Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Объединение человеческих органоидов и технологии «орган на чипе» для моделирования функциональности, специфичной для области кишечника

26K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63724

⸱

5 мая 2022 г.

 ,  ,  ,  , 
1Emulate Inc. Boston, 2Center for Stem Cell and Organoid Medicine, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 3Division of Pediatric General and Thoracic Surgery, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Полученные из биопсии кишечные органоиды и технологии «орган на чипах» объединены в микрофизиологическую платформу для рекапитуляции специфической для региона функциональности кишечника.

Аннотация

Слизистая оболочка кишечника представляет собой сложный физический и биохимический барьер, который выполняет множество важных функций. Он обеспечивает транспорт, поглощение и метаболизм питательных веществ и ксенобиотиков, одновременно облегчая симбиотические отношения с микробиотой и ограничивая инвазию микроорганизмов. Функциональное взаимодействие между различными типами клеток и их физической и биохимической средой имеет жизненно важное значение для установления и поддержания гомеостаза кишечной ткани. Моделирование этих сложных взаимодействий и интегрированной физиологии кишечника in vitro является сложной целью с потенциалом для преобразования способа обнаружения и разработки новых терапевтических мишеней и кандидатов в лекарства.

Органоиды и технологии Organ-on-a-Chip недавно были объединены для создания соответствующих человеку чипов кишечника, подходящих для изучения функциональных аспектов физиологии кишечника и патофизиологии in vitro. Органоиды, полученные из биопсии тонкой (двенадцатиперстной кишки) и толстой кишки, засеиваются в верхний компартмент чипа органа, а затем успешно расширяются в виде монослоев, сохраняя при этом различные клеточные, молекулярные и функциональные особенности каждой области кишечника. Специфические для тканеспецифической ткани кишечника микрососудистые эндотелиальные клетки человека включены в нижний отсек чипа органа для воссоздания эпителиально-эндотелиального интерфейса. Эта новая платформа облегчает люминальное воздействие питательных веществ, лекарств и микроорганизмов, позволяя изучать кишечный транспорт, проницаемость и взаимодействие хозяина и микроба.

Здесь приведен подробный протокол создания чипов кишечника, представляющих двенадцатиперстную кишку человека (чип двенадцатиперстной кишки) и толстой кишки (чип толстой кишки), и их последующей культивации при непрерывном потоке и перистальтикоподобных деформациях. Показаны методы оценки метаболизма лекарственных средств и индукции CYP3A4 в чипе двенадцатиперстной кишки с использованием прототипных индукторов и субстратов. Наконец, мы предоставляем пошаговую процедуру моделирования in vitro опосредованного интерфероном гамма (IFNγ) барьерного разрушения (синдром протекающего кишечника) в чипе толстой кишки, включая методы оценки изменения параклеточной проницаемости, изменений секреции цитокинов и транскриптомного профилирования клеток внутри чипа.

Введение

Кишечник человека является сложным и многозадачным органом, способным к саморегенерации. Он делится на тонкую и толстую кишку. Основная функция тонкой кишки заключается в дальнейшем переваривании пищи, поступающей из желудка, поглощении всех питательных веществ и передаче остатков в толстую кишку, которая восстанавливает воду и электролиты. Тонкая кишка далее делится на несколько анатомически различных областей: двенадцатиперстной кишки, тощей кишки и подвздошной кишки, каждая из которых приспособлена для выполнения определенных функций. Например, двенадцатиперстная кишка помогает расщеплять химус (содержимое желудка), чтобы обеспечить правильное поглощение питательных веществ, включая белки, углеводы, витамины и минералы в тощей кишке. Эта проксимальная часть тонкой кишки также является основным местом всасывания и метаболизма кишечного препарата, и она характеризуется более высокой экспрессией ферментов, метаболизирующих лекарство (например, CYP3A4) по сравнению с их экспрессией в подвздошной кишке и толстой кишке1. В дополнение к своей основной роли в переваривании и поглощении питательных веществ, кишечник также является эффективным барьером против потенциально вредного просветного содержимого, такого как патогенные микроорганизмы, микробные метаболиты, диетические антигены и токсины 2,3. Примечательно, что толстая кишка человека населена большим количеством микроорганизмов, намного превышающих общее количество клеток в организме человека, которые обеспечивают множество преимуществ для питания, обмена веществ и иммунитета. Таким образом, поддержание целостности слизистого барьера, образованного эпителиальными клетками кишечника, имеет решающее значение для обеспечения симбиотических отношений между микробиотой кишечника и клетками-хозяевами путем их физического разделения, чтобы избежать ненужной активации иммунных клеток2. Кроме того, запрограммированная гибель клеток кишечника играет важную роль в качестве самозащитного механизма, предотвращающего сохранение или пролиферацию инфицированных клеток, тем самым распространяя потенциальные патогены3, в то время как непрерывное самообновление кишечного эпителия каждые четыре-семь дней компенсирует потерю клеток, обеспечивая барьерную целостность и гомеостаз тканей. Нарушения описанных функций кишечника, включая всасывание питательных веществ, целостность барьера или дисбаланс в гибели и самообновлении клеток кишечника, могут привести к развитию ряда желудочно-кишечных расстройств, включая недоедание и воспалительные заболевания кишечника (ВЗК)2,3.

Ранее животные модели и трансформированные линии клеток кишечника, полученные из рака, использовались для изучения физиологических и патофизиологических функций кишечной ткани человека. Тем не менее, все более заметные опасения по поводу переводимости исследований на животных на человека, вызванные наличием значительных различий между двумя видами, подчеркнули необходимость в альтернативных методах4, имеющих отношение к человеку. Обычно используемые клеточные линии кишечника in vitro включают клетки T84, Caco-2 и HT29. Хотя они имитируют определенные аспекты кишечной барьерной функции и мембранного транспорта, они характеризуются измененной экспрессией ферментов5, метаболизирующих лекарство, поверхностных рецепторов и транспортеров4. Кроме того, им не хватает специфичности сегмента кишечника и они не могут повторить сложность кишечного эпителия, причем каждая модель содержит только один из пяти типов эпителиальных клеток, присутствующих в кишечнике6.

Недавно человеческие кишечные органоидные культуры, созданные из свежих биопсий тонкой кишки и толстой кишки 7,8 или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC)9, были введены в качестве альтернативных экспериментальных моделей с потенциалом для дополнения, уменьшения и, возможно, замены экспериментов на животных в будущем. В то время как ИПСК могут быть получены неинвазивным способом, создание органоидов из ИПСК требует использования сложных и длительных протоколов (с несколькими экспериментальными шагами) и генерирует культуры, напоминающие ткани плода человека. Напротив, органоиды, полученные из биопсии, обладают высокой масштабируемостью, поскольку они могут использовать присущую кишечной ткани способность к обновлению и могут бесконечно проходить и размножаться in vitro. Важно отметить, что органоиды, полученные из биопсии, поддерживают специфические для заболевания и области кишечника характеристики первичной ткани, из которой они были разработаны, и имитируют клеточное разнообразие кишечного эпителия. Органоиды могут быть использованы в качестве специфических для пациента аватаров in vitro для разгадки биологии и патогенеза различных желудочно-кишечных расстройств и улучшения их терапевтического управления. Хотя кишечные органоиды достигли впечатляющей степени физиологической функциональности, они все еще не в состоянии воспроизвести сложность местных органов из-за отсутствия у них критических стромальных компонентов, включая кровеносные сосуды, соединительную ткань, периферические нервы и иммунные клетки, а также механической стимуляции. Механические параметры, такие как поток, напряжение сдвига, растяжение и давление, как известно, влияют на морфогенез тканей и гомеостаз in vivo и ранее было показано, что они улучшают созревание клеток in vitro 10,11,12,13. Дополнительным важным недостатком органоидных систем является недоступность просвета и, таким образом, апикальной стороны эпителия. Это представляет собой проблему для исследования различных механизмов, связанных с поляризованной экспрессией транспортеров ионов и лекарств, взаимодействиями между хозяином и микробиомом и тестированием фармацевтической токсичности. Наконец, органоидные культуры страдают от значительной изменчивости в размерах, морфологии и функциях из-за стохастического характера процесса самоорганизации in vitro и выбора судьбы клеток. Поэтому, чтобы реализовать весь потенциал кишечных органоидов в моделировании заболеваний, скрининге лекарств и регенеративной медицине, необходимо изучить новые стратегии, которые уменьшают вариабельность в развитии органоидов, улучшают доступ к просветному компартменту и включают недостающие взаимодействия клетки и клетки.

