускулярной системы у грызунов.

Аннотация

Пептид, связанный с геном кальцитонина (CGRP), был впервые обнаружен в 1980-х годах как вариант сращивания из гена кальцитонина. С момента своего открытия его роль в патофизиологии мигрени была хорошо установлена, сначала по его мощным сосудорасширяющим свойствам, а затем по его присутствию и функции в качестве нейротрансмиттера в сенсорной тригеминозускулярной системе. Провоцирующая мигрень способность CGRP оказала поддержку фармацевтической промышленности в разработке моноклональных антител и антагонистов, ингибирующих действие CGRP. Новая парадигма лечения доказала свою эффективность в профилактическом лечении мигрени. Одним из полезных инструментов для дальнейшего понимания механизмов мигрени является модель ex vivo высвобождения CGRP из тройничной системы. Это относительно простой метод, который можно использовать с различными фармакологическими инструментами для достижения ноу-хау для дальнейшей разработки новых эффективных методов лечения мигрени. Настоящий протокол описывает модель высвобождения CGRP и методику количественной оценки влияния фармакологических агентов на количество CGRP, высвобождаемого из тригеминосудистой системы у грызунов. Предусмотрена процедура, описывающая экспериментальный подход от эвтаназии к измерению уровня белка. Подробно описано существенное выделение тройничного ганглия и тройничного ядра каудалиса как от мышей, так и от крыс и приготовление твердой мозговой оболочки крыс. Кроме того, представлены репрезентативные результаты обоих видов (крыс и мышей). Метод является ключевым инструментом для исследования молекулярных механизмов, участвующих в патофизиологии мигрени, с использованием различных фармакологических соединений и генетически модифицированных животных.

Введение

Мигрень является неврологическим расстройством, которое, по оценкам ВОЗ, затрагивает более 1 миллиарда человек и является одной из ведущих причин инвалидности во всем мире1. Таким образом, мигрень оказывает значительное влияние как на пациентов, так и на общество. Несмотря на недавний клинический успех антагонизирующих препаратов CGRP, большая часть пациентов нуждается в улучшенных вариантах лечения 2,3,4,5. Требуется выяснение патофизиологии мигрени, приводящее к новым эффективным методам лечения. Передача сигналов в тригеминоскулярной системе, состоящей из мозговых оболочек, тройничных ганглиев (ТГ) и тройничного ядра каудалиса (ТНК), является центральной для патофизиологии мигрени 6,7.

37 аминокислотный нейропептид кальцитонин, связанный с геном пептида (CGRP), был впервые обнаружен в начале 1980-х годов, когда Амара и его коллеги продемонстрировали, что первичный РНК-транскрипт гена кальцитонина может быть обработан для получения мРНК, кодирующей CGRP, в дополнение к кальцитонину 8,9. Последующие исследования предположили связь с патофизиологией мигрени10. CGRP является нейротрансмиттером с мощными сосудорасширяющими свойствами 11,12,13,14,15,16,1 7, и он широко распространен в центральной и периферической нервной системе 13,14,18,19,20,21,22 . Участие CGRP в мигрени было подчеркнуто с открытием повышенных уровней CGRP во внемозговом кровообращении во время приступов мигрени у людей23, и что инфузия CGRP вызывает мигренеподобную боль у пациентов24. Два года спустя было опубликовано первое доказательство концепции эффективности антагониста CGRP olcegepant при лечении мигрени25.

CGRP в изобилии присутствует в тригеминоваскулярной системе, как показано в TG21,26, сенсорных нервных волокнах, иннервирующих твердую мозговую оболочку 27,28,29 и TNC30. В тригеминосудистой системе CGRP обнаруживается в нейронах малого и среднего размера TG, в немиелинизированных С-волокнах и экспрессируется почти в 50% нейронной популяции TG. Рецептор CGRP экспрессируется в основном в более крупных нейронах и обнаруживается в миелинизированных Aδ-волокнах31,32. CGRP высвобождается из нейронов при химической или электрической стимуляции33,34. Исследования путей, ведущих к высвобождению CGRP, и местоположения этой активации имеют решающее значение для понимания патофизиологии мигрени. В течение последних 5 десятилетий доклинические исследования способствовали получению обширных знаний о передаче сигналов, связанных с мигренью, и способствовали разработке новых методов лечения35. Многие методы, учитывающие сосудистое и нейрогенное вовлечение, были модифицированы и применены в исследованиях мигрени. Можно упомянуть модели in vivo и in vitro артериальных реакций на биологические соединения или фармакологические методы лечения 17,36,37 и электрическую стимуляцию нервов 38,39. Кроме того, активированные нейроны в ТНК могут быть обнаружены по экспрессии c-Fos 40,41,42 и электрофизиологическим записям в этой области 43,44. Оба метода измеряют ноцицептивные сигналы, передаваемые в мозг от головы, например, dura mater. Использование только одной доклинической модели не дает полной картины мигрени патофизиологии. Поэтому важно комбинировать различные модели, охватывающие как можно больше аспектов патофизиологии мигрени. Продолжающаяся разработка новых моделей охватит различные аспекты механизмов мигрени, и со временем тайна патофизиологии мигрени будет раскрыта.

Здесь представлен подробный протокол метода высвобождения CGRP, выполняемого ex vivo в изолированных ТГ и ТНК у мышей после химической стимуляции. Высвобождение CGRP также может быть изучено в твердой мозговой оболочке у крыс. Таким образом, в экспериментальном протоколе для крыс твердой мозговой оболочки описан вместе с ТГ и ТНК. Основа для метода высвобождения CGRP была впервые описана в 1999 году, когда Эберсбергер и его коллеги провели новаторские исследования и обнаружили, что CGRP высвобождается из твердой мозговой оболочки после химической и электрической стимуляции дуральных афферентов у крыс45. Позднее этот подход был распространен на выпуск CGRP из TG46 и TNC47. Впоследствии метод модифицировали для применения к ТГ и ТНК у мышей. До сих пор высвобождение CGRP из твердой мозговой оболочки было сложной задачей у мышей.

