Полученные из биопсии кишечные органоиды и технологии «орган на чипах» объединены в микрофизиологическую платформу для рекапитуляции специфической для региона функциональности кишечника.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Объединение человеческих органоидов и технологии «орган на чипе» для моделирования функциональности, специфичной для области кишечника
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Слизистая оболочка кишечника представляет собой сложный физический и биохимический барьер, который выполняет множество важных функций. Он обеспечивает транспорт, поглощение и метаболизм питательных веществ и ксенобиотиков, одновременно облегчая симбиотические отношения с микробиотой и ограничивая инвазию микроорганизмов. Функциональное взаимодействие между различными типами клеток и их физической и биохимической средой имеет жизненно важное значение для установления и поддержания гомеостаза кишечной ткани. Моделирование этих сложных взаимодействий и интегрированной физиологии кишечника in vitro является сложной целью с потенциалом для преобразования способа обнаружения и разработки новых терапевтических мишеней и кандидатов в лекарства.
Органоиды и технологии Organ-on-a-Chip недавно были объединены для создания соответствующих человеку чипов кишечника, подходящих для изучения функциональных аспектов физиологии кишечника и патофизиологии in vitro. Органоиды, полученные из биопсии тонкой (двенадцатиперстной кишки) и толстой кишки, засеиваются в верхний компартмент чипа органа, а затем успешно расширяются в виде монослоев, сохраняя при этом различные клеточные, молекулярные и функциональные особенности каждой области кишечника. Специфические для тканеспецифической ткани кишечника микрососудистые эндотелиальные клетки человека включены в нижний отсек чипа органа для воссоздания эпителиально-эндотелиального интерфейса. Эта новая платформа облегчает люминальное воздействие питательных веществ, лекарств и микроорганизмов, позволяя изучать кишечный транспорт, проницаемость и взаимодействие хозяина и микроба.
Здесь приведен подробный протокол создания чипов кишечника, представляющих двенадцатиперстную кишку человека (чип двенадцатиперстной кишки) и толстой кишки (чип толстой кишки), и их последующей культивации при непрерывном потоке и перистальтикоподобных деформациях. Показаны методы оценки метаболизма лекарственных средств и индукции CYP3A4 в чипе двенадцатиперстной кишки с использованием прототипных индукторов и субстратов. Наконец, мы предоставляем пошаговую процедуру моделирования in vitro опосредованного интерфероном гамма (IFNγ) барьерного разрушения (синдром протекающего кишечника) в чипе толстой кишки, включая методы оценки изменения параклеточной проницаемости, изменений секреции цитокинов и транскриптомного профилирования клеток внутри чипа.
Введение
Кишечник человека является сложным и многозадачным органом, способным к саморегенерации. Он делится на тонкую и толстую кишку. Основная функция тонкой кишки заключается в дальнейшем переваривании пищи, поступающей из желудка, поглощении всех питательных веществ и передаче остатков в толстую кишку, которая восстанавливает воду и электролиты. Тонкая кишка далее делится на несколько анатомически различных областей: двенадцатиперстной кишки, тощей кишки и подвздошной кишки, каждая из которых приспособлена для выполнения определенных функций. Например, двенадцатиперстная кишка помогает расщеплять химус (содержимое желудка), чтобы обеспечить правильное поглощение питательны....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Все клеточные культуры должны обрабатываться с использованием надлежащей асептической техники.
Органоиды кишечника человека, используемые в этом исследовании, были получены из Университета Джона Хопкинса, и все методы были проведены в соответствии с утвержденными руководящими принципами и правилами. Все экспериментальные протоколы были одобрены Советом по институциональному обзору Университета Джона Хопкинса (IRB #NA 00038329).
1. Приготовление реагентов клеточной культуры
- Подготовьте органоидную питательную среду человека в соответствии с инструкциями производителя ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
На рисунке 1D обобщена временная шкала культуры кишечного чипа и проиллюстрирована кишечные эндотелиальные клетки и органоиды до и после посева на чип. Кроме того, он демонстрирует отчетливые морфологические различия между чипами двенадцатиперстной кишки и толстой кишки, подчеркнутые наличием ворсинчатых образований в чипе двенадцатиперстной кишки и репрезентативными для архитектуры тонкой кишки.