Технология «орган на чипе» представила множество методов для включения механических сил и потока жидкости в культуры клеток кишечника in vitro. Однако, поскольку большинство первоначальных исследований, подтверждающих концепцию, использовали клеточные линии, полученные из рака, которые не проявляли достаточного клеточного разнообразия, актуальность этих систем была поставлена под сомнение. Недавно мы синергетически объединили кишечные органоиды и технологию «орган на чипе», чтобы включить лучшие особенности каждого подхода в одну систему in vitro 14,15,16. Полученный кишечный чип рекапитулирует многоклеточную архитектуру кишечного эпителия, наличие интерфейса эпителиально-эндотелиальной ткани и механические силы потока и растяжения жидкости, что позволяет эмулировать функции на уровне органов in vitro. Кроме того, использование органоидов, полученных из первичной ткани (которые могут быть отобраны из разных областей кишечника человека) в качестве исходного материала увеличивает универсальность этой модели, поскольку чипы, представляющие двенадцатиперстную кишку человека, тошку, подвздошную кишку и толстую кишку, могут быть установлены после аналогичных процедур посева и культивирования. Важно отметить, что кишечные чипы позволяют в режиме реального времени оценивать: целостность кишечного барьера; активность ферментов границы кисти и лекарственного обмена; производство муцинов; секреция цитокинов; и взаимодействие клеток кишечника с патогенными и комменсальными микроорганизмами, как показано в ранее опубликованных отчетах. Примечательно, что когда чипы кишечника были установлены с использованием органоидов, полученных из тканей разных людей, эти модели зафиксировали ожидаемую междонорскую вариабельность функциональных реакций на различные лекарства и методы лечения. В целом, слияние органоидов с технологией Organ-on-a-Chip открывает двери для более продвинутых, персонализированных, релевантных in vivo моделей, которые могут улучшить физиологическую значимость и точность результатов in vitro, а также их экстраполяцию на людей. Здесь представлен подробный протокол установления чипа кишечника и его применения в исследованиях физиологических функций двух сегментов кишечника: двенадцатиперстной кишки и толстой кишки. Во-первых, описаны методы оценки активности лекарственно-метаболизирующего фермента CYP3A4 в чипе двенадцатиперстной кишки, а также его индукции прототипными соединениями, такими как рифампицин и витамин D3. Во-вторых, шаги, необходимые для моделирования «протекающей кишки» в чипе толстой кишки, изложены в протоколе, при этом нарушение эпителиального барьера выполняется с использованием отличительных цитокинов, участвующих в патогенезе ВЗК. Вкратце, органоиды, полученные из биопсии человека, размножаются in vitro, подвергаются ферментативному пищеварению и вводятся в верхний канал чипа. В присутствии непрерывной перфузии с обогащенными фактором роста средами они превращаются в сливающийся эпителиальный монослой с 3D-архитектурой и легкодоступной поверхностью апикальной ячейки. Нижний, «сосудистый» чип-отсек засеян микрососудистыми эндотелиальными клетками, выделенными из тонкой или толстой кишки. Эпителий и эндотелий разделены пористой растягивающейся мембраной, которая облегчает паракринные взаимодействия между двумя тканями и при воздействии циклических деформаций имитирует перистальтикоподобные движения кишечника человека. Кокультура поддерживается в условиях динамического потока, генерируемого просветной и сосудистой перфузией с соответствующими клеточными культуральными средами. Наконец, мы описываем многочисленные типы анализов и анализов конечных точек, которые могут быть выполнены непосредственно на чипе или из отобранных сточных вод клеточной культуры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все клеточные культуры должны обрабатываться с использованием надлежащей асептической техники.

Органоиды кишечника человека, используемые в этом исследовании, были получены из Университета Джона Хопкинса, и все методы были проведены в соответствии с утвержденными руководящими принципами и правилами. Все экспериментальные протоколы были одобрены Советом по институциональному обзору Университета Джона Хопкинса (IRB #NA 00038329).

1. Приготовление реагентов клеточной культуры

  1. Подготовьте органоидную питательную среду человека в соответствии с инструкциями производителя (Таблица материалов) и дополните ее 100 мкг/мл примоцина.
  2. Готовят среду для роста микрососудистых эндотелиальных клеток человека в соответствии с инструкциями производителя (Таблица материалов) и добавляют 1:20 об/об FBS и 50 мкг/мл вместо 100 мкг/мл примоцина.
  3. Повторное суспендирование Y-27632 (ингибитор ро-киназы) в стерильном 0,1% BSA в DPBS для приготовления стокового раствора 10 мМ. Аликвотируется в стерильные микротрубки и хранится при -20 °C до 6 месяцев.
  4. Повторное суспендирование CHIR99021 (ингибитор GSK-3) в стерильном диметилсульфоксиде (ДМСО) для получения запасного раствора 5 мМ. Аликвотируется в стерильные микротрубки и хранится при -20 °C до 6 месяцев.
  5. Приготовьте раствор органоидного пищеварения человека, смешав диссоциационный раствор органоидов 1:1 об/об (Таблица материалов) с раствором DPBS (Таблица материалов) и дополнив его 10 мкМ раствором Y-27632. Этот реагент должен быть сделан свежим для каждого использования.

2. Культура микрососудистых эндотелиальных клеток кишечника человека (HIMEC)

  1. Инициируйте культуру HIMEC (Таблица материалов) за 7 дней до посева ее на чип. Только HIMEC в проходе 1-6 могут быть использованы для посева стружки.
  2. Добавить 5 мл раствора коэффициента крепления (таблица материалов) в колбу T150; инкубировать при 37 °C в течение 1 мин и выбросить раствор.
  3. Добавьте в колбу 19 мл среды для роста эндотелиальных клеток, предварительно нагретой при комнатной температуре (см. этап 1.2).
  4. Разморозьте замороженный флакон HIMEC (2 миллиона клеток на флакон) на водяной бане с температурой 37°C.
  5. Переместите содержимое флакона в колбу и аккуратно раскачайте колбу, чтобы равномерно распределить клетки. Поместите колбу в инкубатор с температурой 37 °C на ночь, чтобы эндотелиальные клетки прилипли.
  6. Замените среду 20 мл среды для роста эндотелиальных клеток, предварительно нагретой при комнатной температуре на следующий день и каждые 3 дня после этого. Культуры должны достигать 90% слияния в день сбора клеток для экспериментов с чипами.