Протокол

Все процедуры по уходу за животными и экспериментальные процедуры были выполнены в соответствии с руководством Европейского сообщества по уходу и использованию животных (2010/63/UE). Для демонстрации этого протокола использовались самцы мышей C57BL/6JBomTac в возрасте 10 недель и самцы крыс Sprague Dawley в возрасте 10 недель.

1. Приготовление синтетической интерстициальной жидкости

  1. Готовят синтетическую интерстициальную жидкость (SIF) по следующему рецепту: 108 мМ NaCl, 3,48 мМ KCl, 3,50 мМ MgSO4, 26 мМ NaHCO3, 11,70 мМ2PO4, 1,50 мМ CaCl2, 9,60 мМ Na-глюконата, 5,50 мМ глюкозы и 7,60 мМ сахарозы (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: SIF может варьироваться в зависимости от цели стимуляции, например, раствор без кальция может быть использован при изучении кальциевых каналов.
  2. Отрегулируйте pH до 7,4 и стабилизируйте pH путем газообразования карбогена (5% CO2 и 95% O2)46.

2. Эвтаназия

  1. Обезболивают взрослых мышей и крыс смесью 70% CO2 и 30% O2. Обезглавливайте мышей с помощью ножниц и крыс с помощью гильотины (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте штамм и возраст, который соответствует цели исследования. В этой модели могут использоваться как самцы, так и самки.
  2. Отделите голову от тела на уровне С3-С4 спинного мозга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эвтаназия может также проводиться с внутрибрюшинной инъекцией пентобарбитала (100-150 мг/кг).

3. Рассечение

  1. Подготовьте ткань крысы, выполнив следующие действия.
    1. Удалите кожу и мышцы вокруг головы и шеи ножницами (рисунок 1A).
    2. Используйте костный триммер и ножницы, чтобы отделить нижние челюсти от головы (рисунок 1B-C).
    3. Откройте спинной мозг, вставив костный триммер каудально в дорсальную часть позвонков и удалите дорсальную часть позвонков, чтобы обнажить спинной мозг и ствол головного мозга (рисунок 1D).
    4. Разрезайте каудальную часть черепа по границам затылочной и межтеменной костей, чтобы удалить эти костные структуры, обнажающие мозжечок (рисунок 1Е).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно не повреждать ствол головного и спинного мозга при разрезании и удалении позвонков.
    5. Изолируйте TNC (Sp5C), идущий каудально примерно на 13-16 мм от брегмы с каждой стороны, разрезав спинно-солнечную часть ствола мозга пружинными ножницами. Погрузите левую и правую стороны ТНК в SIF (рисунок 1E-I).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Описание соответствует взрослым крысам.
    6. Вырежьте голову посередине, чтобы разделить череп надвое с помощью пилы (рисунок 1J-L).
    7. Осторожно удалите мозг, не касаясь твердой мозговой оболочки, прикрепленной к черепу, с помощью шпателя и разрезая тройничный нерв, где он входит в ствол мозга (рисунок 1M-P).
    8. Чтобы изолировать ТГ, срежьте его, включая ветви вокруг визуальных границ. Срежьте нижнечелюстную ветвь там, где она входит в овальное отверстие. Вырежьте офтальмологическую и верхнечелюстную ветви, поступающие в череп, так как они не разделены макроскопически. При рассечении ТГ удалите твердое вещество, покрывающее ТГ (рисунок 1Q-T).
    9. Погрузите половинки черепа и ТГ в SIF.
  2. Подготовьте ткань мыши, выполнив следующие действия.
    1. Удалите кожу и мышцы вокруг головы и шеи с помощью небольших ножниц (рисунок 2A-B).
    2. Откройте спинной мозг, вставив пару небольших ножниц каудально в дорсальную часть позвонков и удалите дорсальную часть позвонков, чтобы обнажить спинной мозг и ствол мозга (рисунок 2C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно не повреждать спинной мозг при разрезании и удалении позвонков.
    3. Разрезайте череп по границам затылочной и межтеменной костей, чтобы удалить эти костные структуры, обнажающие мозжечок (рисунок 2D-F).
    4. Затем отрежьте теменную кость посередине и удалите кость, чтобы обнажить головной мозг (рисунок 2G-I).
    5. Осторожно удалите мозжечок шпателем, чтобы обнажить ствол мозга (рисунок 2J).
    6. Изолируйте ТНК-содержащую часть ствола мозга с помощью пружинных ножниц (рисунок 2K-N). Погрузите ствол мозга с TNC в SIF (рисунок 2O).
    7. Удалите мозг и перережьте тройничный нерв там, где он входит в ствол мозга (рисунок 2P-Q).
    8. Чтобы изолировать ТГ, срежьте его, включая ветви вокруг визуальных границ. Срежьте нижнечелюстную ветвь там, где она входит в овальное отверстие. Вырежьте офтальмологическую и верхнечелюстную ветви, поступающие в череп, так как они не разделены макроскопически. При рассечении ТГ удалите твердую мозговую оболочку, покрывающую ТГ (рисунок 2R-S).
    9. Погрузите ТГ в SIF (рисунок 2T).

4. Стирка

  1. Промывайте половинки черепа, ТНК и ТГ в SIF в течение 30 мин, заменяя SIF каждые 5 мин при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы промывки могут быть выполнены при хранении ткани в пластиковых контейнерах с тюлевой крышкой, чтобы обеспечить легкий обмен SIF (рисунок 3A-B).
  2. Подготовьте ткань крысы, выполнив следующие действия.
    1. Перенесите половинки ТНК в отдельные колпачки микроцентрифуг с 350 мкл SIF (рисунок 3C).
    2. Перенесите ТГ в колпачки микроцентрифуг - по одному ТГ на колпачок микроцентрифуги с 350 мкл SIF (рисунок 3C).
    3. Поместите половинки черепа на платформы из глины или 6-луночную культуральную пластину и заполните череп 400 мкл SIF (рисунок 3C).
  3. Подготовьте ткань мыши, выполнив следующие действия.
    1. Перенесите ствол мозга с TNC в колпачок микроцентрифуги с 250 мкл SIF (рисунок 3D).
    2. Перенесите две ТГ в колпачок микроцентрифуги с 250 мкл SIF (рисунок 3D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите две ТГ на крышку микроцентрифуги при использовании ткани мышей.
  4. Поместите черепа крыс и колпачки микроцентрифуг с тканью крысы и мыши в увлажненный инкубатор при 37 °C. Заменяйте SIF с помощью пипетки каждые 5 минут в течение 20 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно не прикасаться к ткани при добавлении и удалении SIF.