На рисунке 3A,B показ.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Сочетание технологии «орган на чипе» и кишечных органоидов обещает точное моделирование физиологии кишечника человека и патофизиологии. Здесь мы предоставляем простой и надежный пошаговый протокол (описанный на рисунке 1) для создания чипа кишечника, содержащего эпителий тонкой кишки или толстой кишки, полученный из биопсии, и микрососудистые эндотелиальные клетки кишечника, совместно культивируемые в микрофлюидном устройстве. Это моделирование кишечника человека на основе чипов включает в с.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Гаури Кулкарни, Атанасия Апостолу, Лорна Эварт, Каролина Луккези и Магдалена Касендра являются нынешними или бывшими сотрудниками Emulate Inc. и могут владеть акциями. Emulate Inc. является компанией, которая производит устройства с чипами органов и опубликовала патенты, относящиеся к работе, изложенной в этой статье.
Благодарности
Мы благодарим профессора Марка Доновица за предоставление органоидов, полученных из биопсии кишечника, и Бретта Клера за разработку научных иллюстраций чипа, портативного и культурного модуля. Все остальные научные иллюстрации были сгенерированы с использованием BioRender.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| тонкая кишка кишечника человека микрососудистые эндотелиальные клетки человека | AlphaBioRegen | ALHE15 | 0,5 клеток м/мл ; криоконсервированная |
| толстая кишка кишечника человека микрососудистые эндотелиальные клетки кишечника человека | AlphaBioRegen | ALHE16 | 0,5 клеток м/мл ; криоконсервированные |
| биопсийные органоиды двенадцатиперстной кишки человека | Университет Джона Хопкина. | Органоиды были предоставлены профессором Марком Доновицом (номер институционального наблюдательного совета: NA_00038329). | |
| Органоиды толстой кишки человека, полученные с помощью биопсии, | Университет Джона Хопкина | - | Органоиды были предоставлены профессором Марком Доновицем (номер Институционального наблюдательного совета: NA_00038329). |
| Zoë СМ-1 и торговля; Модуль культуры | Emulate Inc. | - | Модуль культуры |
| Orb-HM1&торговля; Эмуляция модуля ступицы | Inc. | - | 5% CO2, вакуумная растяжка и источник питания |
| Chip-S1&торговля; Эмуляция растягивающегося чипа | Inc. | - | Орган-чип |
| Pod™ Эмуляция портативных модулей | Inc. | - | Портативный модуль |
| UV Light Box | Emulate Inc. | - | - |
| Чип Колыбель | Эмулейт Inc. | - | 1 на квадратную культуру чашки |
| Steriflip&-HV фильтры | EMD Millipore | SE1M003M00 | 0,45 μ М |
| Квадратная чашка для клеточных культур с фильтром PVDF (120 x 120 мм) | VWR | 82051-068-Handheld | |
| Вакуум аспиратор | Corning | 4930 | - |
| Аспиратор пипетки | Corning / Falcon | 357558 | 2 мл, полистирол, по отдельности обернутые |
| аспирационные наконечники | - | стерильные (автоклавные) | |
| Серологические пипетки | - | 2 мл, 5 мл, 10 мл, и 25 мл низкий уровень эндотоксина, стерильная | |
| пипетка | P20, P200, P1000 и стандартные многоканальные | ||
| пипетки Советы | P20, P200, и Р1000. | ||
| Конические трубы ( Белки LoBind® трубки) | Eppendorf | 0030122216; 0030122240 | 15 мл, 50 мл пробирки |
| Eppendorf Tubes® lo-bind | Eppendorf | 022431081 | 1,5 мл пробирки |
| 96 лунок с черными стенками | - | - | для анализа проницаемости эпителия |
| Микроскоп (с камерой) | - | -Для светло-польных | |
| визуализация Водяная баня (или бусины) - | - | Установите на 37°С; C | |
| Настройка вакуума | - | - | Минимум давление: -70 кПа |
| Клеточные скребки | Biotium | 220033 | |
| T75 колбы | BD Falcon | 353136 | Клеточная культура колба |
| Emulate Reagent-1 ( ER-1) | Emulate Inc. | - | Раствор для нанесения покрытий на стружку |
| Emulate Reagent-2 ( ER-2) | Эмулейт Инк. | - | Решение для нанесения покрытий на стружку |
| Dulbecco' с PBS (ДПБС) | Corning | 21-031-CV | 1X |
| Водная культура | Corning | MT25055CV | |
| Trypan blue | Sigma | 93595 | Для подсчета клеток |
| TryplE Экспресс | ThermoFisher Научная | 12604013 | Органоиды диссоциация и клетки эндотелия отряд решение |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher Научная | 12634028 | Medium |