3. Микропроизводство и приготовление чипа

  1. Получите чипы у коммерческого поставщика (Таблица материалов). Распакуйте чипсы и поместите их в колыбель для чипов, помещенную в квадратную чашку Петри (Таблица материалов). Маркировка лицевой стороны каждого носителя чипа с экспериментальными условиями (рисунок 1A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как представленный протокол опирается на использование конкретного коммерчески доступного чипа и приборов, существует несколько микрофлюидных устройств, предлагаемых различными поставщиками, которые могут предлагать альтернативные преимущества, но не имеют возможности включать растяжение. Кроме того, микропроизводство органов-на-чипах может быть выполнено «в домашних условиях» после процедур, описанных в Huh et al.21.

4. Активация и ECM покрытие мембраны

  1. Приготовление активационного раствора
    1. Доведите реагенты ER-1 и ER-2 (Таблица материалов) до комнатной температуры, чтобы уравновесить перед использованием. ER-1 светочувствительна и должна обрабатываться в темноте.
    2. Восстановите ER-1 в 10 мл реагента ER-2, чтобы получить конечную концентрацию 0,5 мг/мл и подтвердить, что ER-1 полностью растворен.
  2. Активация поверхности
    1. Осторожно протолкните 50 мкл раствора ER-1 через оба канала чипа (рисунок 1A).
    2. Удалите излишки раствора ER-1 с поверхности чипа с помощью аспиратора.
    3. Проверьте чипы, чтобы убедиться, что все чипы получили раствор ER-1. В случае пузырьков воздуха введите больше раствора ER-1 до тех пор, пока пузырьки не будут полностью удалены.
    4. Инкубируйте чипы внутри камеры УФ-лампы (таблица материалов) в течение 15 минут. Убедитесь, что УФ-лампа установлена на последовательную настройку.
    5. Верните активированные чипы ER-1 обратно в шкаф биобезопасности (BSC). Аспирируйте раствор ER-1 из обоих каналов. Промыть любой остаток раствора ЭР-1 200 мкл ЭР-2.
    6. Протолкните 200 мкл стерильного фосфатно-буферного физиологического раствора Dulbecco (DBPS) через каналы (Таблица материалов) и оставьте DBPS в каналах до следующего шага.
  3. Подготовка внеклеточного матрикса (ECM) и мембранного покрытия
    1. Подготовка стоковых растворов компонентов ECM
      1. Восстановите коллаген IV (Таблица материалов) и фибронектин (Таблица материалов) с использованием стерильной клеточной культуральной воды (Таблица материалов) до конечной концентрации 1 мг/мл. Подготовьте аликвоты и храните их при -20°C до использования.
    2. Приготовление рабочего раствора ECM для мембранного покрытия
      1. Подготовьте 1,5 мл каждого раствора ECM для верхнего и нижнего канала на каждые 12 микросхем, подлежащих покрытию. Раствор ECM всегда должен быть приготовлен непосредственно перед использованием.
      2. Для верхнего канала смешайте коллаген IV и солюбилизированную базальную мембранную матрицу (BMM) (Таблица материалов) в стерильных холодных DBPS при 200 мкг/мл и 100 мкг/мл соответственно. Для нижнего канала смешайте коллаген IV и фибронектин в стерильном холодном DPBS при 200 мкг/мл и 30 мкг/мл соответственно.
    3. ECM покрытие стружки
      1. Аспирация DBPS из обоих каналов чипов и замена соответствующим рабочим решением ECM для каждого канала (рисунок 1A).
      2. Осмотрите каждый чип, чтобы убедиться, что он получил раствор покрытия. В случае пузырьков воздуха протолкните больше раствора покрытия, пока все пузырьки не будут полностью удалены.
      3. Добавьте стерильный DPBS в колыбель для чипов и поместите чашку Петри, содержащую чипсы, в инкубатор с температурой 37 °C. Инкубировать в течение ночи, чтобы позволить белкам ECM образовывать ионные связи с активированной мембраной PDMS. При желании клетки могут быть посеяны в любое время от 2 ч до 1 дня после нанесения покрытия на стружку. В качестве альтернативы, чипсы с покрытием могут храниться при 4°C в течение ночи, с последующей ночной инкубацией при 37 °C и посевом чипсов.

5. Посев микрососудистых эндотелиальных клеток кишечника (HIMEC) в нижнем канале чипа

ПРИМЕЧАНИЕ: Тонкие кишечные и толстокишечные HIMECs засеиваются в нижний канал двенадцатиперстной кишки и толстой кишки соответственно.

  1. Приготовление чипсов
    1. Перенесите чипы с покрытием ECM в BSC. Аккуратно аспирировать ECM-покрытие из обоих каналов стружки, а затем промыть оба канала 200 мкл органоидной питательной среды и среды роста эндотелиальных клеток соответственно.
    2. Храните промытую стружку в инкубаторе при температуре 37°C до начала посева эндотелиальных клеток.
  2. Соберите эндотелиальные клетки
    1. Принесите колбу с культурой HIMEC в BSC и вымойте с помощью стерильных DPBS.
    2. Добавьте 3 мл диссоциационного раствора в колбу и поместите его в инкубатор при температуре 37°C на 2 мин, чтобы обеспечить полное отсоединение клеток.
    3. Соберите клетки в коническую трубку объемом 15 мл и добавьте среду роста эндотелиальных клеток, пока она не достигнет 10 мл. Образец 15-20 мкл клеточной суспензии для подсчета клеток. Центрифуга при 150 х г в течение 5 мин.
    4. Осторожно аспирируют супернатант и повторно суспендируют HIMEC до плотности 8-10 х 106 клеток/мл в средах роста эндотелиальных клеток.
  3. Засейте эндотелиальные клетки в нижний канал чипа
    1. Поднесите чашку Петри, содержащую чипсы, к BSC и аккуратно извлеките все носители из нижнего канала с помощью пипетки объемом 1000 мкл.
    2. Введите 10-15 мкл суспензии HIMEC в нижний канал чипа. Осмотрите чип сразу после посева, чтобы обеспечить оптимальную плотность посева (80-90% покрытия) и однородное распределение клеток в канале (рисунок 1D). Если плотность посева выше или ниже, чем ожидалось, или неравномерна, промыть канал 2x 200 мкл среды роста эндотелиальных клеток и повторить процедуру посева.
    3. Переверните чашку Петри сразу после посева каждой партии из шести чипов, чтобы обеспечить прикрепление эндотелиальных клеток к нижней стороне мембраны PDMS. Поместите чашки Петри в инкубатор при температуре 37°C на 30 мин до 1 ч или до тех пор, пока HIMEC в нижнем канале не прикрепятся к мембране (рисунок 1D).
  4. Вымойте чипсы
    1. Осторожно протолкните 200 мкл среды роста эндотелиальных клеток через входное отверстие нижнего канала, чтобы удалить любые неприсоединенные клетки и восполнить питательные вещества в среде.
    2. Смойте клетки, которые не прикрепились в верхнем канале, 200 мкл органоидной питательной среды, дополненной 5 мкМ CHIR99021 и 10 мкМ Y-27632.
    3. Поместите чипсы в инкубатор при температуре 37°C до тех пор, пока не перейдет к посеву эпителиальных клеток.