5. Тестирование на наркотики

  1. Определите базальные уровни высвобождения CGRP.
    1. После последней промывки добавьте 250 мкл SIF в ТГ и ТНК мыши. Добавьте 350 мкл к ТГ и ТНК крыс и 400 мкл к каждому черепу крысы.
    2. После 10 мин инкубации соберите 200 мкл образца в микроцентрифужной трубке и добавьте 50 мкл 10-кратного буфера EIA (поставляемого с набором иммуноферментного анализа CGRP, см. Таблицу материалов), чтобы можно было измерить базальное высвобождение CGRP (этап 6). Выбрасывайте оставшуюся жидкость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации должно быть одинаковым для всех образцов.
    3. Немедленно храните образцы при -20 °C.
    4. После отбора проб базальных уровней высвобождения CGRP следуйте одному из трех методов: (A) Однократная стимуляция (шаг 5.2); B) стимуляция концентрации-реакции (этап 5.3); и (C) Ингибирование стимуляции (этап 5.4) (рисунок 4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используемое исследуемое соединение и концентрации зависят от цели исследования.
  2. Выполните однократную стимуляцию, выполнив следующие действия.
    1. Добавьте исследуемое соединение или транспортное средство в ткань и оставьте его на 10 мин (объем: 250 мкл для мышей TG и TNC, 350 мкл для крыс tG и TNC и 400 мкл для каждого черепа крысы).
    2. После 10 мин инкубации соберите 200 мкл образца в микроцентрифужную трубку с 50 мкл 10-кратного буфера EIA. Выбрасывайте оставшуюся жидкость и немедленно храните образцы при -20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации должно быть одинаковым для всех образцов.
  3. Выполните стимуляцию концентрации-реакции, следуя приведенным ниже шагам.
    1. Разбавить испытываемое соединение или транспортное средство до желаемых концентраций. Добавляют испытуемое соединение в возрастающих концентрациях, начиная с самой низкой концентрации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используемое исследуемое соединение и концентрации зависят от цели исследования. Например, для настоящего исследования использовались 1 мкМ, 10 мкМ и 100 мкМ суперциннамальдегид.
    2. Добавьте самую низкую концентрацию (1 мкМ для настоящего исследования) исследуемого соединения и соответствующего носителя к двум идентичным тканевым препаратам и инкубируйте в течение 10 мин (объем: 250 мкл для ткани мыши, 350 мкл для крысиных ТГ и ТНК и 400 мкл для каждого черепа крысы).
    3. После 10 мин инкубации соберите 200 мкл образца в микроцентрифужную трубку с 50 мкл 10-кратного буфера EIA.
    4. Отбросьте оставшуюся жидкость и добавьте вторую самую низкую концентрацию (10 мкМ для настоящего исследования) в ткань.
    5. Немедленно храните образцы при -20 °C.
    6. Повторите эту процедуру с оставшимися концентрациями (100 мкМ для настоящего исследования).
  4. Выполните ингибирование стимуляции, следуя приведенным ниже шагам.
    1. Добавьте блокатор или носитель в ткань и инкубируйте в течение 10 мин (объем: 250 мкл для ткани мыши, 350 мкл для крысиных ТГ и ТНК и 400 мкл для каждого черепа крысы).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используемый блокатор и концентрация зависят от цели исследования. Например, 3 мкМ глибенкламида использовали для репрезентативного результата на рисунке 5.
    2. После 10 мин инкубации соберите образец объемом 200 мкл в микроцентрифужную трубку с 50 мкл 10-кратного буфера EIA. Выбрасывайте оставшуюся жидкость и немедленно храните образцы при -20 °C.
    3. Добавьте агонист или агонист + блокатор (см. Таблицу материалов) в ткань и инкубируйте в течение 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используемый агонист, блокатор и концентрации зависят от цели исследования. В настоящем исследовании использовали 3 мкМ глибенкламида и 1 мкМ капсаицина, рисунок 5.
    4. После 10 мин инкубации соберите образец объемом 200 мкл в микроцентрифужную трубку с 50 мкл 10-кратного буфера EIA. Выбрасывайте оставшуюся жидкость и немедленно храните образцы при -20 °C.
  5. Выполните положительный контроль для эксперимента.
    1. При необходимости добавьте положительный контроль (например, 1-10 мкМ капсаицина, см. Таблицу материалов) к ткани в конце протокола и соберите образец объемом 200 мкл в микроцентрифужной трубке с 50 мкл 10-кратного буфера ОВОС после инкубационного периода 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно включать положительный контроль, чтобы обеспечить установку и функционирование тканей. Капсаицин 48,49,50 или деполяризующий стимул калия (40-60 мМ KCl)46,47,49 обычно используются для того, чтобы вызвать высвобождение CGRP из тройничной системы. 40-60 мМ KCl SIF готовят как SIF, за исключением того, что NaCl обменивается на KCl на эквимолярной основе.

6. Анализ концентраций CGRP

  1. Измерьте количество высвобождаемого CGRP с помощью набора для иммуноферментного анализа (EIA) в соответствии с протоколом производителя (см. Таблицу материалов).
  2. Измерьте оптическую плотность при 410 нм с помощью пластинчатого фотометра. Если используется другой комплект CGRP EIA, измерьте оптическую плотность на длине волны, предусмотренной протоколом производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы должны быть разбавлены в соответствии со стандартной кривой.
  3. Выполняйте анализ данных.
    1. Представить данные либо в виде абсолютных концентраций, либо нормализовать до базального высвобождения CGRP из специфической ткани.