| IntestiCult™ Органоидная среда для роста (человек) | Технологии стволовых клеток | 06010 | Органоидная среда для роста |
| Среда для роста эндотелиальных клеток MV 2 | Promocell | C-22121 | Эндотелиальная среда |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Sigma | F4135 | Сыворотка |
| Primocin™ | ИнвивоГен | АНТ-ПМ-1 | антимикробное средство |
| Фактор прикрепления&торговля; | Клеточные системы | 4Z0-210 | Покрытие раствор для колбы |
| Матригель - Фактор роста Сниженный | Corning | 356231 | Солюбилизированная матрица базальной мембраны |
| Коллаген IV | Sigma | C5533 | ECM компонент |
| Фибронектин | Corning | 356008 | ECM компонент |
| Y-27632 | Технологии стволовых клеток | 72304 | органоидная медиа добавка |
| CHIR99021 | Reprocell | 04-0004-10 | Добавка органоидной среды |
| Раствор для восстановления клеток | Corning | 354253 | Базальная мебрановая матриксная диссоциация |
| Бычья сыворотка Альбумин (БСА) | Sigma | A9576 | 30%, Стерильная |
| клеточная культура Водный | Corning | MT25055CV | стерильный, Водный |
| ДМСО | Sigma | D2650 | растворитель |
| 3KDa Dextran Cascade Blue | Invitrogen | D7132 | 10 мг порошок |
| Rifampicin (RIF) | Sigma | Cat# R3501 | CYP индуктор |
| Тестостерон гидрат | Sigma | T1500 | CYP субстрат |
| 1,25-дигирокси Витамин D3 (VD3) | Sigma | Cat# D1530 | CYP индуктор |
| Ацетонитрил с 0,1% (v/v) Муравьиная кислота | Sigma | 159002 | Решение LCMS для остановки |
| IFNγ | Peprotech | 300-02 | |
| 4% параформальдегид (PFA) | EMS | 157-4 | Фиксатор |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Нормальная сыворотка осла (NDS) | Sigma | 566460 | |
| антиокклюдин | ThermoFisher Scientific | 33-1500 | маркер герметичных соединений |
| анти-Клаудина 4 | ThermoFisher Научный | 36-4800 | маркер плотных соединений |
| анти-E-кадгерин | Abcam | ab1416 | эпителиальные адгезивные соединения маркер |
| анти-VE-кадгерин | Abcam | ab33168 | эндотелиальные адгезивные соединения маркер |
| анти- Zonula Occludens 1 (ZO-1) | Thermo Fischer | 339194 | маркер плотных соединений |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | ядерный краситель |
| 2-меркаптоэтанол | Sigma | M6250 | |
| PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183020 | набор для лизиса, выделения и очистки РНК |
| SuperScript™ IV VILO™ Мастер Микс | Инвитроген | 11756050 | набор обратной транскриптазы |
| TaqMan™ Fast Advanced Master Mix | Applied Biosystems | 4444557 | реактив qPCR QuantStudio |
| ™ 5 Система для ПЦР в реальном времени | Applied Biosystems | A28573 | Амплификатор для ПЦР в реальном времени |
| 18S праймер | ThermoFisher Scientific | Hs99999901_s1 | Eukaryotic 18S рРНК |
| CYP3A4 праймер | ThermoFisher Scientific | Hs00604506_m1 | Цитохром семейство 3 подсемейство A участник 4 |
| Пирс&трейд; Coomassie Plus (Bradford) Набор для анализа | ThermoFisher Scientific | 23236 | Набор для количественного определения белка |
| MSD Tris Лизисный буфер Meso | Scale Diagnostics | R60TX-3 | Буфер для лизиса белка |
| Craced/Total Casspase-3 Набор для лизата целых клеток Meso | Scale Diagnostics | K15140D | Набор для обнаружения каспазы 3 |
| V-PLEX Vascular Injury Panel 2 Human Kit | Meso Scale Diagnostics | K15198D | |
| V-PLEX Провоспалительная панель человека II (4-плексная) | Мезомасштабная диагностика | K15053D | |
| Zeiss LSM 880 | Zeiss-Конфокальный микроскоп | ||
| Zeiss LD plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27 | Zeiss-20X | дальноснимаемые объективы | |
| Zeiss AXIOvert.A1 | Zeiss-Brightfield микроскоп | ||
| Zeiss LD A-Plan 10X/0.25 Ph1 | Объективы Zeiss-10X |
Ссылки
- Fritz, A., et al. Expression of clinically relevant drug-metabolizing enzymes along the human intestine and their correlation to drug transporters and nuclear receptors: An intra-subject analysis. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 124 (3), 245-255 (2019).
- Okumura, R., Takeda, K.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