6. Посев органоидных фрагментов в верхний канал чипа

ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды, выделенные из биопсии различных областей кишечника, могут культивироваться в чипе7 кишечника. Следуйте процедурам, описанным в Fujii et al. для выделения кишечных крипт человека и создания органоидных культур22. Здесь дуоденальные и толстые органоиды используются для генерации чипов двенадцатиперстной и толстой кишки соответственно. Учитывая высокую вариабельность органоидов в образовании и росте органоидов от партии к партии и донору, предлагается провести экспериментальную оценку плотности клеток в культуре суспензии органоида (формат пластины с 24 лунками) для достижения оптимальной плотности посева 8 миллионов клеток/мл.

  1. Пилотная оценка количества клеток/лунки статической органоидной культуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура предназначена исключительно для определения количества лунок органоидной суспензионной культуры, необходимой для посева стружки. Полученные одиночные ячейки не следует использовать для посева чипов.
    1. Осторожно аспирировать супернатант из трех лунок органоидной культуральной пластинки. Добавьте 500 мкл ледяного раствора для диссоциации BMM (Таблица материалов) в каждую скважину и используйте пластиковый скребок для отделения солюбилизированного BMM от пластика.
    2. Соберите органоидную суспензию в стерильную коническую трубку с низким содержанием белка, используя ледяную пипетку объемом 1000 мкл. Инкубировать на льду в течение 60 мин, перемешивая каждые 15 мин, осторожно встряхивая тюбик. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин при 4°C.
    3. Аспирировать надосадочный агент и добавить 2 мл трипсина. Инкубировать при 37°C в течение 30 мин, чтобы переварить органоиды до одноклеточного уровня и добавить 10 мл полной органоидной питательной среды, чтобы остановить ферментативную реакцию. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин при 4°C.
    4. Повторно суспендируют клеточную гранулу в 1 мл полной органоидной питательной среды и подсчитывают общее количество клеток с помощью гематоцитометра по стандартным методам.
  2. Подготовка фрагментов органоидов и их посев в чип
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие процедуры могут быть использованы для посева дуоденальных или кишечных органоидов в верхнем канале чипа. Создание эпителиального монослоя с соответствующей 3D-цитоархитектурой in vivo зависит от наличия потока15,23 и успешного посева органоидных фрагментов.
    1. Тщательно аспирируют среду из числа лунок статической органоидной культуры, что достаточно, как определено на этапе 6.1, для достижения конечной плотности посева 8 млн. клеток/мл. Добавьте 500 мкл ледяного раствора диссоциации BMM в каждую лунку.
    2. Отделите солюбилизированный BMM от поверхности скважин с помощью пластикового скребка или пипетки объемом 1000 мкл. Соберите суспензию в 15 мл низкобелковой связывающей коническую трубку.
    3. Храните суспензию на льду в течение 60 мин, перемешивая каждые 15 мин, осторожно встряхивая тюбик. Приступают к центрифугированию при 300 х г в течение 5 мин при 4°С. Четко определенная органоидная гранула должна быть видна после центрифугирования. Если над ячейкой гранулы наблюдается прозрачный слой геля (остатки солюбилизированного БММ) (рисунок 1B), перейдите к следующим шагам.
      1. Смешайте надосадочную и клеточную гранулы и добавьте равный объем диссоциационного раствора BMM в пробирку. Аккуратно перемешайте и храните на льду еще 10 мин и приступайте к центрифугированию при 300 х г в течение 5 мин при 4°C.
      2. При необходимости повторяйте этап 6.2.3.1 до тех пор, пока не отсутствуют солюбилизированные остатки БММ.
    4. Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте органоидную гранулу раствором органоидного пищеварения (см. шаг 1.5). Используйте достаточный объем органоидного раствора для пищеварения, чтобы обеспечить полное погружение гранулы. 2 мл раствора подходит примерно для 2 400-12 000 органоидов среднего размера (рисунок 1D, после посева). Инкубировать при 37°C в течение 1-3 мин.
    5. Добавьте Advanced DMEM/F-12 в трубку, чтобы остановить ферментативную реакцию. Используйте в четыре раза больший объем используемого раствора для пищеварения. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин при 4°C.
    6. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать гранулы фрагментов органоидов в полной органоидной питательной среде, дополненной 5 мкМ CHIR99021 и 10 мкМ Y-27632, чтобы достичь 8 миллионов клеток / мл. Готовят 360 мкл аликвот суспензии в стерильных 1,5 мл низкобелковых связывающих трубках, чтобы предотвратить снижение плотности клеток из-за прикрепления на стенках.
    7. Удалите среду из верхнего канала покрытой стружки. Добавьте 30 мкл клеточной суспензии в верхний канал каждого чипа. Инкубируйте чипы в течение ночи в инкубаторе с температурой 37 °C, чтобы фрагменты органоидов прилипали к мембране, покрытой ECM (рисунок 1D).

7. Динамическая культура кишечного чипа - инициация и поддержание течения и перистальтикоподобных движений

  1. Подготовка и дегазация среды
    1. Чтобы поддерживать постоянный ламинарный поток через чип, позвольте температуре среды уравновеситься до комнатной температуры, а затем подвергните ее вакуумной фильтрации в течение 10 минут с помощью вакуумного насоса и конических трубок фильтра PVDF (дегазация среды).
  2. Грунтовка портативных модулей
    ПРИМЕЧАНИЕ: Портативные модули представляют собой резервуары, которые действуют как интерфейс между микросхемами и модулем культуры, позволяя повторять отбор проб и дозирование среды.
    1. Откройте переносные модули, в BSC, и поместите их на лотки модулей культуры, которые являются специализированными контейнерами для выравнивания переносных модулей.
    2. Добавьте 3 мл предварительно уравновешенной полной органоидной питательной среды, дополненной 5 мкм CHIR99021 и 10 мкМ Y-27632 в верхний входной резервуар и 3 мл предварительно уравновешенной среды для роста эндотелиальных клеток в нижнем входном резервуаре (рисунок 1C). Добавьте 300 мкл той же среды в соответствующие выпускные резервуары.
    3. Поднесите лотки к инкубатору при температуре 37°C и поместите их в модуль культуры (рисунок 1C). Используйте элементы управления на экране модуля языка и региональных параметров для запуска "Prime Cycle" (продолжительностью 1 мин). Когда в строке состояния указано "Готово", основной цикл завершается. Повторите основной цикл, чтобы убедиться, что образовалось достаточно капель для успешного соединения чипов.
    4. Убедитесь, что все портативные модули загрунтованы и имеют видимые капли носителя.
  3. Введение потока
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поток обычно инициируется через 24 ч после посева органоидных фрагментов, чтобы позволить эпителиальным клеткам кишечника прочно прикрепляться к мембране.
    1. Промыть оба канала засеянных чипсов 200 мкл соответствующей среды, чтобы удалить любые пузырьки или клеточный мусор. Оставьте небольшие капельки носителей на портах после стирки. Вставьте держатель чипа в портативный модуль (рисунок 1С).
    2. Поместите переносные модули в лотки, а затем в модуль культуры. Используйте элементы управления на экране модуля культуры для программирования соответствующих условий культивирования чипа органа (скорость потока и растяжение).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для стандартных условий культивирования чипов двенадцатиперстной кишки и толстой кишки установите скорость потока на уровне 30 мкл/ч15 и 60 мкл/ч16 соответственно как для верхнего, так и для нижнего каналов. Однако скорость потока для каждого канала контролируется независимо и может быть установлена в пределах 0-1000 мкл/ч. Шприцевые или перистальтические насосы могут использоваться вместо представленных здесь модулей культуры для введения ламинарного потока в микрофлюидные чипы. Однако установление надежных жидкостных соединений между стружками и насосами с использованием трубок и разъемов может быть технически сложной задачей, когда требуется одновременная перфузия нескольких стружек.
    3. Запустите «Цикл регулирования» (продолжительностью 2 часа), который создает давление на питательные среды в портативном модуле и чипе, чтобы предотвратить зарождение пузырьков воздуха. Запрограммированные условия возобновятся после завершения цикла регулирования.
  4. Смена носителей
    1. Подготовьте свежие среды для обоих каналов и пополняйте их каждые 48 ч, добавляя 2 мл свежей среды во входные резервуары (рисунок 1С).
    2. Приостановите работу модулей языка и региональных параметров и перенесите лотки в BSC. Аспирировать среды во всех водоемах и пополнять свежими средами. Верните лотки и перезапустите поток.
  5. Введение растяжки
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дайте клеткам вырасти до 100% слияния перед применением циклического штамма. Растяжение обычно вводят через 3 дня после посева или через 48 ч после начала жидкой культуры. 2% циклическая деформация на частоте 0,2 или 0,15 Гц, для11-перстной кишки и24 толстой кишки чипа, соответственно, применяется в течение начальных 24 ч. Затем он дополнительно увеличивается до 10% в течение оставшейся продолжительности культуры чипа кишечника, чтобы очень напоминать циклический штамм, испытываемый эпителиальными клетками кишечника in vivo (рисунок 1D)25. Модуль культивирования может поддерживать применение 2%-12% циклической деформации и частотой до 0,4 Гц.
    1. Чтобы ввести растяжение в текущую текучую культуру, приостановите модуль культуры. С помощью элементов управления на экране измените настройки растяжения на 2% растяжки, частоту 0,2 или 0,15 Гц и перезапустите модуль культуры.
    2. Через 24 ч повторите шаг 7.5.1, чтобы применить растяжение 10%, частоту 0,2 или 0,15 Гц.