Результаты

Этот метод является инструментом для исследования молекулярных механизмов, связанных с CGRP, участвующих в мигрени. Он имеет преимущество оценки высвобождения CGRP с разных уровней тройничной системы и может применяться как на диких, так и на трансгенных мышах и крысах в сочетании с различными фармакологическими соединениями. Здесь представлены эксперименты по концентрации-реакции и блокированию у крыс и результаты концентрации-реакции у диких и трансгенных мышей.

Метод высвобождения CGRP был использован для изучения влияния ингибитора KATP канала глибенкламида на высвобождение CGRP из TG и твердой мозговой оболочки у самок спонтанных тройничных аллодинических (STA) крыс. Во-первых, оптимальная концентрация капсаицина была найдена с использованием дизайна исследования концентрации-ответа. Воздействие капсаицина индуцировало значительное высвобождение CGRP из твердой мозговой оболочки и ТГ по сравнению с транспортным средством (рисунок 5). В твердой мозговой оболочке максимальное высвобождение CGRP было обнаружено при 1 мкМ капсаицина, а в TG максимальное высвобождение CGRP было обнаружено при 10 мкМ капсаицина (рисунок 5A-B). Основываясь на экспериментах «концентрация-реакция», для экспериментов по блокированию использовали 1 мкМ капсаицина и 3 мкМ глибенкламида. Глибенкламид не показал влияния на базальное высвобождение CGRP из твердой мозговой оболочки (P = 0,441) и TG (P = 0,881) при анализе с односторонним ANOVA51. Глибенкламид достоверно снижал индуцированное капсаицином высвобождение CGRP в твердой мозговой оболочке на 40% (P = 0,031) и TG на 39% (P = 0,003) по сравнению с капсаицином с транспортным средством при анализе с односторонним ANOVA (рисунок 5C-D)51.

У мышей протокол использовался для изучения участия ионного канала транзиторного рецепторного потенциала анкирина 1 (TRPA1) в мышиной модели мигрени GTN, где гиперчувствительность, индуцированная GTN, полностью зависела от каналов TRPA1. Было обнаружено, что агонист TRPA1 суперкоринамальдегид (SCA) высвобождает CGRP дозозависимым образом из TG с 1 мкМ, 10 мкМ и 100 мкМ SCA, что приводит к увеличению высвобождения CGRP на 9% (P = 0,23), 51% (P = 0,011) и 69% (P = 0,0097) увеличения высвобождения CGRP по сравнению с транспортным средством, соответственно, при анализе с двусторонней ANOVA. Это высвобождение отсутствовало в ТГ у нулевых мышей Trpa1, где воздействие 1 мкМ, 10 мкМ и 100 мкМ SCA привело к 11% (P > 0,99), -13% (P > 0,99) и 9% (P = 0,97) процентного изменения высвобождения CGRP по сравнению с транспортным средством, соответственно при анализе с двусторонним ANOVA. Последующая стимуляция 10 мкМ капсаицина (положительный контроль) показывает, что все образцы тканей могут высвобождать CGRP (Рисунок 6)50.

figure-results-1
Рисунок 1: Пошаговое рассечение тканей крыс. Подробная информация (A-T) приведена в разделе протокола (шаг 3.1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Пошаговое рассечение тканей у мышей. Подробная информация (A-T) приведена в разделе протокола (шаг 3.2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Промывка и инкубация тканей грызунов. (А-Б) Свежеизолированная ткань в пластиковых контейнерах с SIF. Контейнеры покрыты тюлем, чтобы обеспечить легкую смену SIF. (C) Ткань крысы - Две половинки черепа с твердой мозговой оболочкой, покрывающей внутренние оболочки черепа, помещенные на 6-луночную культуральную пластину. Правое и левое тройничное ядро каудалиса в отдельных микроцентрифужных крышках трубки (верхний ряд крышек). Два тройничных ганглия в отдельных крышках микроцентрифуги (нижний ряд крышек). (D) Ткань мыши - тройничное ядро каудалиса, содержащее часть ствола мозга в отдельной крышке трубки микроцентрифуги (сверху). Два мышиных тройничных ганглия находятся в одной крышке трубки микроцентрифуги (снизу). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 4: Изучите проекты для выпуска CGRP. Три различных протокола для проведения экспериментов по выпуску CGRP. Препараты разводят в синтетической интерстициальной жидкости (SIF). (A) Однократная стимуляция. (B) Стимуляция концентрации-реакции. (C) Ингибирование стимуляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-5
Рисунок 5: Глибенкламид ингибирует индуцированное капсаицином высвобождение CGRP из твердой мозговой оболочки крыс и тройничного ганглия. Уровни CGRP от тройничных ганглиев и твердой мозговой оболочки, выделенных у самок спонтанных тройничных аллодинических (STA) крыс (215-318 г), первоначально полученных из Университета Томаса Джефферсона52, были измерены с помощью коммерческих наборов CGRP EIA человека. (А-Б) Высвобождение CGRP из (A) твердой мозговой оболочки и (B) тройничного ганглия после повышения концентрации капсаицина (10 нМ, 100 нМ, 1 мкМ и 10 мкМ) (n = 4). Данные представлены в виде отдельных точек и проанализированы с помощью двустороннего ANOVA. p < 0,0001 (C-D) Уровни CGRP высвобождаются из (C) твердой мозговой оболочки и (D) тройничного ганглия после 10-минутного воздействия на транспортное средство, 3 мкМ глибенкламида (glib), 1 мкМ капсаицина и 1 мкМ капсаицина + 3 мкМ гляба (n = 6-11). Данные представлены в виде отдельных точек и средних значений и были проанализированы с помощью одностороннего ANOVA. *по сравнению с автомобилем. #капсаицин по сравнению с капсаицином + блеск. #P < 0.05, ** и ##P < 0.01, ****P < 0.0001. За анализами последовал множественный сравнительный тест Бонферрони. Для всех тестов использовался значительный уровень α = 0,05. Эта цифра была изменена по сравнению с Christensen et al. 51. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-6
Рисунок 6: Воздействие SCA приводит к TRPA1-зависимому высвобождению CGRP из тройничного ганглия мыши. Уровни CGRP, высвобождаемые из тройничного ганглия, выделенного из WT и Trpa1 null (Trpa1tm1/Dpc)53 самцов мышей (8-10 недель), измеряли с помощью наборов CGRP EIA крыс после воздействия суперкоричного альдегида (SCA) при 1 мкМ, 10 мкМ и 100 мкМ и капсаицина при 10 мкМ в качестве положительного контроля (n = 6). Данные с каждой мыши представлены в виде отдельных точек, а столбики обозначают средние значения. Статистика: Сравнение между SCA и транспортным средством при каждой концентрации и между базальным и положительным контролем проводилось с помощью двустороннего повторения ANOVA. Значительный уровень α = 0,05. *P < 0,05, **P < 0,01. Эта цифра была изменена по сравнению с Christensen et al. 50. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Описанный метод был разработан после исследований, показывающих важность CGRP в патофизиологии мигрени. Он хорошо подходит для исследования механизмов, участвующих в высвобождении CGRP из тройничной системы, что имеет решающее значение для передачи сигналов боли в области головы. Количество CGRP, полученное в этой модели, непосредственно измеряет высвобождение CGRP из тройничных нервов, иннервирующих твердую мозговую оболочку, TG и TNC. Количество высвобождения CGRP количественно больше45,54, чем высвобождение, измеренное в плазме после термокоагуляции у человека, стимуляции тройничного нерва у кошек 39,55,56 и во время приступов мигрени 23. Одним из объяснений может быть то, что CGRP разбавляется и разлагается в крови54. Однако следует отметить, что прямая стимуляция химическими веществами может превосходить патофизиологическую активацию. Дополнительные преимущества заключаются в том, что можно обнаружить высвобождение из трех различных участков в тригеминосудистой системе и что его можно использовать вместе с фармакологическими манипуляциями и в тканях генетически модифицированных грызунов.