8. Индукция CYP450 с использованием прототипов индукторов CYP в чипе двенадцатиперстной кишки

ПРИМЕЧАНИЕ: Индукционный анализ цитохрома P450 (CYP450) позволяет оценить, повышает ли исследуемое соединение уровни мРНК и/или каталитическую активность специфических ферментов CYP450. Здесь мы описываем протокол оценки индукции CYP3A4 по отраслевому стандарту и регулятору, рекомендованному in vitro индукторами CYP, рифампицином (RIF) и 1,2-дигидроксивитаном D3 (VD3). Представленный способ может быть использован для идентификации потенциала различных исследуемых соединений индуцировать различные изоформы CYP450 в кишечной ткани человека. Для каждой изоформы фермента, подлежащей оценке, необходимо будет выбрать конкретные наборы праймеров и зондового субстрата.

  1. Воздействие индукторов CYP
    1. Подготовьте исходные растворы 20 мМ РИФ, 100 мМ VD3 и 200 мМ тестостерона (Таблица материалов) с использованием стерильного ДМСО.
      ВНИМАНИЕ: Тестостерон является контролируемым веществом Списка III. Соблюдайте нормативные процедуры во время обработки.
    2. Готовят дозирующие среды с индукторами CYP путем разбавления исходных растворов в полной органоидной питательной среде и среде роста эндотелиальных клеток для достижения 20 мкМ RIF, 100 нмоль/л VD3. Подготовка системы управления транспортным средством путем разбавления ДМСО в соответствующих средах для достижения 0,1% ДМСО.
    3. Приостановите работу модуля языка и региональных параметров и перенесите лотки в BSC. Замените среду во всех входных резервуарах дозирующими средами объемом 2 мл с помощью индукторов или управления транспортным средством. Верните переносимые модули обратно в модуль культуры и перезапустите поток со скоростью 30 мкл/ч.
    4. Через 24 ч замените среду индуцирующим раствором и повторите шаги 8.1.2-8.1.3. Индуцирующие растворы следует готовить в свежем виде ежедневно и пополнять каждые 24 ч в течение эксперимента, который обычно длится 48-72 ч.
  2. Инкубация с прототипом субстрата (тестостерон)
    1. В день сбора урожая подготовьте пробный субстратный раствор тестостерона вместе с соответствующими индукторами в Advanced DMEM/F12 для получения конечной концентрации 200 мкМ. Опустите добавление сыворотки в среду, так как это может помешать анализу LCMS.
    2. Поднесите лотки в BSC и аспирируйте дозирующую среду из всех резервуаров. Промыть и заменить верхний и нижний впускные резервуары теплой средой Advanced DMEM/F12 и средой роста эндотелиальных клеток соответственно.
    3. Извлеките промывочную среду из резервуаров и замените ее 1 мл раствора пробной подложки, приготовленного на этапе 8.2.1. Перфьюируйте стружку с высокой скоростью потока 1000 мкл/ч в течение 5 мин и аспирируйте как верхние, так и нижние выпускные резервуары. Верните чипсы в модуль культивирования и инкубируйте в течение 1 ч при постоянном потоке 300 мкл/ч.
  3. Анализ данных
    1. Отбор проб для анализа LCMS
      1. Аликвот 200 мкл стоп-раствора, содержащего ацетонитрил с 0,1% муравьиной кислотой в предварительно меченых пробирках по 1,5 мл и поместить их на лед. Состав стоп-раствора LCMS может варьироваться в зависимости от субстрата, который необходимо проанализировать.
      2. После того, как 1 ч обработки будет завершен, остановите поток и верните лотки обратно в BSC. Соберите 100 мкл сточных вод из верхнего выходного резервуара и добавьте его в соответствующую трубку, содержащую стоп-раствор (рисунок 2А). Поместите трубки сразу на сухой лед. Храните образцы при температуре -80°C, прежде чем приступать к анализу.
      3. Извлекайте и анализируйте образцы с использованием методов ВЭЖХ или LC-MS/MS, контролируя образование метаболита-6β-гидрокситестостерона (6β-OH-T). Активность фермента CYP может быть выражена в виде белка пмоль/мин/мг, где пмол относится к количеству метаболита (6β-OH-T), образующегося в ходе реакции. Общее содержание белка на чип (белок; мг) определяют путем выполнения анализа Брэдфорда, описанного на этапе 8.3.2.
        figure-protocol-1
        Активность фолд-индукции рассчитывается по: CYP-активности (индуцированной) / CYP-активности (транспортное средство).
      4. При сборе образцов для анализа мРНК см. шаг 8.3.3.
    2. Лизис клеток для анализа экспрессии белка
      ПРИМЕЧАНИЕ: Экстракция белка из клеток на чипе выполняется с использованием буфера лизиса белка, дополненного ингибиторами протеазы и фосфатазы (Таблица материалов). Извлеченный белок затем количественно определяется с использованием анализа Брэдфорда и используется в последующем анализе.
      1. Отсоедините чипы от портативных модулей и поместите их в чашку Петри. Промывайте оба канала 200 мкл стерильного DPBS.
      2. Заблокируйте выпускное отверстие нижнего канала наконечником фильтрующей пипетки объемом 200 мкл. Перфьюировать 50 мкл диссоциационного раствора через нижний канал и инкубировать в течение 2 мин при комнатной температуре.
      3. Осмотр для подтверждения полного отслоения эндотелиальных клеток. Пипетка вверх и вниз 1-2 раза и вынимайте диссоциационный раствор из канала. Повторите стирку.
      4. Заблокируйте выход верхнего канала с помощью наконечника фильтрующей пипетки объемом 200 мкл. Перфьюзия 75 мкл буфера лизиса белка через верхний канал. Оставьте наконечник пипетки вставленным, чтобы заблокировать верхний канал на входе и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре. Пипетка вверх и вниз 5-10 раз и соберите лизаты клеток в предварительно маркированную пробирку объемом 1,5 мл.
      5. Повторите шаг 8.3.2.4. до тех пор, пока не будет наблюдаться полная отслойка клеток. Соберите лизаты клеток в ту же пробирку объемом 1,5 мл и храните их при -80 °C до анализа.
      6. Извлеките белковую фракцию в соответствии со стандартными методами и количественно оцените общий белок с помощью анализа Брэдфорда (Таблица материалов).
    3. Лизис клеток для анализа экспрессии генов
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лизис клеток на чипе для экстракции РНК может быть достигнут с использованием буфера лизиса РНК, дополненного 0,1% 2-меркаптоэтанолом (Таблица материалов). В качестве альтернативы, буфер лизиса РНК на основе фенола может быть использован, если требуются высокие выходы высококачественной РНК, подходящей для анализа NGS и микрочипов.
      1. Выполните шаги 8.3.2.1-8.3.2.2 для подготовки кишечного чипа к лизису.
      2. Заблокируйте выход верхнего канала с помощью наконечника фильтрующей пипетки объемом 200 мкл. Перфьюзия 150 мкл буфера лизиса РНК через верхний канал. Оставьте наконечник пипетки вставленным, чтобы заблокировать входное отверстие верхнего канала. Инкубировать в течение 2 мин при комнатной температуре. Для лизиса с использованием буфера лизиса РНК на основе фенола используют 350 мкл реагента.
      3. Пипетка вверх и вниз 5-10 раз и соберите лизаты клеток в предварительно маркированную трубку объемом 1,5 мл. Повторите этап с еще 150 мкл буфера лизиса РНК и соберите. Храните лизаты клеток при -80 °C до анализа. В случае последующего анализа секвенирования РНК приступайте к анализу в течение 1 месяца после лизирования.
      4. Извлеките общую РНК из лизатов клеток с помощью набора для очистки РНК.
      5. Обратная транскрибация в кДНК с использованием набора обратной транскриптазы и проведение ПЦР в режиме реального времени с использованием циклера ПЦР в реальном времени и соответствующих праймеров и буфера. Количественная оценка результатов с использованием метода 2-ΔΔCt .

9. Нарушение эпителиального барьера с помощью провоспалительных цитокинов в чипе толстой кишки

ПРИМЕЧАНИЕ: Данный протокол описывает нарушение кишечного эпителиального барьера цитокиновым интерфероном гамма (IFNγ)26,27,28,29. Цитокин дозируется в нижнем канале чипа толстой кишки, учитывая базолатеральную экспрессию рецептора IFNγ на эпителиальных клетках кишечника.  Провоспалительный стимул вводится в чип на 5-й день культуры, как толькоприложение P стабилизируется ниже 0,5 х 10-6 см / с. Аналогичный режим дозирования может быть использован для других провоспалительных цитокинов и барьерных деструктивных агентов.

  1. Стимуляция с помощью IFNγ
    1. Приготовьте 100 мкг/мл исходного раствора IFNγ (Таблица материалов) в стерильной воде для культивирования клеток. Храните запасной раствор при -80°C в течение эксперимента. Для каждого эксперимента всегда используйте свежий запас IFNγ и избегайте более трех циклов замораживания и оттаивания.
    2. Готовят дозирующий раствор IFNγ путем разбавления исходного раствора в дегазированной среде роста эндотелиальных клеток для достижения конечной концентрации 10-100 нг/мл.
    3. Поднесите лотки в BSC и извлеките среду из резервуаров на входе в нижний канал и замените ее 3 мл среды, содержащей IFNγ. Ежедневно обновляйте дозирующий носитель IFNγ.
    4. Поместите лотки в модуль культуры и перфьминируйте чипы с высокой скоростью потока 1000 мкл/ч в течение 5 минут, чтобы начать обработку IFNγ. Переключите скорость потока обратно на 60 мкл/ч и продолжайте текучую культуру.
  2. Анализ данных
    1. Оценка функции эпителиального барьера. Кажущаяся проницаемость эпителия (P app), или барьерная функция, может быть измерена в различные моменты времени культуры после обработки IFNγ, в сточных средах входных и выходных резервуаров обоих каналов. Флуоресцентный индикатор следует добавлять в верхний канал органоидной среды роста за 4 ч до оценкиприложения P. Как правило, 3 кДа Dextran Cascade Blue используется в качестве флуоресцентного индикатора и добавляется в среду за 24 ч до этого.
      1. Приостановите работу модуля языка и региональных параметров и перенесите лотки в BSC.
      2. Нанесите этикетку и подготовьте 96-луночную черностенную пластину со 100 мкл DPBS на скважину. Используя многоканальную пипетку объемом 200 мкл, соберите и добавьте 50 мкл сточных вод из всех резервуаров в соответствующие скважины (рисунок 2B).
      3. Для получения стандартной кривой разбавляют среду, содержащую 100 мкг/мл 3 кДа декстран Каскадного синего 1:3 в DPBS. Впоследствии выполняют серийные разведения с использованием трехкратного разведения среды роста эндотелиальных клеток в DPBS.
      4. Считывайте флуоресценцию при возбуждении 375 нм и излучении 420 нм с помощью пластинчатого считывателя. Используйте измеренные значения OD для расчета кажущейся проницаемости (приложение P) следующим образом:
        figure-protocol-2
    2. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток на чипе
      1. Мойте, используя 200 мкл DPBS для каждого канала, три раза.
      2. Перфьюируйте 200 мкл фиксирующего раствора (4% PFA в DPBS) в каждом канале. Инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре.
      3. Повторите этап стирки 9.2.2.1. На этом этапе промытая стружка может храниться до 7 дней при 4°C.
      4. Пермеабилизируйте клетки, используя 200 мкл раствора для пермеабилизации (0,1% Triton-X 100 в 10% нормальной ослиной сыворотке (NDS) в DPBS) для каждого канала. Инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре. Повторите этап стирки 9.2.2.1.
      5. Блокируйте ячейки на чипе, используя 200 мкл блокирующего раствора (10% NDS в DPBS) для каждого канала. Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре.
      6. Разбавляют первичные антитела в растворе антител (5% НБД в DPBS) следующим образом: анти-Zonula Occludens 1 (ZO-1) (1:100, эпителиальный маркер плотного соединения), анти-окклюдин (1:100, маркер эпителиального плотного соединения), анти-клаудин 4 (1:100, маркер эпителиального плотного соединения), анти-E-кадгерин (1:100, маркер стыков эпителиальных адгезий (Таблица материалов). Перфьюировать 200 мкл раствора первичного антитела через каждый канал и инкубировать в течение ночи при 4 °C. Повторите этап стирки 9.2.2.1.
      7. Разводят вторичные антитела в растворе антител (1:300, 5% NDS в DPBS). Перфьюировать 200 мкл этого раствора через каждый канал и инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре. Повторите этап стирки 9.2.2.1. При желании фаллоидин, цитоскелетный маркер, может быть добавлен к раствору вторичного антитела.
      8. Приготовьте 50 мкг/мл раствора 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в DPBS и используйте его для перфузии 200 мкл через каждый канал. Инкубировать при комнатной температуре в течение 15 мин. Повторите этап стирки. На этом этапе окрашенные чипсы могут храниться до 14 дней при 4°C.
    3. Оценка расщепления Каспазы 3
      1. Выделите и количественно оцените общее количество белка эпителиальных клеток, как описано на этапе 8.3.2. Пропустите этап стирки 8.3.2.1. Разбавить образцы DPBS до конечной концентрации 400 мкг/мл.
      2. Количественная оценка уровней общей и расщепленной каспазы 3 с помощью комплекта обнаружения каспазы 3 в соответствии с протоколом производителя.
    4. Оценка секреции провоспалительных цитокинов
      1. Используйте стоки, собранные из выходного отверстия обоих каналов чипа толстой кишки, для количественной оценки секретируемых провоспалительных цитокинов острой фазы в соответствии с протоколами, предоставленными производителем. Выполните 5-кратное разведение для V-PLEX Vascular Injury Panel 2 Human Kit и двукратное разведение для V-PLEX Human Proinflammatory Panel II.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1D обобщена временная шкала культуры кишечного чипа и проиллюстрирована кишечные эндотелиальные клетки и органоиды до и после посева на чип. Кроме того, он демонстрирует отчетливые морфологические различия между чипами двенадцатиперстной кишки и толстой кишки, подчеркнутые наличием ворсинчатых образований в чипе двенадцатиперстной кишки и репрезентативными для архитектуры тонкой кишки.