В последнее время многие доклинические модели грызунов фокусируются на системном введении веществ и последующих показаниях, связанных с болью или мигренью, с использованием тестирования фон Фрея 57,58, гримасничания 59,60,61 или легкого отвращения 62,63,64. Эти методы полезны для понимания болеутоляющих и обезболивающих свойств различных веществ. Однако эти подходы не дают никакой информации о конкретных тканях-мишенях. В настоящем способе тригеминоваскулярная система делится на три структуры: твердая мозговая оболочка, ТГ и ТНК. Это позволяет проводить локальное воздействие на каждую структуру и оценивать место действия конкретного вещества. Это было использовано в исследовании 2011 года, где была изучена роль кальциевых каналов с напряжением у крыс, и было обнаружено, что ингибирование этих каналов различно в трех структурах тригеминосаскулярного пути47. При рассечении структур нервной системы аксотомия неизбежна. Было показано, что аксотомия изменяет транскрипцию различных генов65. Эти транскрипционные изменения слишком медленны, чтобы повлиять на результаты этого метода, но изменения фосфорилирования не могут быть исключены по сравнению с ситуациями in vivo 46. Хотя нейропептиды, такие как CGRP, образуются в клеточной соме, высвобождение и действие нейропептидов обычно происходит на центральных или периферических нервных окончаниях. Таким образом, исследования интактных нейронов, включая терминалы, интересны при изучении высвобождения нейропептидов. Поэтому методы изучения культур нейронов из изолированных ганглиев были созданы для того, чтобы служить моделью терминалов. Однако культуры нейрональных клеток подвержены нескольким проблемам, поскольку механическая диссоциация может разрушать нейроны в культуре46. Более длительные временные рамки, связанные с культивированием клеток, делают этот метод чувствительным к транскриптомическим изменениям, обусловленным аксотомией и условиямикультивирования 65. Кроме того, добавление факторов роста и культивирование на поверхностных покрытиях изменили свойства нейронов в качестве трансмиттера и экспрессии рецепторов 66,67,68,69. Этих проблем можно избежать при изучении свежеизолированных интактных ганглиев вместо культур нейрональных клеток.

Одной из проблем с методом высвобождения ex vivo CGRP является точное рассечение ткани, необходимой для воспроизводимых результатов. Особенно точное вскрытие ТНК является сложной задачей, поскольку это структура внутри ствола мозга без видимых границ. Кроме того, твердая мозговая оболочка является хрупкой, и удаление мозга должно быть тщательно проведено, чтобы обеспечить неповрежденную структуру. Эти препятствия могут привести к изменению размера ткани и, таким образом, к изменению базальных и стимулирующих уровней CGRP. Однако это изменение может быть объяснено нормализацией базального высвобождения CGRP. Следует также отметить, что при выделении ТНК от мышей выделяется вся нижняя часть ствола мозга, а не более конкретная ТНК-содержащая часть, как это делается у крыс. В целом, использование ткани крысы может быть преимуществом, так как это позволяет измерять высвобождение CGRP из твердой мозговой оболочки и более точно рассечение ТНК. Кроме того, размер ткани также позволяет использовать крысу в качестве контроля транспортного средства, поскольку одна крыса приводит к двум половинкам черепа, двум ТГ и двум ТНК, где один кусок ткани используется для стимуляции вещества, а другой - для транспортного средства. При использовании мышей для одного эксперимента необходимы два животных, так как оба ТГ объединяются в один образец, а ТНК препарируются как один ствол мозга. Таким образом, два ТГ и один ствол мозга используются для стимуляции веществ, а два ТГ и один ствол мозга от другой мыши используются для управления транспортным средством. Это приводит к использованию в два раза большего количества мышей по сравнению с крысами для получения такого же количества реплик. Чтобы уменьшить количество используемых мышей, был предложен метод измерения высвобождения CGRP из срезов ствола мозга49. Преимуществом является то, что метод был модифицирован для обеспечения возможности использования мышей. Это позволяет использовать многие уже доступные трансгенные штаммы мышей, полезный инструмент для изучения, например, сигнальных путей. Положительный контроль в конце эксперимента должен быть включен, чтобы гарантировать, что ткань, используемая в эксперименте, может высвобождать CGRP. Положительным контролем может быть агонист TRPV1 капсаицин или деполяризующий стимул калия (KCl), которые, как было обнаружено, высвобождают CGRP из тригеминосудистой системы как у мышей, так и у крыс 46,47,48,49,50. Кроме того, метод также был адаптирован для измерения высвобождения других соответствующих пептидов в виде аденилатциклаз-активирующего пептида гипофиза (PACAP) - еще одного пептида, представляющего большой интерес в рамках исследования мигрени70.