На рисунке 3A,B показ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Сочетание технологии «орган на чипе» и кишечных органоидов обещает точное моделирование физиологии кишечника человека и патофизиологии. Здесь мы предоставляем простой и надежный пошаговый протокол (описанный на рисунке 1) для создания чипа кишечника, содержащего эпителий тонкой кишки или толстой кишки, полученный из биопсии, и микрососудистые эндотелиальные клетки кишечника, совместно культивируемые в микрофлюидном устройстве. Это моделирование кишечника человека на основе чипов включает в с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Гаури Кулкарни, Атанасия Апостолу, Лорна Эварт, Каролина Луккези и Магдалена Касендра являются нынешними или бывшими сотрудниками Emulate Inc. и могут владеть акциями. Emulate Inc. является компанией, которая производит устройства с чипами органов и опубликовала патенты, относящиеся к работе, изложенной в этой статье.

Благодарности

Мы благодарим профессора Марка Доновица за предоставление органоидов, полученных из биопсии кишечника, и Бретта Клера за разработку научных иллюстраций чипа, портативного и культурного модуля. Все остальные научные иллюстрации были сгенерированы с использованием BioRender.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
тонкая кишка кишечника человека микрососудистые эндотелиальные клетки человекаAlphaBioRegenALHE150,5 клеток м/мл ; криоконсервированная
толстая кишка кишечника человека микрососудистые эндотелиальные клетки кишечника человекаAlphaBioRegenALHE160,5 клеток м/мл ; криоконсервированные
биопсийные органоиды двенадцатиперстной кишки человекаУниверситет Джона Хопкина.Органоиды были предоставлены профессором Марком Доновицом (номер институционального наблюдательного совета: NA_00038329).
Органоиды толстой кишки человека, полученные с помощью биопсии,Университет Джона Хопкина-Органоиды были предоставлены профессором Марком Доновицем (номер Институционального наблюдательного совета: NA_00038329).
Zoë СМ-1 и торговля;   Модуль культурыEmulate Inc.-Модуль культуры
Orb-HM1&торговля;   Эмуляция модуля ступицы Inc.-5% CO2, вакуумная растяжка и источник питания
Chip-S1&торговля; Эмуляция растягивающегося чипа Inc.-Орган-чип
Pod™ Эмуляция портативных модулей Inc.-Портативный модуль
UV Light BoxEmulate Inc.--
Чип КолыбельЭмулейт Inc.-1 на квадратную культуру чашки
Steriflip&-HV фильтрыEMD MilliporeSE1M003M000,45  μ М 
Квадратная чашка для клеточных культур с фильтром PVDF (120 x 120 мм)VWR82051-068-Handheld
  Вакуум  аспираторCorning4930 -
Аспиратор  пипеткиCorning / Falcon3575582 мл,  полистирол, по отдельности  обернутые
аспирационные наконечники -стерильные (автоклавные)
Серологические  пипетки -2 мл, 5 мл,  10 мл,   и  25 мл  низкий уровень эндотоксина, стерильная
пипеткаP20, P200,  P1000  и стандартные многоканальные
пипетки  Советы P20, P200,  и  Р1000.
Конические трубы ( Белки  LoBind® трубки)Eppendorf0030122216;   003012224015 мл, 50 мл пробирки
Eppendorf  Tubes®   lo-bindEppendorf0224310811,5 мл пробирки
96 лунок с черными стенками--для анализа проницаемости эпителия
Микроскоп (с камерой)--Для светло-польных 
визуализация Водяная баня (или бусины) --Установите на 37°С; C
Настройка вакуума --Минимум  давление: -70 кПа
Клеточные скребкиBiotium220033
T75 колбыBD Falcon353136Клеточная культура колба
Emulate Reagent-1 ( ER-1)Emulate Inc.-Раствор для нанесения покрытий на стружку
Emulate Reagent-2 ( ER-2)Эмулейт Инк.-Решение для нанесения покрытий на стружку
Dulbecco' с PBS  (ДПБС)Corning21-031-CV1X
Водная культураCorningMT25055CV
Trypan blueSigma93595Для подсчета клеток
TryplE  ЭкспрессThermoFisher  Научная12604013Органоиды  диссоциация  и клетки эндотелия  отряд  решение
Advanced DMEM/F12ThermoFisher  Научная12634028Medium
IntestiCult™ Органоидная среда для роста (человек)Технологии стволовых клеток06010Органоидная среда для роста
Среда для роста эндотелиальных клеток MV 2PromocellC-22121Эндотелиальная среда
Фетальная бычья сыворотка (FBS)SigmaF4135Сыворотка
Primocin™  ИнвивоГенАНТ-ПМ-1антимикробное средство
Фактор прикрепления&торговля;Клеточные системы4Z0-210Покрытие раствор для колбы
Матригель - Фактор роста СниженныйCorning356231Солюбилизированная матрица базальной мембраны
Коллаген IVSigmaC5533ECM компонент
ФибронектинCorning356008ECM компонент
Y-27632Технологии стволовых клеток72304органоидная медиа добавка
CHIR99021Reprocell04-0004-10Добавка органоидной среды
Раствор для восстановления клетокCorning354253Базальная мебрановая матриксная диссоциация
Бычья сыворотка Альбумин (БСА)SigmaA957630%, Стерильная
клеточная культура ВодныйCorningMT25055CVстерильный, Водный
ДМСОSigmaD2650растворитель
3KDa Dextran Cascade BlueInvitrogenD713210 мг порошок
Rifampicin (RIF)SigmaCat# R3501CYP индуктор
Тестостерон гидратSigmaT1500CYP субстрат
1,25-дигирокси Витамин D3 (VD3)SigmaCat# D1530CYP индуктор
Ацетонитрил с 0,1% (v/v) Муравьиная кислотаSigma159002Решение LCMS для остановки
IFNγPeprotech300-02
4% параформальдегид (PFA)EMS157-4Фиксатор
Triton-X 100SigmaT8787
Нормальная сыворотка осла (NDS)Sigma566460
антиокклюдинThermoFisher  Scientific33-1500маркер герметичных соединений
анти-Клаудина 4ThermoFisher  Научный36-4800маркер плотных соединений
анти-E-кадгеринAbcamab1416эпителиальные адгезивные соединения маркер
анти-VE-кадгеринAbcamab33168эндотелиальные адгезивные соединения маркер
анти- Zonula Occludens 1 (ZO-1)Thermo Fischer339194маркер плотных соединений
DAPIThermoFisher  Scientific62248ядерный краситель
2-меркаптоэтанолSigmaM6250
PureLink RNA Mini KitInvitrogen12183020набор для лизиса, выделения и очистки РНК
SuperScript™ IV VILO™ Мастер МиксИнвитроген11756050набор обратной транскриптазы
TaqMan™ Fast Advanced Master MixApplied Biosystems4444557реактив qPCR QuantStudio
™ 5 Система для ПЦР в реальном времениApplied BiosystemsA28573Амплификатор для ПЦР в реальном времени
18S праймерThermoFisher ScientificHs99999901_s1Eukaryotic 18S рРНК
CYP3A4 праймерThermoFisher ScientificHs00604506_m1Цитохром  семейство 3 подсемейство A участник 4
Пирс&трейд; Coomassie Plus (Bradford) Набор для анализаThermoFisher Scientific23236Набор для количественного определения белка
MSD Tris Лизисный буфер MesoScale DiagnosticsR60TX-3Буфер для лизиса белка
Craced/Total Casspase-3 Набор для лизата целых клеток MesoScale DiagnosticsK15140DНабор для обнаружения каспазы 3
V-PLEX Vascular Injury Panel 2 Human KitMeso Scale DiagnosticsK15198D
V-PLEX Провоспалительная панель человека II (4-плексная)Мезомасштабная диагностикаK15053D
Zeiss LSM 880Zeiss-Конфокальный микроскоп
Zeiss LD plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27Zeiss-20Xдальноснимаемые объективы
Zeiss AXIOvert.A1Zeiss-Brightfield микроскоп
Zeiss LD A-Plan 10X/0.25 Ph1Объективы Zeiss-10X
пластина раствор

Ссылки

  1. Fritz, A., et al. Expression of clinically relevant drug-metabolizing enzymes along the human intestine and their correlation to drug transporters and nuclear receptors: An intra-subject analysis. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 124 (3), 245-255 (2019).
  2. Okumura, R., Takeda, K. Maintenance of intestinal homeostasis by mucosal barriers. Inflammation and Regeneration. 38 (1), 1-8 (2018).
  3. Delgado, M. E., Grabinger, T., Brunner, T. Cell death at the intestinal epithelial front line. FEBS Journal. 283 (14), 2701-2719 (2016).
  4. Mestas, J., Hughes, C. C. W. Of mice and not men: Differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
  5. Sun, H., Chow, E. C. Y., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. The Caco-2 cell monolayer: Usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).
  6. Yu, H., et al. The contributions of human mini-intestines to the study of intestinal physiology and pathophysiology. Annual Review of Physiology. 79, 291-312 (2017).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  8. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  9. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-110 (2011).
  10. Durel, J. F., Nerurkar, N. L. Mechanobiology of vertebrate gut morphogenesis. Current Opinion in Genetics and Development. 63, 45-52 (2020).
  11. Gayer, C. P., Basson, M. D. The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology. Cellular Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).
  12. Xu, Y., et al. Mechanical stimulation activates Piezo1 to promote mucin2 expression in goblet cells. Journal of Gastroenterology and Hepatology (Australia). 36 (11), 3127-3139 (2021).
  13. Navabi, N., McGuckin, M. A., Lindén, S. K. Gastrointestinal cell lines form polarized epithelia with an adherent mucus layer when cultured in semi-wet interfaces with mechanical stimulation. PLoS One. 8 (7), 68761(2013).
  14. Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
  15. Kasendra, M., et al. Duodenum intestine-chip for preclinical drug assessment in a human relevant model. eLife. 9, 50135(2020).
  16. Apostolou, A., et al. A novel microphysiological colon platform to decipher mechanisms driving human intestinal permeability. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (5), 1719-1741 (2021).
  17. Jalili-Firoozinezhad, S., et al. Author correction: A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 583(2019).
  18. Yin, J., et al. Fluid shear stress enhances differentiation of jejunal human enteroids in Intestine-Chip. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (3), 258-271 (2021).
  19. Sontheimer-Phelps, A., et al. Human colon-on-a-chip enables continuous in vitro analysis of colon mucus layer accumulation and physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 507-526 (2020).
  20. Tovaglieri, A., et al. Species-specific enhancement of enterohemorrhagic E. coli pathogenesis mediated by microbiome metabolites. Microbiome. 7 (1), 43(2019).
  21. Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. 8 (11), 2135-2157 (2013).
  22. Fujii, M., Matano, M., Nanki, K., Sato, T. Efficient genetic engineering of human intestinal organoids using electroporation. Nature Protocols. 10 (10), 1474-1485 (2015).
  23. Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
  24. Sarna, S. K. Colonic motility: From bench side to bedside. Morgan & Claypool Life Sciences. , San Rafael (CA). (2010).
  25. Basson, M. D. Paradigms for mechanical signal transduction in the intestinal epithelium - category: Molecular, cell, and developmental biology. Digestion. 68 (4), 217-225 (2003).
  26. Wang, F., et al. Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression. The American Journal of Pathology. 166 (2), 409-419 (2005).
  27. Nava, P., et al. Interferon-γ regulates intestinal epithelial homeostasis through converging β-Catenin signaling pathways. Immunity. 32 (3), 392-402 (2010).
  28. Madara, J. L., Stafford, J. Interferon-γ directly affects barrier function of cultured intestinal epithelial monolayers. Journal of Clinical Investigation. 83 (2), 724-727 (1989).
  29. Bruewer, M., et al. Proinflammatory cytokines disrupt epithelial barrier function by apoptosis-independent mechanisms. The Journal of Immunology. 171 (11), 6164-6172 (2003).
  30. Jones, S. C., et al. Adhesion molecules in inflammatory bowel disease. Gut. 36 (5), 724-730 (1995).
  31. Uhlar, C. M., Whitehead, A. S. Serum amyloid A, the major vertebrate acute-phase reactant. European Journal of Biochemistry. 265 (2), 501-523 (1999).
  32. Pérez-González, C., Ceada, G., Matejčić, M., Trepat, X. Digesting the mechanobiology of the intestinal epithelium. Current Opinion in Genetics & Development. 72, 82-90 (2022).
  33. In, J., et al. Enterohemorrhagic escherichia coli reduces mucus and intermicrovillar bridges in human stem cell-derived colonoids. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (1), 48-62 (2016).
  34. Grassart, A., et al. Bioengineered human organ-on-chip reveals intestinal microenvironment and mechanical forces impacting shigella infection. Cell Host and Microbe. 26 (3), 435-444 (2019).
  35. Kerns, S. J., et al. Human immunocompetent organ-on-chip platforms allow safety profiling of tumor-targeted t-cell bispecific antibodies. eLife. 10, 67106(2021).
  36. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
  37. Ingber, D. E. Reverse engineering human pathophysiology with organs-on-chips. Cell. 164 (6), 1105-1109 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

CYP3A4
Объединение человеческих органоидов и технологии «орган на чипе» для моделирования функциональности, специфичной для области кишечника
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.