Метод предоставляет полезный инструмент для исследования высвобождения CGRP из конкретных тканей-мишеней у крыс и мышей. Это относительно быстрый метод, который позволяет избежать проблем, связанных с культивированием нейронов. Протокол метода может быть легко модифицирован для изучения взаимосвязи концентрация-реакция или ингибирования ответа различными фармакологическими соединениями. Метод высвобождения ex vivo CGRP является одним из нескольких доклинических методов, полезных для изучения роли CGRP и других механизмов, связанных с высвобождением CGRP в патофизиологии мигрени.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа финансировалась Фондом Конфет.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
6-луночная культуральная пластинаNUNC140675
Кальция хлорида дигидратMerck1.02382.1000Для SIF
Буферные колпачки для пластиковых контейнеровThermoFisher Scientific536617
Капсаицин MerckM2028
CGRP наборыAH ДиагностикаA05482.96
CO2Strandmø llen4.6Для карбогенового газообразования SIF
Delicate Bone TrimmerFine Science Tools16109-14
ГлибенкламидTocris911
ГлюкозаMerckG7021Для буфера SIF
Гильотина для крысScandidactNS-802
Сульфат магния гептагидратMerckM5921Для буфера SIF
Микроцентробежные пробирки + крышки/колпачкиVWR700-5239
Мини-ножовкаBAHCO208
O2Strandmø llen4.5Для карбогенного газообразования SIF
ПентобарбиталГлоструп аптечнаяNAMagistral
Пластиковые контейнерыThermoFisher Scientific536455
Пластинчатый фотометр - Infinite M200TecanNA Infinite M200 снят с производства. A Infinite 200 PRO доступен по адресу Tecan.
Программное обеспечение: SW Magellan v.6.3
Хлорид калияMerckP9333Для буфера SIF
НожницыAllgaier Instruments307-156-170
Маленькие ножницыAllgaier Instruments04-520-115
Бикарбонат натрияMerckS6014Для буфера SIF
ХлориднатрияMerckS9888Для буфера SIF
Моногидрат дигидрофосфата натрияMerck1.06346.1000Для буфера SIF
Глюконат натрияMerckS2054Для буфера SIF
Шпатель BochemLab Supply3018
Пружинные ножницыFine Science Tools15024-10
СахарозаMerck84097Для SIF буфер
Суперкоричный альдегидMerckS3322
Тюль (ткани)NANAКуплен в местном магазине тканей
формула

Ссылки

  1. GBD 2016 Collaborators. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. The Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).
  2. Dodick, D. W. CGRP ligand and receptor monoclonal antibodies for migraine prevention: Evidence review and clinical implications. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 445-458 (2019).
  3. Sacco, S., et al. European headache federation guideline on the use of monoclonal antibodies acting on the calcitonin gene related peptide or its receptor for migraine prevention. The Journal of Headache and Pain. 20 (1), 6(2019).
  4. Moreno-Ajona, D., Pérez-Rodríguez, A., Goadsby, P. J. Gepants, calcitonin-gene-related peptide receptor antagonists: what could be their role in migraine treatment. Current Opinion in Neurology. 33 (3), 309-315 (2020).
  5. Khan, S., Olesen, A., Ashina, M. CGRP, a target for preventive therapy in migraine and cluster headache: Systematic review of clinical data. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 374-389 (2019).
  6. Edvinsson, L., Haanes, K. A., Warfvinge, K., Krause, D. N. CGRP as the target of new migraine therapies - successful translation from bench to clinic. Nature Reviews Neurology. 14 (6), 338(2018).
  7. Goadsby, P. J., et al. Pathophysiology of migraine: A disorder of sensory processing. Physiological Reviews. 97 (2), 553-622 (2017).
  8. Amara, S. G., Jonas, V., Rosenfeld, M. G., Ong, E. S., Evans, R. M. Alternative RNA processing in calcitonin gene expression generates mRNAs encoding different polypeptide products. Nature. 298 (5871), 240-244 (1982).
  9. Rosenfeld, M. G., et al. Production of a novel neuropeptide encoded by the calcitonin gene via tissue-specific RNA processing. Nature. 304 (5922), 129-135 (1983).
  10. Edvinsson, L., Goadsby, P. J. Discovery of CGRP in relation to migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 331-332 (2019).
  11. Brain, S. D., Williams, T. J., Tippins, J. R., Morris, H. R., MacIntyre, I. Calcitonin gene-related peptide is a potent vasodilator. Nature. 313 (5997), 54-56 (1985).
  12. Fisher, L. A., et al. Stimulation of noradrenergic sympathetic outflow by calcitonin gene-related peptide. Nature. 305 (5934), 534-536 (1983).
  13. Hanko, J., Hardebo, J. E., Kåhrström, J., Owman, C., Sundler, F. Calcitonin gene-related peptide is present in mammalian cerebrovascular nerve fibres and dilates pial and peripheral arteries. Neuroscience Letters. 57 (1), 91-95 (1985).
  14. Uddman, R., Edvinsson, L., Ekblad, E., Håkanson, R., Sundler, F. Calcitonin gene-related peptide (CGRP): perivascular distribution and vasodilatory effects. Regulatory Peptides. 15 (1), 1-23 (1986).
  15. Edvinsson, L. Functional role of perivascular peptides in the control of cerebral circulation. Trends in Neurosciences. 8, 126-131 (1985).
  16. Edvinsson, L., Ekman, R., Jansen, I., Ottosson, A., Uddman, R. Peptide-containing nerve fibers in human cerebral arteries: Immunocytochemistry, radioimmunoassay and in vitro pharmacology. Annals of Neurology. 21 (5), 431-437 (1987).
  17. Edvinsson, L., Fredholm, B. B., Hamel, E., Jansen, I., Verrecchia, C. Perivascular peptides relax cerebral arteries concomitant with stimulation of cyclic adenosine monophosphate accumulation or release of an endothelium-derived relaxing factor in the cat. Neuroscience Letters. 58 (2), 213-217 (1985).
  18. Brain, S. D., Grant, A. D. Vascular actions of calcitonin gene-related peptide and adrenomedullin. Physiological Reviews. 84 (3), 903-934 (2004).
  19. Skofitsch, G., Jacobowitz, D. M. Calcitonin gene-related peptide: Detailed immunohistochemical distribution in the central nervous system. Peptides. 6 (4), 721-745 (1985).
  20. Suzuki, N., Hardebo, J. E., Owman, C. Origins and pathways of cerebrovascular nerves storing substance P and calcitonin gene-related peptide in rat. Neuroscience. 31 (2), 427-438 (1989).
  21. Uddman, R., Edvinsson, L., Ekman, R., Kingman, T., McCulloch, J. Innervation of the feline cerebral vasculature by nerve fibers containing calcitonin gene-related peptide: trigeminal origin and co-existence with substance P. Neuroscience Letters. 62 (1), 131-136 (1985).
  22. Warfvinge, K., Edvinsson, L. Distribution of CGRP and CGRP receptor components in the rat brain. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 342-353 (2019).
  23. Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Vasoactive peptide release in the extracerebral circulation of humans during migraine headache. Annals of Neurology. 28 (2), 183-187 (1990).
  24. Lassen, L. H., et al. CGRP may play a causative role in migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 22 (1), 54-61 (2002).
  25. Olesen, J., et al. Calcitonin gene-related peptide receptor antagonist BIBN 4096 BS for the acute treatment of migraine. New England Journal of Medicine. 350 (11), 1104-1110 (2004).
  26. Eftekhari, S., et al. Localization of CGRP, CGRP receptor, PACAP and glutamate in trigeminal ganglion. Relation to the blood-brain barrier. Brain Research. 1600, 93-109 (2015).
  27. Keller, J. T., Marfurt, C. F. Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater. Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).
  28. Edvinsson, L., et al. Innervation of the human middle meningeal artery: immunohistochemistry, ultrastructure, and role of endothelium for vasomotility. Peptides. 19 (7), 1213-1225 (1998).
  29. Lennerz, J. K., et al. Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: Differences between peripheral and central CGRP receptor distribution. Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).
  30. Eftekhari, S., Edvinsson, L. Calcitonin gene-related peptide (CGRP) and its receptor components in human and rat spinal trigeminal nucleus and spinal cord at C1-level. BMC Neuroscience. 12, 112(2011).
  31. Eftekhari, S., et al. Differential distribution of calcitonin gene-related peptide and its receptor components in the human trigeminal ganglion. Neuroscience. 169 (2), 683-696 (2010).
  32. Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system. The Journal of Pain. 14 (11), 1289-1303 (2013).
  33. Spitzer, M. J. S., Reeh, P. W., Sauer, S. K. Mechanisms of potassium- and capsaicin-induced axonal calcitonin gene-related peptide release: Involvement of L- and T-type calcium channels and TRPV1 but not sodium channels. Neuroscience. 151 (3), 836-842 (2008).
  34. Evans, A. R., Nicol, G. D., Vasko, M. R. Differential regulation of evoked peptide release by voltage-sensitive calcium channels in rat sensory neurons. Brain Research. 712 (2), 265-273 (1996).
  35. Gupta, S., Villalón, C. M. The relevance of preclinical research models for the development of antimigraine drugs: Focus on 5-HT 1B/1D and CGRP receptors. Pharmocology & Therapeutics. 128 (1), 170-190 (2010).
  36. Williamson, D. J., Hargreaves, R. J., Hill, R. G., Shepheard, S. L. Intravital microscope studies on the effects of neurokinin agonists and calcitonin gene-related peptide on dural vessel diameter in the anaesthetized rat. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 17 (4), 518-524 (1997).
  37. Gupta, S., Bhatt, D. K., Boni, L. J., Olesen, J. Improvement of the closed cranial window model in rats by intracarotid infusion of signalling molecules implicated in migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 30 (1), 27-36 (2010).
  38. Knight, Y. E., Edvinsson, L., Goadsby, P. J. Blockade of calcitonin gene-related peptide release after superior sagittal sinus stimulation in cat: a comparison of avitriptan and CP122, 288. Neuropeptides. 33 (1), 41-46 (1999).
  39. Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Release of vasoactive peptides in the extracerebral circulation of humans and the cat during activation of the trigeminovascular system. Annals of Neurology. 23 (2), 193-196 (1988).
  40. Tassorelli, C., Joseph, S. A. Systemic nitroglycerin induces Fos immunoreactivity in brainstem and forebrain structures of the rat. Brain Research. 682 (1-2), 167-181 (1995).
  41. Ramachandran, R., et al. A naturalistic glyceryl trinitrate infusion migraine model in the rat. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 32 (1), 73-84 (2012).
  42. Hoskin, K. L., Zagami, A. S., Goadsby, P. J. Stimulation of the middle meningeal artery leads to Fos expression in the trigeminocervical nucleus: a comparative study of monkey and cat. Journal of Anatomy. 194, Pt 4 579-588 (1999).
  43. Charbit, A. R., Akerman, S., Goadsby, P. J. Comparison of the Effects of Central and Peripheral Dopamine Receptor Activation on Evoked Firing in the Trigeminocervical Complex. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 331 (2), 752-763 (2009).
  44. Koulchitsky, S., Fischer, M., Messlinger, K. Calcitonin gene-related peptide receptor inhibition reduces neuronal activity induced by prolonged increase in nitric oxide in the rat spinal trigeminal nucleus. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 29 (4), 408-417 (2009).
  45. Ebersberger, A., Averbeck, B., Messlinger, K., Reeh, P. W. Release of substance P, calcitonin gene-related peptide and prostaglandin E2 from rat dura mater encephali following electrical and chemical stimulation in vitro. Neuroscience. 89 (3), 901-907 (1999).
  46. Eberhardt, M., et al. Calcitonin gene-related peptide release from intact isolated dorsal root and trigeminal ganglia. Neuropeptides. 42 (3), 311-317 (2008).
  47. Amrutkar, D. V., Ploug, K. B., Olesen, J., Jansen-Olesen, I. Role for voltage gated calcium channels in calcitonin gene-related peptide release in the rat trigeminovascular system. Neuroscience. 172, 510-517 (2011).
  48. Gupta, S., et al. Evidence for CGRP re-uptake in rat dura mater encephali. British Journal of Pharmacology. 161 (8), 1885-1898 (2010).
  49. Kageneck, C., Nixdorf-Bergweiler, B. E., Messlinger, K., Fischer, M. J. M. Release of CGRP from mouse brainstem slices indicates central inhibitory effect of triptans and kynurenate. Journal of Headache and Pain. 15 (1), 1-9 (2014).
  50. Christensen, S. L., et al. CGRP-dependent signalling pathways involved in mouse models of GTN- cilostazol- and levcromakalim-induced migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 41 (14), 1413-1426 (2021).
  51. Christensen, S. L., et al. ATP sensitive potassium (KATP) channel inhibition: A promising new drug target for migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 40 (7), 650-664 (2020).
  52. Oshinsky, M. L., et al. Spontaneous trigeminal allodynia in rats: A model of primary headache. Headache. 52 (9), 1336(2012).
  53. Kwan, K. Y., et al. TRPA1 contributes to cold, mechanical, and chemical nociception but is not essential for hair-cell transduction. Neuron. 50 (2), 277-289 (2006).
  54. Eltorp, C., Jansen-Olesen, I., Hansen, A. J. Release of calcitonin gene-related peptide (CGRP) from guinea pig dura mater in vitro is inhibited by sumatriptan but unaffected by nitric oxide. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 20 (9), 838-844 (2000).
  55. Zagami, A. S., Goadsby, P. J., Edvinsson, L. Stimulation of the superior sagittal sinus in the cat causes release of vasoactive peptides. Neuropeptides. 16 (2), 69-75 (1990).
  56. Goadsby, P. J., Edvinsson, L. The trigeminovascular system and migraine: studies characterizing cerebrovascular and neuropeptide changes seen in humans and cats. Annals of Neurology. 33 (1), 48-56 (1993).
  57. Bates, E. A., et al. Sumatriptan alleviates nitroglycerin-induced mechanical and thermal allodynia in mice. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 30 (2), 170-178 (2010).
  58. Pradhan, A. A., et al. Characterization of a novel model of chronic migraine. Pain. 155 (2), 269-274 (2014).
  59. Mogil, J. S., Pang, D. S. J., Silva Dutra, G. G., Chambers, C. T. The development and use of facial grimace scales for pain measurement in animals. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 116, 480-493 (2020).
  60. Sotocinal, S. G., et al. The rat grimace scale: A partially automated method for quantifying pain in the laboratory rat via facial expressions. Molecular Pain. 7, 55(2011).
  61. Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nature Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
  62. Mahmoudi, J., et al. Cerebrolysin attenuates hyperalgesia, photophobia, and neuroinflammation in a nitroglycerin-induced migraine model in rats. Brain Research Bulletin. 140, 197-204 (2018).
  63. Farajdokht, F., Babri, S., Karimi, P., Mohaddes, G. Ghrelin attenuates hyperalgesia and light aversion-induced by nitroglycerin in male rats. Neuroscience Letters. 630, 30-37 (2016).
  64. Kuburas, A., et al. PACAP Induces Light Aversion in Mice by an Inheritable Mechanism Independent of CGRP. Journal of Neuroscience. 41 (21), 4697-4715 (2021).
  65. Buschmann, T., et al. Expression of Jun, Fos, and ATF-2 proteins in axotomized explanted and cultured adult rat dorsal root ganglia. Neuroscience. 84 (1), 163-176 (1998).
  66. Lee, Y. J., Zachrisson, O., Tonge, D. A., McNaughton, P. A. Upregulation of bradykinin B2 receptor expression by neurotrophic factors and nerve injury in mouse sensory neurons. Molecular and Cellular Neuroscience. 19 (2), 186-200 (2002).
  67. Hari, A., Djohar, B., Skutella, T., Montazeri, S. Neurotrophins and extracellular matrix molecules modulate sensory axon outgrowth. International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 113-117 (2004).
  68. Skoff, A. M., Resta, C., Swamydas, M., Adler, J. E. Nerve Growth Factor (NGF) and Glial Cell Line-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) regulate substance P release in adult spinal sensory neurons. Neurochemical Research. 28 (6), 847-854 (2003).
  69. Lindsay, R. M., Harmar, A. J. Nerve growth factor regulates expression of neuropeptide genes in adult sensory neurons. Nature. 337 (6205), 362-364 (1989).
  70. Edvinsson, J. C. A., et al. Differences in pituitary adenylate cyclase-activating peptide and calcitonin gene-related peptide release in the trigeminovascular system. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 40 (12), 1296-1309 (2020).

Перепечатки и разрешения

Теги

Высвобождение CGRPмодель ex vivoпатофизиология мигренитвердая мозговая оболочкатройничный ганглийколичественное определение белкаподготовка тканей грызуновнабор для ИФАстимуляция капсаицином
Ex Vivo Высвобождение пептида, связанного с геном кальцитонина, из тригеминосаскулярной системы у грызунов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.